JPH06199685A - フイブリン密封組成物とその使用方法 - Google Patents

フイブリン密封組成物とその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ウイルス等の汚染がなく安全なフイブリン密
封剤を提供する。 【構成】 全血、特に自系の全血より得たフイブリノゲ
ンを、固定化したトロンビン様酵素の作用で得たフイブ
リンＩモノマー又は非架橋フイブリンを含む密封剤。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はフイブリン密封剤に関す
る。特に本発明はフイブリンモノマーを含有する組成物
又は非架橋フイブリンを含有する組成物がフイブリン密
封剤の構成成分となっているフイブリン密封剤及びその
使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】哺乳動物の止血、即ち血液の損失を防ぐ
一つの機構は血塊の形成である。ヒトの場合の血塊の形
成、即ち血液の凝固は、フイブリノゲンがトロンビンに
よってモノマーに変換し、カルシウムイオン、及び活性
第ＸＩＩＩ因子によって最終的には架橋したフイブリン
ＩＩポリマー即ちフイブリン塊になる複雑な反応過程に
よって生じる。
【０００３】架橋したフイブリンＩＩポリマーの形成
は、フイブリノゲンがトロンビンによってフイブリンＩ
モノマーに変換しこれが自発的に重合してフイブリンＩ
ポリマーになることにより進行する。フイブリンＩポリ
マーは適宜な化学的手段で再びフイブリンＩモノマーに
再変換することが出来るので可溶性フイブリンＩとも呼
ばれる。フイブリンＩポリマーはそれからトロンビンに
よってフイブリンＩＩポリマーに変換され、これは適宜
な化学的手段でフイブリンＩＩポリマーをフイブリンＩ
Ｉモノマーに変換出来るので可溶性フイブリンＩＩとも
呼ばれる。活性化された第ＸＩＩＩ因子として知られる
第ＸＩＩＩの因子の作用によってフイブリンＩＩポリマ
ーは架橋して架橋フイブリンＩＩとなりこのものがフイ
ブリン塊である。第ＸＩＩＩ因子はカルシウムイオンの
存在下トロンビンによって活性化される。架橋したフイ
ブリンＩＩはフイブリンＩＩモノマーにはなり得ないの
でときには不溶性フイブリンＩＩとも呼ばれる。
【０００４】トロンビンはプロトロンビンより生成する
ことに留意するべきである。プロトロンビンはカルシウ
ムと他の補助物質の存在下第Ｘａ因子によってトロンビ
ンに変換する。
【０００５】フイブリノゲンは血漿タンパク１リットル
につき２〜４ｇ存在する。フイブリノゲンはモノマーで
あり、（Ａα）２、（Ｂβ）２、γ２で表される３つの
ジスルフイド対を形成したポリペプチド鎖によって構成
されている。“Ａ”及び“Ｂ”はそれぞれフイブリノペ
プチドＡ、フイブリノペプチドＢとして知られている２
つの小さな、アミノ末端をもつペプチドである。トロン
ビンによるフイブリノゲンの分解の過程では、フイブリ
ノゲンよりフイブリノペプチドＡが分離してフイブリン
Ｉ化合物となり、続いてフイブリノペプチドＢが分離し
てフイブリンＩＩ化合物となる。このようにフイブリノ
ペプチドＡ及びＢの分離によってフイブリノゲンの分子
量は激減し、３４０，０００ダルトンが約６，０００ダ
ルトンになるが重合部位は露出している。血液凝固の機
構及びフイブリノゲンの構造については、Ｃ．Ｍ．ジャ
クソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，４９：７６５−８１１（１９８０）、及び
Ｂ．フリエ（Ｆｕｒｉｅ）及びＢ．Ｃ．フリエ（Ｆｕｒ
ｉｅ）、Ｃｅｌｌ、５３：５０５−５１８（１９８８）
を参照されたい。
【０００６】フイブリン密封剤は生化学的な接着剤であ
り、その作用は血液凝固の最終の工程、その段階でフイ
ブリン塊が生成する、を模したものである。通常のフイ
ブリン密封剤は、濃縮されたヒトフイブリノゲン、ウシ
アプロチニン及び第ＸＩＩＩ因子を第１の成分とし、ウ
シトロンビン及び塩化カルシウムを第２の成分とするこ
とにより構成されている。通常２重筒の注射器を使用
し、フイブリン塊を形成させたい部位に両成分を同時に
投与する方法によって使用される。アプロチニンはフイ
ブリン分解阻害剤であり、フイブリン密封剤の安定性を
増進させるために加えられる。
【０００７】フイブリン密封剤のフイブリノゲン成分は
プールされたヒト血漿から調製される。フイブリノゲン
はヒト血漿から冷却沈澱法やいろいろの試薬、即ちポリ
エチレングリコール、エーテル、エタノール、硫酸アン
モニウム、又はグリシンを使用して沈澱させることによ
り濃縮される。フイブリン密封剤についてのすぐれた概
説としてＭ．ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、Ｂｌｏｏｄ
Ｒｅｖｉｅｗｓ，５：２４０−２４４（１９９１）；
Ｊ．Ｗ．ギブル（Ｇｉｂｂｌｅ）及びＰ．Ｍ．ネス（Ｎ
ｅｓｓ）、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３０：７４１−７
４７（１９９０）；Ｈ．マトラス（Ｍａｔｒａｓ），
Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．，４
３：６０５−６１１（１９８５）、及びＲ．レルネル
（Ｌｅｒｎｅｒ），及びＮ．ビヌル（Ｂｉｎｕｒ），
Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８：１６
５−１８１（１９９０）を参照されたい。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】最近自系のフイブリン
を使用したフイブリン密封剤の調製について関心が持た
れている。自系のフイブリン密封剤とはフイブリン密封
剤のフイブリノゲン成分が患者自身の血液から抽出され
たものであるフイブリン密封剤である。自系のフイブリ
ン密封剤の使用は、プールされたヒト血漿から抽出され
たフイブリノゲン成分中に存在するかも知れない病原菌
による疾病、即ちＢ型肝炎、非Ａ、非Ｂ型肝炎及び後天
性免疫不全症候群（エイズ）のような輸血によって感染
する疾病の危険を回避出来ることから好ましいことであ
る。Ｌ．Ｅ．シルバーステイン（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉ
ｎ）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２８：３１９−３２
１（１９８８）；Ｋ．レイタカリ（Ｌａｉｔａｋａｒ
ｉ）及びＪ．ルオトネン（Ｌｕｏｔｏｎｅｎ）、Ｌａｒ
ｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，９９：９７４−９７６（１９８
９），及びＡ．ドレスデール（Ｄｒｅｓｄａｌｅ）ら、
Ｔｈｅ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕ
ｒｇｅｒｙ、４０：３８５−３８７（１９８５）を参
照。
【０００９】ある種の疾病はフイブリノゲンを使用した
フイブリン密封剤のみならずウシアプロチニン及びウシ
トロンビンを使用した密封剤によっても感染する。ウシ
トロンビンはウシ海綿状脳炎、及び他のウイルス性病原
を哺乳動物に感染することが知られている。更にウシト
ロンビンはヒトに対して免疫反応を起こす原因となる強
力な抗原でもある。このようにウシトロンビンの使用
は、ウシトロンビンを投与されたものにとってその危険
を蒙る結果となる。Ｄ．Ｍ．テーラー（Ｔａｙｌｏ
ｒ），Ｊ．Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１
８（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ）：１４１−１４６（１
９９１），Ｓ．Ｂ．プルシネル（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ）
ら、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ，８１ Ｎｏ．２：８５−
９６（１９９１），及びＤ．マッテウス（Ｍａｔｔｈｅ
ｗｓ），Ｊ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｈｅａｌｔｈ，３−５
（２月，１９９１）を参照。
【００１０】したがってウイルス汚染の危険のない、即
ち副作用の危険のないフイブリン密封剤を患者に供給す
る必要があるのである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）所望の
部位をフイブリンモノマーを含有する組成物と接触さ
せ；そして（ｂ）該接触段階で接触すると同時に該フイ
ブリンモノマーがフイブリンポリマーに変換し、それに
よってフイブリン塊を形成することを特徴とするフイブ
リン密封剤とその使用法に関する。
【００１２】本発明は又そのような組成物を調製する方
法及びフイブリンモノマーを含有する組成物及びキット
を提供する。
【００１３】本発明の他の観点は、（ａ）所望の部位を
非架橋フイブリンを含有する組成物と接触させ；そして
（ｂ）接触と同時に非架橋フイブリンを架橋フイブリン
に変換し、フイブリン塊を形成することを特徴とするフ
イブリン密封剤とその使用法に関する。
【００１４】本発明の主題は又そのような組成物を調製
する方法及びそのような非架橋フイブリンを含有する組
成物、及びキットを提供する。
【００１５】本発明の目的のために以下の定義が使用さ
れている： フイブリン───いかなる型式のフイブリンをも意味す
る。これに限定するものではないがフイブリンの例とし
ては、フイブリンＩ、フイブリンＩＩ、及びデスＢＢフ
イブリンを包含する。フイブリンはモノマー又はポリマ
ーとして存在し、ポリマーは非架橋か架橋のいずれかで
ある。
【００１６】フイブリンモノマー───フイブリンモノ
マーはいかなるフイブリンの型式をも包含する、即ち、
フイブリンＩ、フイブリンＩＩ、又はデスＢＢフイブリ
ンであり、そのなかでフイブリンはモノマー型か又はオ
リゴマー型であり、それらはフイブリンモノマーを含有
する組成中で可溶化されるものであり、又フイブリンモ
ノマーはフイブリンポリマーに変換することが出来るも
のである。
【００１７】フイブリンポリマー───フイブリンポリ
マーはいかなる型式のフイブリンをも包含する、即ちフ
イブリンＩ、フイブリンＩＩ又はデスＢＢフイブリンで
あってもよく、該フイブリンはポリマーであって非架
橋、架橋のいずれであってもよい。
【００１８】非架橋フイブリン───非架橋フイブリン
はいかなる型式のフイブリンをも包含する、即ちフイブ
リンＩ、フイブリンＩＩ又はデスＢＢフイブリンであ
り、フイブリンは非架橋であり、架橋フイプリンに変換
することが出来る。非架橋フイブリンはフイブリンモノ
マーであってもよいし、又非架橋フイブリンポリマーで
あってもよい。
【００１９】架橋フイブリン───架橋フイブリンはい
かなる型式のフイブリンをも包含する、即ちフイブリン
Ｉ、フイブリンＩＩ又はデスＢＢフイブリンであっても
よく、そのなかでフイブリンはフイブリンポリマーであ
り、架橋している。
【００２０】本発明は、（ａ）所望の部位をフイブリン
モノマーを含有する組成物と接触させ；そして（ｂ）接
触と同時に該フイブリンモノマーをフイブリンポリマー
に変換し、それによってフイブリン塊を形成することを
特徴とするフイブリン密封剤及びその使用法に関する。
【００２１】本発明は又そのような組成物の調製法、及
びフイブリンモノマーを含有する組成及びキットを提供
する。
【００２２】本発明の他の観点は、（ａ）所望の部位を
非架橋フイブリンを含有する組成物と接触させ；そして
（ｂ）接触と同時に非架橋フイブリンを架橋フイブリン
に変換し、それによってフイブリン塊を形成することを
包含するフイブリン密封剤及びその使用法に関する。
【００２３】本発明は又、そのような組成物の調製法及
びそのような非架橋フイブリンを含有する組成及びキッ
トをも提供する。
【００２４】本発明のフイブリンモノマーを含有するフ
イブリン組成物は、フイブリンポリマーに変換すること
のできるいかなるフイブリンモノマーの型をも包含する
組成物である。フイブリンモノマーの限定的でない例と
しては、フイブリンＩモノマー、フイブリンＩＩモノマ
ー或いはデスＢＢフイブリンモノマーであり、好適には
フイブリンＩモノマーである。勿論フイブリンモノマー
の混合物であってもよい。本発明の目的として、フイブ
リンポリマーはフイブリンモノマーの重合によって生じ
る如何なるポリマーをも包含する。例えばフイブリンＩ
モノマーのフイブリンポリマーへの変換は、変換工程の
行われ方によって、架橋又は非架橋のフイブリンＩポリ
マー、及び／又は、架橋又は非架橋のフイブリンＩＩポ
リマーが生成する。
【００２５】フイブリンＩモノマーはフイブリノゲンと
は対照的にトロンビン又は第ＸＩＩ１因子を使用するこ
となく容易にフイブリンポリマーに変換されるので好適
である。事実フイブリンＩモノマーは自発的にフイブリ
ンＩポリマーを形成し、フイブリンＩポリマーが架橋体
であるか、非架橋体であるか又更に変換してフイブリン
ＩＩポリマーになっているかどうかに拘りなくフイブリ
ン塊として作用することが出来る。このようにフイブリ
ンＩモノマーよりフイブリンＩポリマーの形成が自発的
であるのでフイブリンＩポリマーはトロンビン及び第Ｘ
ＩＩＩ因子なくして形成されるのでウシトロンビンに関
連した問題は回避出来る。（もしフイブリンＩモノマー
が患者の血液と接触するように使用された場合、例えば
傷口で接触した場合、患者のトロンヒン及び第ＸＩＩＩ
因子がフイブリンＩポリマーを架橋フイブリンＩＩポリ
マーに変換するであろうことに留意すべきである）。
【００２６】非架橋フイブリンを含む組成物はいかなる
型の非架橋フイブリンを含む組成物であってもよい。非
架橋フイブリンの限定的でない例は、非架橋フイブリン
Ｉ、非架橋フイブリンＩＩ、及びデスＢＢフイブリンで
あり、非架橋フイブリンＩが好ましい。勿論非架橋フイ
ブリンの混合物も包含される。本発明の“架橋フイブリ
ン”は非架橋フイブリンから架橋フイブリンに変換する
ことによるいかなる型のフイブリンをも包含する。例え
ば非架橋フイブリンＩより架橋フイブリンへの変換の結
果生成した架橋フイブリンは、架橋フイブリンＩ及び／
又は架橋フイブリンＩＩであり、これは変換の工程如何
に依存している。
【００２７】フイブリノゲンと比較してより容易に架橋
フイブリンに変換出来ることにより非架橋フイブリンＩ
が好適である。事実フイブリンＩは架橋フイブリンＩを
生成すると信じられており、この架橋フイブリンＩがフ
イブリン密封剤として作用する。このように非架橋フイ
ブリンＩから架橋フイブリンＩの生成はトロンビンなし
で進行し、このことにより、活性第ＸＩＩＩ因子は必要
ではあるがウシトロンビンに関連した問題は回避でき
る。（もし、非架橋フイブリンＩが患者の血液と接触す
るように使用された場合、例えば傷口で接触した場合、
患者のトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子がフイブリンＩを
架橋フイブリンＩＩに変換するであろうことに留意すべ
きである）。
【００２８】オリゴマー又はモノマー、即ちフイブリン
モノマーは好適ではあるが非架橋フイブリンも又ポリマ
ー、オリゴマー或いはモノマーであってもよい。これは
重合体になった非架橋フイブリンは通常ゲル状となり、
そのために所望の部位に分配することが困難となり、所
望の部位の細胞と殆ど接触出来ない状態になるからであ
る。これに反して得られたオリゴマー或いはモノマーで
ある非架橋フイブリンは可溶体であり、それ故より容易
に所望の部位に分配され、細胞とうまく接触する。勿論
組成物は非架橋フイブリンのそのような型の混合物を含
有するものであってもよい。
【００２９】フイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
を含有する組成物の供給源は、フイブリンモノマーがフ
イブリンポリマーに変換出来るもの、或いは非架橋フイ
ブリンが架橋フイブリンに変換出来るものであれば周知
のものであってもよいし又開発されるべきものであって
もよい。これによって制限するものではないが、フイブ
リンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物の供給
源の例としては、血液、好ましくは哺乳動物の血液、更
に好ましくはヒト血液であり又フイブリノゲンを分泌す
る細胞培養、組換えフイブリンであり、中でも血液が好
適である。血液はいかなる型のものであってもよく、例
えば全血であってもよいし又は調製されたフイブリノゲ
ン製品であってもよい。又血液は自系のフイブリン密封
剤の調製にも使用することが出来る。
【００３０】以下に記載したフイブリンＩモノマーか又
はフイブリンＩポリマーのいずれかである全血から調製
した非架橋フイブリンＩを含有する組成物は、トロンビ
ンや第ＸＩＩＩ因子やその他の血液を凝固させるに必要
な物質を添加することなく架橋フイブリンＩＩに変換す
ることが出来ることが観察された。これは全血から調製
された非架橋フイブリンＩを含む組成物は外部からトロ
ンビンや第ＸＩＩＩ因子を添加しなくても非架橋フイブ
リンＩを架橋フイブリンＩＩに変換させるに十分な量の
プロトロンビン、第ＸＩＩＩ因子及びその他の必要な物
質を保持しているという事実によるものであると信じら
れる。この内在しているプロトロンビン及び第ＸＩＩＩ
因子は本発明のフイブリン密封剤中にフイブリンモノマ
ー又は非架橋フイブリンを含有する組成物の成分として
使用することが出来る。
【００３１】しかしながらこの内在しているトロンビン
と第ＸＩＩＩ因子は、フイブリン密封剤にとって好まし
い反応速度でフイブリノゲンを架橋フイブリンＩＩに変
換するに十分な量ではないことに留意すべきである。当
量反応で非架橋フイブリンＩを架橋フイブリンＩＩに変
換する場合よりもフイブリノゲンを架橋フイブリンＩＩ
に変換する場合の方がより多くのトロンビンが必要であ
ると考えられる。
【００３２】３つのそれぞれの供給源は、フイブリンモ
ノマー又は非架橋フイブリンに変換されるフイブリノゲ
ンを含んでいる。この変換工程に加えて、フイブリンモ
ノマー又は非架橋フイブリンを含む得られた組成物は濃
縮された状態になっていなければならない。フイブリン
モノマーの濃度が１０ｍｇ／ｍｌよりも少なくないこと
が好ましく、更に好ましくは濃度が２０ｍｇ／ｍｌ〜２
００ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ
〜５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３３】これに加えてフイブリンモノマー又は非架
橋フイブリンが非動的であることが好ましい。本発明の
目的である非架橋フイブリンを含有する非動的組成物と
は、組成物中の非架橋フイブリンがその組成物が調製さ
れてから少なくとも１．５分間、好ましくは３分間、最
も好ましくは少なくとも３０分間架橋されないことを意
味する。本発明の目的であるフイブリンモノマーを含む
非動的組成物とは、組成物中のフイブリンモノマーが、
その組成物が調製されてから１．５分間、好ましくは３
分間、最も好ましくは少なくとも３０分間重合しないこ
とを意味する。事実フイブリンモノマーを含む組成は調
製後少なくとも数日即ち約７２時間非動的であることに
注目すべきである。
【００３４】フイブリンモノマー或いは非架橋フイブリ
ンを含む組成物は血液より調製することが出来る。この
方法は非架橋フイブリン型である水素結合したフイブリ
ンポリマーを生成する。このポリマーはフイブリン密封
剤の成分として使用出来るか又は可溶化と称される工程
によってフイブリンモノマーに変換することが出来、い
ずれも以下に述べられている。フイブリンモノマー又は
非架橋フイブリンは滅菌環境で調製されることが好まし
い。
【００３５】フイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
を含む組成物は献血者より提供される血液の全血より調
製することが出来、好ましくは抗凝血剤の存在下調製す
る。いかなる凝血剤も使用可能である。これによって制
限されるものでない凝血剤の例としては、ヘパリン、Ｅ
ＤＴＡ、ヒルジン、クエン酸又は、直接的であれ、間接
的であれトロンビンの生成を阻害するその他の試薬であ
って、なかでもクエン酸が好適である。
【００３６】フイブリノゲンを含む血漿は、全血から分
離される。いかなる分離技術も使用出来る。例えば沈降
法、遠心分離法、或いは濾過法である。遠心分離法は
３，０００ｇで約１０分で行うことが出来る。しかし、
多血小板血漿を得たいのであれば遠心分離はより低い
ｇ．力例えば５００ｇ．で２０分行うのがよい。血漿を
含む上澄液は慣用の技術で分離することが出来る。
【００３７】濾過は全血を、血液細胞が血漿から分離出
来る適宜なフィルターを通過させることによって行うこ
とが出来る。フィルターはプロテインを良好に通過させ
るミクロポーラスな膜が好ましい。
【００３８】得られた血漿はフイブリノゲンをフイブリ
ンモノマー又は非架橋フイブリンに変換する処理を行
う。この変換は周知の技術又は開発されるべき技術によ
って行うことが出来る。
【００３９】フイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
の調製は、トロンビンを包含したトロンビン様酵素を使
用することによって行う。トロンビン様酵素とはフイブ
リノゲンよりフイブリンを形成することに触媒できる酵
素である。トロンビン様酵素の通常の供給源はヘビ毒で
ある。好ましくはトロンビン様酵素はヘビ毒より精製す
る。トロンビン様酵素の選択によってフイブリノペプチ
ドＡを切断───フイブリンＩを生成、フイブリノペプ
チドＢを切断───デスＢＢフイブリンを生成、フイブ
リノペプチドＡ及びＢを切断───フイブリンＩＩを生
成することが出来る。フイブリノペプチドＡとＢを切り
離すトロンビン様酵素は異なった速度で切り離すであろ
うことに留意すべきである。そのために生成する組成物
は例えばフイブリンＩＩとフイブリンＩの混合物、或い
はフイブリンＩＩとデスＢＢフイブリンの混合物が得ら
れる可能性がある。
【００４０】表Ｉは本発明に使用出来るヘビ毒に由来す
る制限的でない例のリストであり、トロンビン様酵素の
名称、酵素によって切り離されるフイブリノペプチドが
記されている。ヘビ毒由来の酵素の考察には、Ｈ．パー
クル（Ｐｉｒｋｌｅ）及びＫ．ストッカー（Ｓｔｏｃｋ
ｅｒ）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ，６５（４）：４４４−４５０（１９９１）
を参照されたい。
【００４１】
【表１】
【００４２】好ましいトロンビン様酵素はバトロキソビ
ン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）であり、特にＢ．ムウエニ
イ（Ｍｏｏｊｅｎｉ）、Ｂ．マランハオ（Ｍａｒａｎｈ
ａｏ）及びＢ．アトロクス（ａｔｒｏｘ）及びアンクロ
ド（Ａｎｃｒｏｄ）であり、特にＡ．ロドストマ（ｒｈ
ｏｄｏｓｔｏｍａ）由来のものである。
【００４３】フイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
は血漿をトロンビン様酵素と接触させ、そこで血漿中の
フイブリノゲンをフイブリンモノマーに変換させること
によって得ることが出来る。しかし生成したフイブリン
モノマーは自発的に重合してゲルを形成し、溶液である
血清より分離する。そのゲルは非架橋フイブリンを含有
する組成である。
【００４４】この非架橋フイブリンゲルは例えば遠心分
離（３，０００ｇ．，１０分）、血清から非架橋フイブ
リンの直接手法による分離、そのまま又は加圧による濾
過、続いて遊離した血清を除くことによって収得するこ
とが出来る。（例えば、１−１００ミクロンのポアサイ
ズのフィルターが使用できる、Ｐｏｒｅｘ社製の融結ポ
リプロピレン２０ミクロンポアサイズのフィルター、Ｆ
ｌｕｏｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ社製のテフロン製２０
−７０ミクロンポアサイズのフィルター又はＣｏｓｔａ
ｒ社製のナイロン６６製２２−４６ミクロンポアフィル
ターが使用出来る）。
【００４５】この収得法によって溶液である血清より非
架橋フイブリンゲルを分離し、これによって血漿と対応
している非架橋フイブリンゲルを濃縮する。その非架橋
フイブリンゲルは、外部からトロンビン又は第ＸＩＩＩ
因子を添加しなくても非架橋フイブリンが架橋フイブリ
ンに変換することが出来る少なくともある程度のプロト
ロンビン、第ＸＩＩＩ因子、及び血漿から得られる他の
必要な物質を含有していることを理解すべきである。こ
の内因性プロトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子は本発明の
フイブリン密封剤中でフイブリンモノマー又は非架橋フ
イブリンを含む組成物の成分として使用することが出来
る。
【００４６】調製時の遠心分離の速度、又は濾過の圧力
は非架橋フイブリンゲルからどの程度血清を除去するか
によって定められる、即ち遠心力が大きい程、又は濾過
の圧力が大きければ大きい程非架橋フイブリンゲルは濃
縮される。しかしそのような力又は圧力はトロンビン及
び第ＸＩＩＩ因子が非架橋フイブリンゲルより除去され
てしまう程強くないことが好ましい。
【００４７】非架橋フイブリンゲルはここに非架橋フイ
ブリンを含む組成として非架橋フイブリンを含有する組
成物であるフイブリン密封剤の成分として使用するよう
に準備されたことになる。もしこのような組成物が全血
より調製されると６０−９０％の全血中に存在したフイ
ブリノゲンがその組成物中に存在することになる、勿論
それは非架橋フイブリンとしてである。
【００４８】非架橋フイブリンを含んだ組成物は調製さ
れればすぐ使用可能である。事実その成分が自系である
場合は調製後直ちに使用する方が特に好ましい。もしそ
の組成物が調整後すぐに使用されない場合はその組成物
は貯蔵することも出来る。その組成物の保存は例えば凍
結、又は凍結乾燥するか又は４℃で保存することが必要
である。凍結又は凍結乾燥した場合は数カ月間安定であ
る。４℃で保存した場合は数日間安定であると考えられ
ている。
【００４９】もし組成物を凍結した場合、使用に際して
は解凍しなければならない。
【００５０】非架橋フイブリンゲルを形成することとな
るこの技術は、フイブリノゲンを非架橋フイブリンゲル
に変換し、そのゲルを基本的には１段階で濃縮する。他
の方法として、あまり好ましくはないが、慣用の技術、
例えばポリエチレングリコール、エーテル、エタノー
ル、硫酸アンモニウム、又はグリシンのような種々の試
薬を用いての結晶沈澱及び沈澱法によって濃縮すること
が出来る。濃縮されたフイブリノゲンは上記の技術によ
り非架橋フイブリンゲルに変換することが出来る。好ま
しくは、フイブリノゲンはすでに濃縮されているので最
初に非架橋フイブリンゲルを形成させることなくフイブ
リンモノマーを含む組成物に変換することが出来る。濃
縮されたフイブリノゲンをカオトロピズム剤と接触させ
てフイブリノゲン溶液にすることが出来る。
【００５１】カオトロピズム剤は、フイブリノゲンをト
ロンビン様酵素と接触することによって生じるフイブリ
ンモノマーが自発的に重合することを阻害する。カオト
ロピズム剤はフイブリノゲン組成と混合し、１〜２分振
盪してフイブリノゲン溶液とする。フイブリノゲンは上
記のようなトロンビン様酵素又は以下に記す支持体に固
定したトロンビン様酵素を用いてフイブリンモノマーに
変換する。
【００５２】適宜なカオトロピズム剤は、尿素、臭化ナ
トリウム、グアニジン塩酸塩、ＫＣＮＳ、沃化カリ及び
臭化カリを包含する。カオトロピズム剤の好ましい濃度
は０．２〜６．０モル濃度であり、最も好ましくは０．
３〜２．０モル濃度である。フイブリンモノマーが自発
的に重合しないように出来るだけ少量のカオトロピズム
剤の使用が好ましい。
【００５３】以下に示すようにフイブリンモノマーをフ
イブリンポリマーに変換することが望ましいときに至る
までカルシウムイオンを加えない方が得策であることに
留意すべきである。このことはフイブリンモノマーが内
因的血液凝固要素の活性化によって架橋することのない
ようにすることである。
【００５４】好ましい実施態様としては、トロンビン様
酵素を支持体に固定することである。そのような態様は
固定した酵素を血漿から容易に分離することが出来、こ
のことにより酵素による汚染がないよう非架橋フイブリ
ンを含む組成を保護することが出来るので好適である。
【００５５】本発明に於いては、支持体は、トロンビン
様酵素が捕捉出来るものであればいずれでも有用であ
る。制限的でない、好ましい支持体の例としては、セル
ローズ、ポリデキストラン、アガロース、ポリスチレ
ン、シリカ、ポリアクリル酸、ポリビニールアルコー
ル、ガラスビーズ及びポリテトラフルオロエチレンであ
り、シリカ及びアガロースが好ましく、最も好ましくは
アガロースである。
【００５６】他の好適な実施態様に於いては、トロンビ
ン様酵素はフィルター又はフィルターの片面である支持
体に固定されており、そして例えばビーズのような他の
支持体に付着しているものである。さもなければトロン
ビン様酵素はフィルターを通過することになる。このよ
うにフィルターのポアサイズは、固定化したトロンビン
様酵素はフィルターを通過出来ないが非架橋フイブリン
はフィルターを通過することが出来る、そのようなもの
でなければならない。非架橋フイブリンは血漿をフィル
ターの片面に固定したトロンビン様酵素に接触し、フイ
ブリンモノマーを形成し、血漿の残部とともにフィルタ
ーを通過する。このようにして得られた非架橋フイブリ
ンを含む組成物はトロンビン様酵素から分離することが
必要である。そのフイブリンモノマーはフィルターを通
過ののち自発的に重合して非架橋フイブリンポリマーと
なる。
【００５７】トロンビン様酵素を支持体に固定するため
に、支持体は活性化されなければならない。このことは
適宜な技術で実施することが出来る。例えば支持体を誘
導体化するのに利用出来るいろいろな活性化化学は：ジ
アゾニウム基、イソシアネート基、酸クロリド基、酸無
水物基、スルホニルクロリド基、ジニトロフルオロフエ
ニル基、イソチオシアネート基、ヒドロキシ基、アミン
基、ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド基、トリアジン基、
ヒドラジノ基、カルボジイミド基、シラン基、及び臭化
シアンである。（ａ）ペンタフアルム（Ｐｅｎｔａｐｈ
ａｒｍ）の特許ドイツ特許第２４４０２５４Ａ１号；
（ｂ）Ｐ．Ｄ．Ｇ．ディーン（Ｄｅａｎ）、Ｗ．Ｓ．ジ
ョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）及びＦ．Ａ．ミドル（Ｍｉ
ｄｄｌｅ）（編者）（１９９１年）、ＩＲＬ出版社 オ
ックスフォード───アフィニティクロマトグラフ法─
──実際的使用───第２章───活性化法を参照、こ
れらは本明細書中参考文献として記載される。
【００５８】好ましい活性化化学はヒドラジド基の使用
である。ヒドラジド基で活性化された支持体の使用は、
基本的に酵素の漏出がなくその活性を維持したトロンビ
ン様酵素の最大限の率（少なくともＳ２２３８評価法─
─Ｇ．アクセルソン（Ａｘｅｌｓｓｏｎ）ら、Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，３６：５１７（１９７６）参
照───によって約３０％〜約５０％）でその活性を維
持した結果となっている。又低いｐＨ値、即ちｐＨ４−
６が酵素の分解を防ぐために酵素カップリングに利用出
来る。
【００５９】通常支持体は反応性の高い化合物で活性化
され、続いて配位子の活性基、即ち−ＯＨ、−ＮＨ２、
−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯと反応して共有結合を形
成する。本発明に使用される好ましい活性化化学は： （ａ）トリアジン基、好ましくはハロゲン化トリアジン
基による方法； （ｂ）トレシルクロリド基による方法； （ｃ）カルボニルジイミダゾール基による方法； （ｄ）シアノゲンブロミドによる方法；及び （ｅ）ヒドラジド又はアミノ基による方法である。
【００６０】（ａ）−（ｄ）に於いては、プロテインは
−ＮＨ２、−ＳＨ又は−ＯＨ基との反応を介して結合
し、一方（ｅ）に於いてはプロテインは酸化された水酸
化炭素基、即ち−ＣＨＯを介して結合する。これらの化
学の使用は、活性をもったトロンビン様酵素の最大限の
率（Ｓ２２３８評価法によって少なくとも約３０％〜約
５０％）で、酵素漏出なく維持する結果になっている。
【００６１】トリアジンによる活性化として２つの異な
った方法が使用された。まず最初の方法は、トリアジン
を直接表面の水酸基に結合させることである。これは表
面の２個の水酸基とＣＮＢｒとを反応させるときに用い
るＣＮＢｒ活性化法と良く似た方法である。トリアジン
の活性化としてアガロースのＯＨ基はトリアジン（シア
ヌル酸クロリド）と反応させた。
【００６２】
【化１】
【００６３】一般的には支持体は非常に活性の高い化合
物で活性化され、続いて配位子の官能基、即ち−ＯＨ、
−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＨＯと反応して共有結合を形成
する。残ったトロンビン様酵素のついていない活性基
は、基本的なことではないが、エタノールアミン、無水
酢酸又はグリシンのような活性のない化合物でブロック
することが出来る。
【００６４】本発明に於ける好ましい活性化学は： （ａ）シアノゲンブロミドで活性化し、続いてプロテイ
ン上の−ＮＨ２基を介して酵素と直接結合する。 （ｂ）支持体をモノクロロトリアジンで活性化し、続い
て−ＮＨ２、−ＯＨ、又は−ＳＨ基を介して酵素と結
合。 （ｃ）支持体をジクロロトリアジンで活性化し、続いて
−ＮＨ２、−ＯＨ、又は−ＳＨ基を介して酵素と結合。 （ｄ）支持体をトレシルクロリドで活性化し、続いて−
ＮＨ２、−ＯＨ、又は−ＳＨ基を介して酵素と結合。 （ｅ）支持体をアジピン酸ヒドラジド又はヒドラジンで
活性化し、続いて−ＣＨＯ基を介して酸化された酵素と
結合。 （ｆ）支持体をアミノ配位子で活性化し、続いて−ＣＨ
Ｏを介して酸化された酵素と結合する。
【００６５】上記のすべてについて好ましい支持体はア
ガロースであるがシリカを使用することもできる。この
支持体を使用する場合の好ましい活性化化学は： （ａ）γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン
で活性化し、プロテインの−ＮＨ２基を介してトロンビ
ン様酵素と直接結合する。 （ｂ）シアノゲンブロミドで活性化し、続いてプロテイ
ンの−ＮＨ２基を介して直接結合する。 （ｃ）γ−グリシドオキシトリメトキシシランで活性化
し、続いてエポキシド環を開裂してジオールとし、この
ジオールをシアノゲンブロミドで活性化する。プロテイ
ン上の−ＮＨ２基を介して酵素と直接結合。 （ｄ）γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン
で活性化し、続いてアンモニア溶液で処理してアミン−
シリカを生成させる。 このアミン−シリカ結合は続いてシアヌル酸クロリド
（トリアジン）で活性化され、そして−ＮＨ２、−ＯＨ
又は−ＳＨ基を介して酵素と結合する。
【００６６】酵素の活性化された支持体への結合は、効
率よくカップリングさせるために適宜なｐＨで緩衝しな
ければならない。通常、例えばγ−グリシドオキシプロ
ピルトリメトキシシランと臭化シアンがプロテインの活
性基とカップリングする標準の活性化技法では酵素の一
級又は二級アミンのｐＫａよりも１〜２単位高い所で緩
衝することが必要である。しかし活性剤としてのシアヌ
ル酸クロリドの使用はそれよりも低い所で行うことが出
来る（最適なカップリング反応のｐＨは４〜６であ
る）。バトロキソビンを不活性な支持体に結合する場合
のようなグリコプロテインと結合させる他の方法は水酸
化炭素を介する方法である。この方法は最初糖部分を酸
化して−ＣＨＯ基とし、続いて酸性ｐＨ領域でヒドラジ
ドのようなアミノ基と結合することを特徴とする。広い
範囲のカップリング反応緩衝液を使用することが出来
る。例えば表２を参照。
【００６７】
【表２】
【００６８】活性化のあと、支持体は酵素結合に必要な
数以上の活性部位が存在することになる。これらの過剰
な部位をもし不活性化しなければ不必要なプロテインが
共有結合することになり、これは固定化された酵素の生
物学的な機能に影響を及ぼすことになる。
【００６９】過剰の活性基はエタノールアミンのような
小さい、障害にならないアミンで共有結合することによ
って不活性化することが出来る。
【００７０】もしヒドラジド又はアミノ基で活性化した
支持体が使用される場合、酵素との結合後の残余の活性
基は無水酢酸で不活性化出来る。
【００７１】固定化の方法や支持体によって固定工程中
に酵素の不活性化が起こる。シリカ支持体に最も望まし
い活性化剤（即ち臭化シアン）を用いると８０〜９０％
以上の酵素の活性が失われる。しかしアガロースを支持
体として使用し、塩化シアンで活性化した場合、酵素活
性の損失はより少なくなる。
【００７２】支持体上の固定された酵素の作用を評価す
るために２つの方法が支持体上に固定した活性酵素の量
を評定するのに使用することが出来る；凝固時間による
評定───Ａ．クラウス（Ｃｌａｕｓ），Ａｃｔａ Ｈ
ａｅｍａｔｏｌ，，１７：２３７（１９５７）及びＳ２
２３８による評価───Ｇ．アクセルソン（Ａｘｅｌｓ
ｓｏｎ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，３６：
５１７（１９７６）参照。
【００７３】支持体からの酵素の浸出を評価するには以
下の方法が利用出来る。
【００７４】酵素の浸出は放射性元素でラベルしたトロ
ンビン様酵素、即ちＩ１２５バトロキソビンによって評
価することが出来る。しかし浸出評価をする前に結合し
ていない放射性物質を除く必要がある、これは支持体を
５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５ ５０ｍｌ、５０
ｍＭグリシン／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ３．０ １０
０ｍｌ、５０ｍＭ炭酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム
ｐＨ１０．０ １００ｍｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ７．０ １００ｍｌ、水
１００ｍｌ、及び５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化
ナトリウム ｐＨ７．０ １００ｍｌで順次洗滌するこ
とによって達成することが出来る。この洗滌工程の後は
洗滌溶液中には放射能標識化合物は認められず、最初支
持体に結合した放射能標識酵素の５０％以上が維持され
ている。
【００７５】（ａ）必要な酵素の量 ３０−５０ｍｌの血漿（全血６０−１００ｍｌより調
製）を処理するに必要な酵素の量は、１０−１５分混合
の後３０−２００単位である。
【００７６】もしアガロースが支持体マトリックスとし
て採用された場合は、バトロキソビンの３０−２００単
位で７−２０分で非架橋フイブリンを形成する結果とな
る。このシステムはヒドラジド活性化法を用い、０．２
５ｇ−１．０ｇの乾燥アガロースを使用する。この場合
残余の活性基をブロックする必要はない。
【００７７】（ｂ）固定化した酵素と血漿フイブリノゲ
ンとの反応 通常固定された酵素と血漿中のフイブリノゲンとの反応
は以下のようにして実施される：３０−７０ｍｌの血漿
を、固定したトロンビン様酵素を保持した既知の量の乾
燥した支持体に加える。懸濁液は穏やかに（スパイラル
ミキサーで回転するか、又は手動で混合）７−２０分混
合する。この操作の間血漿中のフイブリノゲンは固定酵
素によって分解し、フイブリノペプチドＡ及び／又はフ
イブリノペプチドＢを放出し、水素結合したフイブリン
Ｉポリマー、水素結合したデスＢＢフイブリンポリマー
又は水素結合したフイブリンＩＩポリマーを生成し、そ
れぞれのポリマーはそこで固定酵素と会合する。
【００７８】前述したように、水素結合したフイブリン
ポリマーはゲル状であり、例えば遠心分離（３，０００
ｇ．，１０分）又は濾過（１−５０ミクロンの膜フィル
ター使用）によって収得される。このようにして収得し
たものは、血漿中から水素結合したフイブリンポリマー
を分離することによってそのポリマーを濃縮する。
【００７９】トロンビン様酵素を血漿中で使用すると第
ＸＩＩＩ因子を活性化することになり、そこでトロンビ
ン様酵素を使用する際、非架橋フイブリン、即ち非架橋
フイブリンＩ又はＩＩが架橋したフイブリン即ち架橋フ
イブリンＩ又はＩＩに転換することを防止するために血
漿組成物を修飾することが好ましいことに留意すべきで
ある。勿論フイブリノゲンが非架橋フイブリンに変換し
た直後フイブリン密封剤として使用する場合は、血漿組
成物は必ずしも修飾する必要はない。
【００８０】血漿組成物は周知の又は開発されている技
術で、非架橋フイブリンの架橋の生成を防ぐために修飾
することが出来る。これはヒルジン又はトロンビン阻害
剤のような第ＸＩＩＩ因子を活性化出来る内在のトロン
ビンをブロックすることによって、即ち重金属（Ｈ
ｇ）、チオメルサール又は阻害抗体を使用することによ
って活性化した第ＸＩＩＩ因子の作用を阻害することに
よって行うことが出来る。
【００８１】フイブリンＩ又はＩＩの架橋結合反応には
カルシウムイオンの存在が必要である。もしカルシウム
イオンが血漿組成から除去されるとフイブリンＩ又はＩ
Ｉの架橋は阻害される。カール（Ｃａｒｒ）ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，，２３９：５１３（１９８６）；カミン
スキー（Ｋａｍｉｎｓｋｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５８：１０５３（１９８３）およびカネイド
（Ｋａｎａｉｄｅ）ら、１３：２２９（１９８２）参
照。フイブリンＩ又はＩＩの架橋反応を阻止するために
カルシウムキレート剤を加えることが出来る。そのよう
なキレート剤はカルシウムと結合し、それによって架橋
を阻害する。どのようなカルシウムキレート剤でも使用
出来る。カルシウムキレート剤の非限定的例としては、
クエン酸、糖酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチレ
ンジアミントリ酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン
ジ〔ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸〕（ＥＤＤＨＡ）、エ
チレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）テ
トラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタン
酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサンテ
トラ酢酸（ＤＣＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチル
グリシン、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン、４
−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びＮ−ヒドロキシエチルイ
ミノジ酢酸（ＨＩＭＤＡ）及びそれらの塩であり、クエ
ン酸の塩が好ましい。
【００８２】本発明に於いては、フイブリノゲンを分泌
する細胞培養であればいかなるものも使用することが出
来る。細胞培養中のフイブリノゲンは、血漿について述
べた上記の技術と同様な技術によってフイブリンモノマ
ー又は非架橋フイブリンに変換することが出来る。しか
しながらそのような変換の前に細胞の残骸を除去するこ
とが好ましい。
【００８３】その工程は以下のようにして実施すること
が出来る：ＨＥＰＧ２細胞を生育させ、哺乳動物の細胞
培養についての標準テキストに記載されているようにし
て維持する。ルウ（Ｌｉｕ）ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ５：１２９−１３９（１９９１）参照。１０
％のウシ血清を含有し、５％ＣＯ２で緩衝した最少基本
培地に分裂速度が１：４〜１：８の間になるように細胞
をフラスコに播く。
【００８４】３７℃で２４〜３６時間生育させたのち培
地を除去し適宜なプロテアーゼ阻害剤及び２ＩＵ／ｍｌ
のヘパリンを含む血清を含まない培地に置き換える。培
地は更に２４時間単位で継続して３回血清を含まない培
地で交換する。
【００８５】調製した培地は細胞の残骸を除くために
３，０００ｇ．で１０分遠心分離を行い、フイブリノゲ
ンを含む上澄液をトロンビン様酵素と４〜５時間ゆっく
り混合する。トロンビン様酵素は固定されているのが好
ましい。アガロース−トロンビン様酵素の量は５００ｍ
ｌ培地中１．０ｍｌ〜５０ｍｌであるのが好適である。
上に記したようにアガロース以外の支持体も使用するこ
とが出来る。生成したフイブリンモノマーは自発的に重
合し固定支持体のまわりにからみつく。
【００８６】フイブリノゲンを含まない上澄液は、支持
体／フイブリンゲルより傾斜して分け、支持体／フイブ
リンゲルは最初設定した支持体の量１．０ｍｌにつきＮ
ａＣｌ（０．１５Ｍ）１０ｍｌ〜１００ｍｌで４回洗滌
する。洗滌したゲルはガラスロートを用いて減圧下半脱
水する。
【００８７】フイブリノゲンを分泌する細胞培地の使用
は、フイブリンモノマーを含む組成物を用いる場合特に
便宜である。それはフイブリンポリマーが最終的に架橋
するかどうかに拘らずそのような組成物がフイブリン密
封剤として有用となるフイブリンポリマーを形成するた
めに用いることが出来ると信じられているからである。
このようにそのような細胞培地が架橋するために必要欠
くべからざるものである第ＸＩＩＩ因子を含有しないの
でフイブリン密封剤を効果的にする外部の第ＸＩＩＩ因
子を加える必要がない。
【００８８】非架橋フイブリン組成は組み換えフイブリ
ノゲンからも調製することが出来る。極最近フイブリノ
ゲンは組み換えＤＮＡ技術で調製されるようになった。
Ｓ．ロイ（Ｒｏｙ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６６：４７５８−４７６３（１９９１）参照。
この内容は参考文献として本明細書中に引用されてい
る。ロイらはフイブリノゲンの三本の鎖を解明した最初
のグループであり、又ＣＯＳ細胞がトロンビンによって
誘導される塊を形成することが出来る形態で鎖を発現
し、会合しそして分泌することを述べている。生成した
フイブリノゲン組成物はフイブリノゲンを分泌する細胞
培養に関して上記で述べたと同じ技術でフイブリンモノ
マー又は非架橋フイブリンを含む組成物をつくるのに利
用出来る。しかしフイブリンモノマー或いは非架橋フイ
ブリンを含む組成物の形成前に、細胞培養に関して上記
に述べたと同じ方法で細胞残骸をとり除くことが望まし
い。細胞の残骸は遠心分離又は濾過で除くことが出来
る。
【００８９】組み換えフイブリノゲンの使用は、フイブ
リンモノマーを含む組成物を利用する場合は特に好適で
ある。これはフイブリンポリマーが最終的に架橋するか
どうかに拘らずそのような組成物がフイブリン密封剤と
して有用であるフイブリンポリマーの形成に利用するこ
とが出来ると考えられているからに外ならない。組み換
えフイブリノゲン細胞培養は架橋に必須である第ＸＩＩ
Ｉ因子を含まないのでフイブリン密封剤を効果的にする
外因性の第ＸＩＩＩ因子を加える必要がない。
【００９０】フイブリノゲンを、例えばトロンビン様酵
素による非架橋フイブリンへの変換はフイブリンが水素
結合したポリマー型のフイブリンを形成する。しかし上
で述べたように、非架橋フイブリンを含む組成物はフイ
ブリンモノマーを含むことが基本的ではあるがオリゴメ
リック又はモノメリックであることが好ましい。これは
非架橋フイブリンを含む組成を可溶化することによって
達成することが出来る。
【００９１】可溶化は支持体に固定されたトロンビン様
酵素によって非架橋フイブリンが生成するときには特に
好ましい。これは支持体上に固定されたトロンビン様酵
素を使用すると通常そのような酵素と会合する非架橋フ
イブリン水素結合ポリマーを生成することになるからで
ある。得られた組成物は支持体を含まないことが望まし
いので可溶化によって非架橋フイブリンを含む組成物よ
り酵素を固定した支持体を除くことが出来る。
【００９２】可溶化はフイブリンモノマーを生成する周
知の技術又は開発されるであろう技術によって行うこと
が出来る。可溶化は非架橋フイブリンを適宜な酸緩衝溶
液、好ましくはｐＨが５以下、好ましくは１〜５のｐＨ
をもつ酸緩衝液と接触することによって進めることが出
来る。これに限定するものではないが、酸緩衝剤の好ま
しい例としては、酢酸、コハク酸、グルクロン酸、シス
テン酸、クロトン酸、イタコン酸、グルタミン酸、ギ
酸、アスパラギン酸、アジビン酸及びそれらの塩であ
り、コハク酸、アスパラギン酸、アジビン酸及び酢酸の
塩が好ましく、最も好ましくは酢酸のナトリウム塩であ
る。今まで試験した酸緩衝剤よりももっと効果的に機能
する好適な酸緩衝剤が探索されている。
【００９３】酸緩衝液の好ましい濃度は、０．０２Ｍ〜
１Ｍであり、最も好ましくは０．１Ｍ〜０．３Ｍ濃度で
ある。そのような好ましい濃度は、その組成物のイオン
強度が生物学的に適合したものである。
【００９４】非架橋フイブリンをフイブリンモノマーを
含む水溶液にする場合、最少量の酸緩衝液を使用して可
溶化することが好ましい。それによってフイブリンモノ
マーが高濃度であるフイブリンモノマー水溶液が得られ
る。通常非架橋フイブリンを含む組成物の１ｍｌあたり
酸緩衝液１ｍｌ〜４ｍｌが必要である。
【００９５】酸緩衝液は非架橋フイブリンと混合し、１
分〜２分激しく振盪し完全な溶液とする。
【００９６】可溶化は中性ｐＨでカオトロピズム試薬を
使用する方法でも達成できる。好ましいカオトロピズム
剤は、尿素、臭化ナトリウム、グアニジン塩酸塩、ＫＣ
ＮＳ、沃化カリ、及び臭化カリウムを包含する。カオト
ロピズム剤の好ましい濃度は、０．２〜０．６モル濃度
であり、最も好適には３．５〜５．０モル濃度である。
【００９７】酸緩衝液の場合と同様非架橋フイブリンを
溶解する最少量のカオトロピズム試薬の使用が好まし
い。通常非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌあたりカ
オトロピズム剤１．０ｍｌ〜１．５ｍｌが必要である。
【００９８】カオトロピズム剤を非架橋フイブリン組成
物と混合し、１〜２分激しく振盪し完全に溶液とする。
【００９９】このような可溶化によりフイブリンモノマ
ーを含む組成物、特にフイブリンモノマーを含む水溶液
が得られる。水溶液中のフイブリンモノマーの濃度は１
０ｍｇ／ｍｌより少なくないことが好ましく、より好ま
しくは２０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであり、更に
好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、
最も好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであ
る。
【０１００】もし支持体に固定されたトロンビン様酵素
が使用され、非架橋フイブリンを含む組成物中に混在す
る場合、可溶化した後に固定酵素はフイブリンモノマー
を含む組成から除くことが出来る。この操作は例えば酵
素を分離出来る適宜なフィルターを用いる濾過法によっ
て行うことが出来る。適宜なフィルターとしては、Ｐｏ
ｒｅｘ社製の融着したポリプロピレン２０ミクロンポア
サイズのフィルター、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ社製のテフロン２０〜７０ミクロンポアサイズフィル
ター、或いはＣｏｓｔｅｒ社製ナイロン６６ ２２−４
６ミクロンポアサイズフィルターが包含される。
【０１０１】フイブリンモノマーを含む組成物の中にト
ロンビン様酵素ではない酵素、即ちバトロキソビンが存
在する場合の別法としてその系では可溶性のトロンビン
様酵素を用い、フイブリンの水素結合したポリマーを可
溶化することによってその酵素を除くのがよい。酵素の
除去はアフィニテイマトリックス、即ちトロンビン様酵
素に対して特別な親和性をもった不活性な支持体に結合
した配位子か又はイオン交換又は疎水性の相互作用をす
る支持体又は最も効果的であるアビジン−ビオチン系を
用いて行うことが出来る。このビオチン−アビジン系の
相互作用は自然界に存在するものの中で最も強い非共有
結合性の結合定数（ＫＤＩＳ＝１０−１５Ｍ）を示す。
Ｅ．Ａ．バイヤー（Ｂａｙｅｒ）及びＭ．ウイルチェッ
ク（Ｗｉｌｃｈｅｋ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２６：１（１９
８０）参照。
【０１０２】この工程に於いてはビオチンは例えばバト
ロキソビンと共有的に結合し、そのビオチン−バトロキ
ソビン複合体（これは可溶性である）は直接血漿と反応
させる、即ち１０ＢＵ＋５０ｍｌ血漿と３７℃で１０分
反応させる。生成したフイブリンＩポリマーは遠心分離
又は濾過によって収得し、３０ｍＭの塩化カルシウムを
含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ４．０ ４ｍｌ
中に再溶解する。このフイブリンＩ溶液にアガロースの
ような不活性支持体に結合した１モル過剰のアビジンを
加える。このアガロース：アビジン：ビオチン−バトロ
キソビン複合体は遠心分離又は濾過によってフイブリン
Ｉから分離し、実質的にバトロキソビンを含まないフイ
ブリンモノマーを含む組成を得、この組成は以下に述べ
るように再重合してフイブリン密封剤として役立つ。
【０１０３】したがって本発明の態様の一つとして、フ
イブリンモノマーを含む組成物は、実質的にはトロンビ
ン様酵素を含まない。実質的に含まないという意は、ト
ロンビン様酵素が全く除去されているか又は組成物中
に、不都合な薬理効果をもたらすような量のトロンビン
様酵素が残存していないという意味である。このことよ
り本発明による組成物の望ましい「実質的に含まない」
状態は、トロンビン酵素が、フイブリンモノマーを含む
組成物の調製に用いたもとの量の０〜１０％、好ましく
は０〜２％を含んでいてもよい。これらの態様は所望の
可溶性フイブリンへの変換につづいてトロンビン様酵素
の除去について開示しているが、トロンビン様酵素の大
部分、又はすべてを保有している組成物は、本発明の一
部としては有用なものであると考えられる。
【０１０４】さてこれでフイブリンモノマーを含有した
組成物がフイブリン密封剤として使用する用意が整っ
た。このような組成物が全血より調製された場合もとの
フイブリノゲン由来の６０〜９０％が存在する、勿論フ
イブリンモノマーとして存在する。
【０１０５】フイブリンモノマーを含むこの組成物は調
製された直後使用することが出来る。実際、この組成物
が自系のものである場合は、調製後直ちに使用すること
が特に好ましい。調製後すぐに用いない場合は貯蔵する
ことが出来る。組成物は、例えば凍結又は凍結乾燥、又
は４℃に保つことによって保存される。凍結又は凍結乾
燥した組成物は数ヶ月安定である。組成物を４℃に保っ
た場合は少なくとも数日安定である。
【０１０６】組成物を凍結した場合は使用時解凍しなけ
ればならない。組成を凍結乾燥した場合は、使用時に
は、可溶化工程で使用した酸緩衝溶液、例えば酢酸のよ
うな揮発酸であった場合、その酸緩衝溶液を加えて再構
築するのが好ましく、カオトロピズム剤が用いられた場
合は蒸留水を用いるのが好適である。可溶化の工程の場
合と同様再構築の場合フイブリンモノマーを溶解するの
に出来るだけ少量の酸緩衝液又は蒸留水を使用すべきで
ある。事実フイブリンモノマーを含む凍結乾燥した組成
物の再構築製剤はフイブリンモノマーの濃度を２００ｍ
ｇ／ｍｌの濃度にすることが出来る。凍結乾燥する前に
充填剤としてマンニトール又はラクトースを組成物に加
えることが出来る。別法として凍結乾燥した組成物は凍
結乾燥した状態で使用することが出来る。そのような形
態は例えば抗生物質のような補助剤を加えたい場合には
特に好ましい。
【０１０７】フイブリンモノマーを含む組成物は実質的
に如何なる形態であってもよい。例えば水剤、散剤、乳
剤又は固型剤であってもよく、中でも水剤が好ましい。
このように例えば製剤が液体、ゲル状、ペースト状又は
軟膏状であってもよい。又凍結乾燥したフイブリンモノ
マーは“顆粒”であってもよく、使用する直前に水溶
液、乳液又は懸濁液としてもよいし又そうしなくてもよ
い。
【０１０８】溶液に出来る溶媒であればいづれでもよい
が勿論その溶媒は無毒であることが好ましい。これに限
定するものではないが溶媒の例としては、水、エチルア
ルコール、グリセロール、及びプロピレングリコールで
あり、水が好ましい。
【０１０９】懸濁液の１つの例は、フイブリンモノマー
を含有する組成物を有機溶媒、例えばエタノールと混合
し、最終的にはその濃度を３．０Ｍ以上になるように
し、よく振り混ぜる。フイブリンモノマーは沈でんし、
遠心分離によって回収することが出来る。沈でんは有機
相で洗滌し、可溶化工程で用いた水性溶媒を除去する。
フイブリンモノマーのエタノール懸濁液を直接包帯又は
その他の担体に適用するか又はそのまま直接傷口に適用
してもよい。有機溶媒相は蒸発させる。包帯又はその他
の担体を用いた場合は適用の部位に接触するか又はその
他の方法によって懸濁液は再水和しそしてフイブリンは
重合する。
【０１１０】別法として、例えばジエチルエーテルのよ
うな非常に揮発しやすい有機溶媒で調製した懸濁液は所
望の部位に噴霧することも出来るし又スプレイ懸濁液と
して適用することが出来る。揮発性の溶媒は不燃性であ
ることが好ましい。フイブリンモノマーの有機溶媒懸濁
液は、耳、鼻、喉、又は肺に噴霧又は吸気によって適用
することが出来、又出血した食道又は胃の病巣には、経
口投与によって適用することも可能である。
【０１１１】本発明によるフイブリン密封剤は、フイブ
リンモノマー又は非架橋フイブリンを所望の部位に接触
させることにより、その接触と同時にフイブリンモノマ
ーをフイブリンポリマーに変換させるか又は非架橋フイ
ブリンを架橋フイブリンに変換し、それによって所望の
部位でフイブリン塊を形成させることによって使用す
る。
【０１１２】本発明での所望の部位とはフイブリン塊を
形成させたい部位のことである。所望の部位が何である
か、又何処であるかと云うことは本発明のフイブリン密
封剤の使用に依存している。又フイブリン密封剤はヒト
ばかりではなく他の哺乳動物にも適用出来るものである
と信じられていることに注目すべきである。又、もしフ
イブリン密封剤の源が血液である場合は、その血液はフ
イブリンを使用する種と同じ種より得られた血液である
ことが好ましいが、決して基本的な事項であると云う訳
ではない。
【０１１３】本発明のフイブリン密封剤は周知の又はフ
イブリン密封剤の使用法として開発されうるいづれの方
法でも使用することができる。本発明での使用方法、キ
ット又はフイブリン密封剤は、組織又は器官の縫合、止
血、傷の治療、手術部位の封鎖、血管手術に於ける末端
冠状動脈吻合手術時の縫合口の出血の防止；左心室の縫
合；大動脈の切開及びカニウレ挿入部；再手術時の上心
筋の広汎性出血；及び血管部位例えば心房、大動脈又は
左心室レベルの血管よりの出血の止血に使用することが
出来る。本発明は又移植する前にテトロン製動脈管の密
封、体外の組織の密封、細胞生長のためのフイブリン束
の用意、損傷を受けた脾臓（臓器保存の場合）、肝臓、
その他の臓器の止血；気管枝吻合及び空気の漏出又は肺
の裂傷の密封、気管断端の密封、気管瘻孔及び食道瘻孔
の密封；及び非縫合治療（ジッパー技術）、及び大脳内
の血管腫（ＡＶＭ）、肝臓血管腫、大腸血管形成異常、
食道静脈瘤、血管放射線治療時の閉鎖、消化管潰瘍の２
次症状である“ポンプ作用をしている”胃腸の出血障
害、などに対して本発明は又有用である。本発明は更に
角膜移植時の止血、鼻血、扁桃摘出後、抜歯その他の手
術時の止血に有用である。Ｇ．Ｆ．ゲストリング（Ｇｅ
ｓｔｒｉｎｇ）及びＲ．レルマ（Ｌｅｒｍｅｒ）、Ｖａ
ｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２９４−３０４，９月
／１０月号、１９８３年を参照。又本発明によるフイブ
リン密封剤は血管凝固障害をもつものに対して特に適合
している。
【０１１４】フイブリンモノマーを含む組成又は非架橋
フイブリンを含む組成物の用量は、フイブリン密封剤の
特別な使用法に依存しているがその用量は意とする使用
に充分応えられる量でなければならない。通常水溶液と
してのフイブリンモノマー含有組成３ｍｌ〜５ｍｌで充
分フイブリン密封剤としての効果を表わすものと信じら
れている。しかしながらその組成の使用によっては０．
０５ｍｌ〜４０ｍｌになる場合もある。又もし非架橋フ
イブリンがポリマー型で使用される場合、又は組成物が
固型の場合はその組成物は、水溶液中に含まれていた量
に相当する量を含むものでなければならない。
【０１１５】本発明の目的として該接触工程に於いてフ
イブリンモノマーをフイブリンポリマーに、又は非架橋
フイブリンを架橋フイブリンに“同時に”変換すると云
うことは、そのような変換工程及びそのような接触工程
が所望の部位でそれぞれの工程の時間内でフイブリン塊
が形成されるという意味である。であるから“同時に”
なる語は接触工程の後フイブリンモノマーはフイブリン
ポリマーに、或いは非架橋フイブリンは架橋フイブリン
に変換されることを意味する。これは該組成が所望の部
位に適用された後にフイブリンモノマー又は非架橋フイ
ブリンを含有する組成物が、フイブリンモノマーがフイ
ブリンポリマーに、非架橋フイブリンが架橋フイブリン
に変換できる組成物と接触することによって実施され
る。この変換は通常接触後０．５分以内で行われなけれ
ばならない。さもなければフイブリンモノマー或いは非
架橋フイブリンを含有する組成は、特に非架橋フイブリ
ンがフイブリンモノマーである場合は所望の部位より流
失することになるかも知れない。
【０１１６】同時になる語は又接触工程と変換工程が同
時に起ることを意味している。これはフイブリンモノマ
ー又は非架橋フイブリンを含有する組成が、フイブリン
モノマーをフイブリンポリマーに或いは非架橋フイブリ
ンを架橋フイブリンに変換することが出来る組成物と接
触すると同時に所望の部位に接触することによって行わ
れる。
【０１１７】最後に又好ましいことでもあるが、同時な
る語は、すべてのフイブリンモノマーがフイブリンポリ
マーに又、すべての非架橋フイブリンが架橋フイブリン
に変換して了う程そんなに前のことではないが、変換工
程が接触工程の前に始まることを意味する。もしそうで
なければ接触工程の前にすべてのフイブリンモノマーが
フイブリンポリマーに、或いはすべての非架橋フイブリ
ンが架橋フイブリンに変換することになり、フイブリン
密封剤としては役に立たない結果となる。この具体例
は、フイブリンモノマー又は非架橋フイブリンを含む組
成物がフイブリンモノマーをフイブリンポリマーに、又
は非架橋フイブリンを架橋フイブリンに変換することが
出来る組成物と接触工程の前に混合することによって示
される。変換工程を完結させるためには約３０秒を必要
とするので、変換工程は接触工程の３０秒よりも前好ま
しくは３秒前に始めてはならない。この具体例はフイブ
リンモノマー又は非架橋フイブリンを含有する組成物の
最大量が所望の部位に残り、有効なフイブリン塊を形成
することが確かなので好ましい。
【０１１８】フイブリンモノマーをフイブリンポリマー
に、或いは非架橋フイブリンを架橋フイブリンへの変換
は周知の技術又は開発されるであろう技術のいづれによ
っても実施することが出来る。しかしいかに変換工程を
実施するかはフイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
を含有する組成物の出所、例えば全血より得られたもの
か又は組み換えフイブリノゲンより得られたものかと云
うことに依存しており、又フイブリンモノマーの型、非
架橋フイブリンの型、例えばフイブリンＩであるのか、
デスＢＢフイブリンであるのかと云うことに依存してい
る。又いく分かは所望の部位はフイブリン密封剤を使用
する際患者の血液を含んでいるかどうか、又は他の体液
を含んでいるかどうかに係っている。
【０１１９】又、もし別の組成物、例えばアルカリ緩衝
液が変換工程で使用（後述）されている場合は、本発明
による方法は、例えば２筒シリンジを用いて行うことが
出来る。２筒シリンジはＹ字型であってもよく、これに
よってフイブリンモノマー又は非架橋フイブリンと混合
することが出来、変換工程で該組成を使用する場合、接
触工程の直前に混合することが出来る。又Ｙ字型２筒シ
リンジではなく２つの注射口をもった２筒シリンジを使
用することも出来る。これは同時に所望の部位で接触さ
せることが出来、そしてフイブリンポリマー又は架橋フ
イブリンへの変換が起る。又２筒シリンジの組成物は所
望の部位に噴霧することも出来る。Ｈ．Ｂ．クラム（Ｋ
ｒａｍ）ら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｕｒｇｅｏ
ｎ，５７：３８１（１９９１）参照。
【０１２０】フイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
を含む組成物の供給源が血液である場合、前述したよう
にその組成はフイブリンモノマー又は非架橋フイブリン
を架橋フイブリンに変換するに十分なプロトロンビン、
第ＸＩＩＩ因子、及び他の必要な物質、即ちプロトロン
ビンを活性化する物質を保持しているであろうと考えら
れている。もし非架橋フイブリンがフイブリンポリマー
である場合、即ち非架橋フイブリンが可溶化されていな
い場合、その非架橋フイブリンは、プロトロンビンの活
性化及びその組成の第ＸＩＩＩ因子によって架橋フイブ
リンに変換することが出来る。このような活性化はその
組成をカルシウムイオンの供給源と接触させることによ
って行うことが出来る。カルシウムイオンの供給源とし
ては、これに限定する訳ではないが、塩化カルシウム、
好ましくは３０ｍＭ濃度の塩化カルシウムを包含する。
別法として、あまり好ましくはないが、カルシウムイオ
ンは所望の部位に血液によって供給することが出来る。
【０１２１】もし非架橋フイブリンが可溶化されている
場合、即ちフイブリンモノマーである場合、該フイブリ
ンモノマーをどのようにして架橋フイブリンに変換する
かは、どのようにして可溶化が行われたかに係ってい
る。もし非架橋フイブリンが酸緩衝液によって可溶化さ
れている場合は、架橋フイブリンは、フイブリンモノマ
ーを含む組成のｐＨを上げ、フイブリンモノマーを重合
させることにより形成させることが出来る。
【０１２２】これはその組成を適宜なアルカリ緩衝液に
接触させることによって実施出来る。これに限定するも
のではないが適宜なアルカリ緩衝液の例としてはＨＥＰ
ＥＳ、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カル
シウム、重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウムのような
重炭酸緩衝液、クエン酸のトリメタル塩、酢酸の塩、及
び硫酸の塩を包含する。
【０１２３】好ましいアルカリ緩衝液は：０．５−０．
７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムｐＨ１０−１
０．５、０．５−０．７５Ｍ重炭酸ナトリウム／水酸化
ナトリウムｐＨ１０．０、１．５Ｍグリシン／ＮａＯＨ
ｐＨ１０．０、０．５−１．０Ｍビスヒドロキシエチ
ルアミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍ
ヒドロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰ
ＰＳ）ｐＨ８．５、０．５ＭトリシンｐＨ８．５、１Ｍ
モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ８．
０、１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノエタンスルホン
酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０及び０．５Ｍシクロヘキシルア
ミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）ｐＨ１０．０；最も
好ましいものとしては、０．５−０．７５Ｍ炭酸ナトリ
ウム／重炭酸ナトリウムｐＨ１０−１０．５、０．５−
１．０Ｍビスヒドロキシエチルアミノエタンスルホン酸
（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍヒドロキシエチルピペラジ
ンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）ｐＨ８．５及び１Ｍ
トリスヒドロキシメチルアミノエタンスルホン酸（ＴＥ
Ｓ）ｐＨ８．０である。
【０１２４】使用するアルカリ緩衝液の量は非架橋フイ
ブリンを重合するに十分な量でなければならない。フイ
ブリンモノマーを含む組成約１０部から約１部とアルカ
リ緩衝液１部を混合するのが好適である。更に好ましく
はそのような比率は９：１である。好ましい比率は選択
した緩衝液によるものであり又フイブリンポリマーの望
ましい“強度”に依存していることに注目すべきであ
る。勿論フイブリンポリマーの所望の強度はフイブリン
密封剤の最終の使用にかかわっていることは云うまでも
ない。もし可溶化がカオトロピズム試薬を用いて行った
ものである場合は、フイブリンモノマーを含む組成を例
えば蒸留水で稀釈することによって架橋フイブリンに変
換することが出来る。稀釈は出来るだけ最少量の稀釈剤
を用いて行われるべきである。通常稀釈した後のカオト
ロピズム試薬の濃度は、０．５〜０．１モル濃度である
べきである。
【０１２５】ｐＨを上昇させること又はフイブリンモノ
マーを含む組成のカオトロピズム試薬の稀釈に加えてそ
のような組成のプロトロンビン及び第ＸＩＩＩ因子を活
性化して架橋フイブリンを形成することが好適である。
このような活性化はその組成をカルシウム供給源と接触
させることによって行われる。カルシウムイオン供給源
は可溶化工程に用いられるアルカリ緩衝液の一部又は酸
緩衝液の一部とすることが出来る。カルシウムイオン供
給源として、これらに限定するものではないが、塩化カ
ルシウムを包含し、好ましくは３０ｍＭの濃度である。
別法として、あまり好ましくはないがカルシウムイオン
の供給源は、所望の部位に血液によって供給することが
出来る。
【０１２６】もしアルカリ緩衝液が炭酸塩／重炭酸塩緩
衝液である場合はカルシウムイオンの供給源を可溶化工
程中に酸緩衝液に加えなければならないことに留意すべ
きである。これは塩化カルシウムは炭酸塩／重炭酸塩緩
衝液には溶解しないためである。酸緩衝液中のカルシウ
ムイオンの濃度は５ｍｍｏｌ濃度〜１５０ｍｍｏｌ濃度
であることが好ましく更に好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭ
濃度である。
【０１２７】得られたフイブリン塊は、たとえ非架橋フ
イブリン即ちフイブリンモノマー又はフイブリンポリマ
ーが存在していても架橋したフイブリンＩＩであろうと
信じられている。しかしながら非架橋フイブリン形成が
デスＢＢフイブリンである場合、そのときはデスＢＢフ
イブリンを架橋フイブリンに変換するためには更にトロ
ンビンを加える必要があると信じられている。そのよう
なトロンビン供給源は例えば患者からの血漿であっても
よく、その血漿は非架橋フイブリンの組成物に加えられ
る。
【０１２８】もし所望の部位が血液を含み、フイブリン
モノマーを含む組成を使用した場合、即ち非架橋フイブ
リンが可溶化された場合、その血液はカオトロピズム試
薬の稀釈又はフイブリンモノマーを含有する組成物のｐ
Ｈを上げるのに役立つことが出来る。このように稀釈剤
もアルカリ緩衝液も使用する必要がない。この態様の中
では、カルシウムイオン供給源は可溶化工程で使用され
る酸緩衝液又はカオトロピズム試薬中に含まれているの
が好適である。又本態様に於てはフイブリンモノマーを
含む組成物は固形の支持体上に供することが出来る。例
えば包帯、縫合糸、人工器官又はガーゼに供することが
出来、これらは所望の部位と接触する。これらの支持体
は、例えばフイブリン塊が形成するまで所望の部位に接
触することになる。
【０１２９】しかしながら、もしフイブリンモノマーを
含む組成物が架橋フイブリンを形成するに充分なプロト
ロンビン及び第ＸＩＩＩ因子を保持していない場合は、
そのような組成物もフイブリン密封剤としてなお有用で
ある。というのはフイブリンモノマーがそれ自体重合に
よってフイブリン塊を形成するのに有用であるからであ
る。又そのような組成物はカルシウムイオン源及び活性
化した第ＸＩＩＩ因子（又は活性化第ＸＩＩＩ因子の前
駆体）及び任意にはトロンビンを加えることによって架
橋フイブリンを形成させるためにまだ利用することが出
来る。そのようなカルシウムイオン源、活性化した第Ｘ
ＩＩＩ因子及びトロンビンをフイブリンモノマーを含む
組成物に加えることが出来る。活性化した第ＸＩＩＩ因
子は、フイブリンモノマーを含む組成物に最終濃度非架
橋フイブリンを含む組成物１ｍｌにつき第ＸＩＩＩ因子
が１．０〜２０単位になるように加えることが出来る。
別法として第ＸＩＩＩ因子は所望の部位の血液、又は体
液によって供給することが出来、又自系の血漿をフイブ
リンモノマーを含む組成物に加えることによって第ＸＩ
ＩＩ因子を供給することが出来る。
【０１３０】限定するものではないがカルシウムイオン
源は塩化カルシウムを包含し、好ましくは３０ｍＭ濃度
である。別法として、あまり好ましいとは云えないがカ
ルシウムイオンは所望の部位の血液又は体液によって供
給出来る。フイブリンを含む組成物１ｍｌにつき４〜５
００単位のトロンビンを加えることが出来るかもしく
は、トロンビンを所望の部位で供給することが出来る。
【０１３１】非架橋フイブリンを含む組成物の供給源が
フイブリノゲンを分泌する細胞培養であるか又は組換え
フイブリノゲンである場合は、非架橋フイブリンはフイ
ブリンポリマーである。即ち非架橋フイブリンは可溶化
されないのでカルシウムイオン源及び活性化された第Ｘ
ＩＩＩ因子（又は活性化された第ＸＩＩＩ因子の前駆
体）は架橋フイブリンの形成に使用される。非架橋フイ
ブリン源は第ＸＩＩＩ因子を含まないので第ＸＩＩＩ因
子が使用されなければならない。活性化した第ＸＩＩＩ
因子は非架橋フイブリンを含む組成物に最終濃度が非架
橋フイブリンを含む組成物１ｍｌに対して第ＸＩＩＩ因
子１．０〜２０単位になるように加えられる。別法とし
て第ＸＩＩＩ因子は所望の部位で血液又は体液によって
供給することが出来るか又は自系の血漿を組成に加える
ことによって供給することが出来る。これに限定されな
いが、カルシウムイオン源は塩化カルシウムを包含し、
好適には３０ｍＭの濃度でである。別法としてはあまり
好ましくはないがカルシウムイオンは所望の部位で血液
又は体液で供給出来る。又随意、トロンビンが架橋フイ
ブリンＩＩが形成するとの確信のもとにそのような組成
物に加えることが出来る。非架橋フイブリンを含む組成
物１ｍｌにつき４〜５００単位のトロンビンを加えるこ
とが出来るか又はトロンビンは所望の部位によって供給
されることが出来る。
【０１３２】もし非架橋フイブリンが可溶化された場
合、即ちフイブリンモノマーである場合、いかにフイブ
リンモノマーがフイブリンポリマーに変換するかは、い
かにして可溶化が行われたか即ち酸緩衝液を用いたか又
はカオトロピズム試薬を用いたかに係っている。フイブ
リンポリマーの形成は上に記述した同じ方法によって行
うことが出来る。このフイブリンポリマーはもし望むな
らば、カルシウムイオン源及び活性化第ＸＩＩＩ因子
（又は活性化第ＸＩＩＩ因子の前駆体）を加えることに
よって及び随意にトロンビンを上に示したようにフイブ
リンモノマーを含む組成物に加えることによって、架橋
フイブリンに変換することが出来る。
【０１３３】活性化した第ＸＩＩＩ因子は最終の濃度が
非架橋フイブリンを含む組成物１ｍｌに対して第ＸＩＩ
Ｉ因子が１．０〜２０単位になるように非架橋フイブリ
ンを含む組成物に加えることが出来る。別法として、第
ＸＩＩＩ因子は所望の部位にて血液又は体液によって供
給することが出来るか又は自系の血漿非架橋フイブリン
を含む組成物に加えることによって供給することが出来
る。限定するものではないがカルシウムイオン源は塩化
カルシウムを包含し、好ましくは３０ｍＭの濃度であ
る。変法としてあまり好ましくはないが、カルシウムイ
オンは所望の部位で血液又は体液によって供給すること
が出来る。フイブリンモノマーを含む組成物１ｍｌに対
してトロンビン４〜５００単位を加えてもよいし又、ト
ロンビンを所望の部位で供給してもよい。
【０１３４】本発明によるフイブリン密封剤は又補助
剤、例えば抗生物質即ちゲンタマイシン、セフオタキシ
ム、ネバセチン及びシソマイシン、ヒスタミンＨ２−拮
抗剤即ちラニチジン、及び抗癌剤即ちＯＫ−４３２を含
むことが出来る。これは所望の抗生物質をフイブリンモ
ノマー又は非架橋フイブリンを含む組成物に加えること
によって達成することが出来る。Ｍ．Ｃ．Ｈ．ゲルスド
ルフ（Ｇｅｒｓｄｏｒｆｆ）及びＴ．Ａ．Ｊ．ロビラー
ド（Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ）ら、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐ
ｅ，９５：１２７８−８０（１９８５）；Ａ．エデルレ
（Ｅｄｅｒｌｅ）ら、Ｉｔａｌ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌ．，２３：３５４−５６（１９９１）；Ｖ．
ロンファルド（Ｒｏｎｆａｒｄ）ら、Ｂｕｒｎｓ，１
７：１８１−８４（１９９１）；Ｔ．サクライ（Ｓａｋ
ｕｒａｉ）ら、Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ，１
８：３９−４３（１９９２）；Ｔ．モンデン（Ｍｏｎｄ
ｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ，６９：６３６−４２（１９９
２）；Ｆ．グレコ（Ｇｒｅｃｏ）、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２
５：３９−５１（１９９１）及びＨ．Ｂ．クラム（Ｋｒ
ａｍ）ら、Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
５０：１７５−１７８（１９９１）参照。これらを明細
書中参考文献として引用する。他の補助剤も又加えるこ
とが出来る。例えばフィブロネクチン、フイブリン溶解
酵素阻害剤であるアプロチニン、α−２抗プラスミン、
ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、６−アミノヘキソン酸、４−
アミノメチルシクロヘキソン酸、コラーゲン又はケラチ
ン細胞である。このような補助剤の用量は慣用のフイブ
リン密封剤に使用されているものと同様であると確信す
る。
【０１３５】本発明は、又フイブリン密封剤キットも提
供する。そのキットは、最初の成分としてフイブリンモ
ノマーを含む組成であり、第２の成分としてフイブリン
モノマーを重合することが出来るアルカリ緩衝液である
か又は蒸留水であり、これらは可溶化工程がどのように
なされたかに係っている。第２の成分は随意にカルシウ
ムイオン源を含むことが出来る。別法として最初の成分
は非架橋フイブリンを含む組成物であり又第２の成分は
カルシウムイオン源であってもよい。もし非架橋フイブ
リンを含む組成物を調製するために使用したフイブリノ
ゲン源が、フイブリノゲンを分泌する細胞培養からであ
るか又は組換えフイブリノゲンからのものである場合
は、最初の成分は非架橋フイブリンを含む組成物であ
り、第２の成分はカルシウムイオン源であり、第３の成
分は活性化された第ＸＩＩＩ因子である。
【０１３６】
【実施例】
〔実施例１〕 全血より血漿の調製：全血（１００ｍｌ）をクエン酸塩
／リン酸塩／デキストローズのような抗凝固剤の入った
市販の標準血液バッグに集める。血液は遠心分離に適し
た容器に移し、室温にて１０分３，０００ｇで遠心分離
を行う。澄明な血漿上澄液（５０ｍｌ）を傾斜して分け
とり、細胞成分は捨てる。
【０１３７】全血から血漿を調製する別法は濾過操作に
よるものである。クエン酸／リン酸塩／デキストローズ
のような適宜な抗凝固剤の入ったバッグに全血１００ｍ
ｌを集める。血液は蠕動運動ポンプを用いてプロテイン
を効率よく濾去するフィルターを通して循環させる。メ
ンブラン通過後の圧力の低下は、最循環血液中に残って
いる細胞成分によって血漿の無理な通過を強いられるこ
とになる。血漿（５０ｍｌ）は次の操作のために集め
る。
【０１３８】〔実施例２〕 粒状アガロース上にバトロキソビンの固定：粒状アガロ
ース（フアルマシア社製）を固定化の研究に用いた。使
用したアガロースは架橋度４％、４５−１６５μｍ（粒
子の９０％）であった。このものは吸水した場合体積が
５倍膨潤した。
【０１３９】バトロキソビンは最初被覆したシンチレー
ションバイアル中過ヨウ素ナトリウムで室温で１時間酸
化する。このバトロキソビンはセフアデクスＰＤ−１０
ゲル透過カラムを通過させて精製する。酸化したバトロ
キソビンは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５＋１０ｍ
Ｍ水素化ホウ素ナトリウム（３０−２００Ｕ／１．７５
ｇ吸湿ゲル）中一夜、室温でヒドラジドで活性化したア
ガロースゲルと結合させる。結合しなかった試薬は５０
ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、１００ｍｌ
の５０ｍＭグリシン／１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ３．０、
１００ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリ
ウムｐＨ１０．０、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム／１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍｌの
水、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化
ナトリウム、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐ
Ｈ７．０で洗滌することによって除去する。
【０１４０】〔実施例３〕 非架橋フイブリンを含有する組成を形成するために、固
定酵素と血漿フイブリノゲンとの反応：固定酵素（３５
０ｍｇ）を遠心分離した又は濾過した血漿に加え、非架
橋フイブリンＩポリマー塊が出来るまで７−２０分ゆる
やかに混合する。
【０１４１】フイブリンＩポリマー及び結合した固定酵
素は、ａ）３，０００ｇで１０分遠心分離して上澄血清
を傾斜して除去するか又はｂ）適宜な低プロテイン結合
フィルターを通過させて濾過し、続いて濾過された血清
を捨て、フイブリンＩポリマーと固定酵素の混合物を次
の操作のために維持する。このフイブリンＩポリマーは
非架橋フイブリンを含む組成の一例である。
【０１４２】〔実施例４〕 フイブリンモノマーを含有する組成を調製するためのフ
イブリンＩポリマーの可溶化：フイブリンＩポリマーの
可溶化は、収得したフイブリンＩポリマー＋固定酵素に
３０ｍＭ塩化カルシウムを含んだ０．２Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４．０）１〜４ｍｌを加えることによっ
て達成される。この試料は続いてボルテックスミキサー
上で激しく２分間振盪する。固定酵素はフイブリンＩ溶
液を１−２０μｍの低プロテイン結合したフィルターを
通して濾過することにより除去することが出来る。アガ
ロース酵素はフィルター上に残りこの系から除去され
る。フイブリンＩモノマーを含有する残った溶液は、他
の血漿プロテインと結合し、濃縮された酸性フイブリン
Ｉモノマー溶液より構成されている。通常１００ｍｌの
全血より２５ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌのフイブリン
モノマー濃度のフイブリンモノマーを含む組成４ｍｌ又
は５ｍｌが得られる。さてこれで単独又はフイブリン密
封剤を形成するために再重合緩衝液と同時投与するかの
いづれかの方法で患者に供給する用意が出来たことにな
る。
【０１４３】〔実施例５〕 フイブリンＩモノマーを含有する組成の再重合：再重合
はフイブリンＩモノマーを含む溶液９部と適宜な緩衝
液、例えば０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウ
ム、ｐＨ１０．０ １部を混合することにより達成され
る。混合比はいろいろに変更することが出来るが９：１
なる比は最終調製物でのフイブリンを高濃度に保つこと
が出来る。同時投与の場合にはフイブリンＩは自発的に
重合し、フイブリンの架橋によって３０分でフイブリン
ＩＩに変換する。
【０１４４】〔実施例６〕 アガロースのヒドラジドによる活性化及び酵素の水酸化
炭素部位との結合：バトロオキソビンの水酸化炭素部を
ヒドラジドで活性化した支持体と反応させるために、糖
部を酸化して−ＣＨＯ基にしなければならない。これは
以下のようにして達成される。
【０１４５】バトロキソビン１〜７ｍｇを水２ｍｌ及び
０．１Ｍ過ヨウ素酸０．２ｍｌ中に溶解する。混合物は
室温で１時間インキュベートしその後セフアデクスＧ−
２５ゲルカラムを通して脱塩する。酸化された活性バト
ロキソビンはカラムから０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム
で溶出する。
【０１４６】市販の標準ヒドラジド活性化アガロース
（Ｂｉｏｒａｄ研究所製、イギリス）又は末端にアミノ
基をもつ試薬は直接アルデヒド基（−ＣＨＯ）と反応さ
せるのに用いることが出来る。ヒドラジド−アガロース
をカップリングに使用する場合は次のようにして行う。
【０１４７】１〜５ｇのヒドラジド−アガロースゲルを
５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５４ｍｌ中に懸濁す
る。この懸濁液に１０ｍＭ水素ホウ素ナトリウム１ｍｌ
と所望の量の酸化したバトロキソビン（典型的には１０
０ー２００Ｂｕ／ｇ、吸湿ゲル）を加える。
【０１４８】その試料は一夜室温で混合し、続いてガラ
スロート上で５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５ ５
０ｍｌ、５０ｍＭグリシン／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ
３．０ １００ｍｌ、５０ｍＭ炭酸ナトリウム／１Ｍ塩
化ナトリウム ｐＨ１０．０１００ｍｌ、５０ｍＭリン
酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウム ｐＨ７．０１００
ｍｌ、水１００ｍｌ及び５０ｍＭリン酸ナトリウム／１
Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．０ １００ｍｌそして最後に
５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０１００ｍｌで洗
滌する。
【０１４９】固定化されたバトロキソビンと血漿との反
応は以下のようにして行う。
【０１５０】血漿（５０ｍｌ）のｐＨは酢酸を加えてｐ
Ｈ５．５にする。バトロキソビンの１００−２００ＢＵ
の当量をアガロース １．７５ｇ（吸湿性ゲルの容量）
に固定したものを血漿に加える。血漿は３７℃で１０〜
１５分インキュベートし、その後ｐＨは水酸化ナトリウ
ムを加えることによってｐＨ７．４とする。フイブリン
Ｉの重合は即座に起こる。フイブリンＩポリマーは３，
５００ｒｐｍで１０分遠心分離することによって収得
し、そして３０ｍＭの塩化カルシウムを含んだ０．２Ｍ
酢酸ナトリウムｐＨ４．０ ３〜４ｍｌ中に再溶解す
る。アガロース−酵素はそれから遠心分離か又は濾過に
よってフイブリンＩより分離する。フイブリンＩは続い
て再重合し０．７５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウ
ム ｐＨ１０．０ １部に対してフイブリンＩ溶液９部
を加えることによってフイブリン密封剤を形成させる。
【０１５１】〔実施例７〕 ビオチン−アヒジンを用いた酵素捕捉：酵素の捕捉は最
初バトロキソビンをビオチニル化し、そしてそのビオチ
ン−酵素を固定化したアビジン（アビジンは６％架橋し
たアガロースに結合）で捕捉することによって行われ
る。
【０１５２】プロテインのヒオチニル化は多くの試薬を
用いて達成することが出来る。例えばＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミド（ＮＨＳ）−ビオチン（水に不溶）が用い
られる（Ａｍｅｒｓｈａｍ社より市販）。ＮＨＳ−ビオ
チン（５０μｌ）を１ｍｇのバトロキソビンにｐＨ８．
６で加え、そしてその溶液を室温で１時間インキュベー
トする。過剰のビオチニル化試薬はセフアデクスＧ−２
５カラムを使用し、０．１Ｍリン酸カリウム ｐＨ７．
５で溶出するゲル濾過法で除く。
【０１５３】１０ＢＵ当量のビオチン−バトロキソビン
を５０ｍｌの血漿に加え、３７℃、１０分インキュベー
トする。フイブリンＩポリマーは遠心分離（３，５００
ｒｐｍ，１０分）によって収得し、そして３０ｍＭ塩化
カルシウムを含有する０．２Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ
４．０ ３〜４ｍｌ中に再溶解する。アビジン−アガロ
ース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社より市販）を
０．２ｇ（吸湿ゲル）／ｍｌフイブリンＩの割合でフイ
ブリンＩに加える。その試料は室温で１０分インキュベ
ートし、２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離する。生成
したフイブリンＩは実質的にバトロキソビンを含んでい
ない。フイブリン密封剤を形成するフイブリンの再重合
は実施例６方法に従って収得する。
【０１５４】本発明は、ここに記載した特別な実施態様
によってその範囲を限定するものではなく、本発明の個
々の態様をただ単に説明することを意としたものであ
る。当然のことながら当業者にとっては本明細書に記載
した内容に加えていろいろな変更、修正が出来ることは
明らかなことである。そのような変更は、請求項に示し
た範囲内に入るものであると考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ａ６１Ｋ 37/12 37:465） 8314−4Ｃ (Ａ６１Ｋ 35/14 37:475） (Ａ６１Ｋ 35/14 37:465） (72)発明者 ジョン エサム フェアブラザー イギリス国クリウド シーエイチ７ ６イ ーエイ シチディン ブロックブルック ブリン シリオール （番地なし) (72)発明者 ロナルド ステフェン ガードナー イギリス国クリウド シーエイチ５ １エ イチダブリュー ディーサイド ショット ン （番地なし) (72)発明者 デレク アンドリュー ホリングスビー イギリス国サウス ウィラル エル64 ５ キューティ パークゲイト パドック ド ライブ 21 (72)発明者 スチュアート アンソニイ セダホルムー ウイリアムズ イギリス国オクスフォード オーエクス４ ４ワイジー リトルモア ヘイフォード ヒル レイン 10シー

Claims (71)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）所望の部位をフイブリンモノマー
    を含有する組成物と接触させ；そして（ｂ）該フイブリ
    ンモノマーを該接触工程と同時にフイブリンポリマーに
    変換してフイブリン密封剤を形成することを特徴とする
    フイブリン密封剤の使用方法。
  2. 【請求項２】 フイブリンモノマーが非架橋フイブリン
    Ｉ、デスＢＢフイブリン及び非架橋フイブリンＩＩより
    選ばれるものである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 非架橋フイブリンがフイブリンＩである
    請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 フイブリンポリマーがフイブリンＩＩポ
    リマーである請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 フイブリンポリマーが架橋したものであ
    る請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 組成物が、トロンビン様酵素を実質的に
    含まない請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 組成物が血液、フイブリノゲンを分泌す
    る細胞培養及び組換えフイブリノゲンからなる群より選
    ばれたものを起源として形成する請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 起源が血液である請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 組成物がプロトロンビン、プロトロンビ
    ンのアクチベータ及び第ＸＩＩＩ因子を更に含む請求項
    ８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 血液が自系の血液である請求項７記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 変換工程がアルカリ緩衝液又は蒸留水
    を用いる請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アルカリ緩衝液又は蒸留水が更にカル
    シウムイオン源を含有するものである請求項１１記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 アルカリ緩衝液が、水酸化ナトリウ
    ム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、重炭酸緩衝
    液、クエン酸三金属塩、酢酸の塩、及び硫酸の塩からな
    る群より選ばれたものである請求項１１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 アルカリ緩衝液が０．５−０．７５Ｍ
    炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムｐＨ１０−１０．
    ５、０．５−０．７５Ｍ重炭酸ナトリウム／ＮａＯＨ
    ｐＨ１０．０、１．５Ｍ グリシン／ＮａＯＨ ｐＨ１
    ０．０、０．５−１．０Ｍ ビスヒドロキシエチルアミ
    ノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍ ヒド
    ロキシエチルピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰ
    Ｓ）ｐＨ８．５、０．５Ｍ トリシン ｐＨ８．５、１
    Ｍ モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ
    ８．０、１Ｍ トリスヒドロキシメチルアミノエタンス
    ルホン酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０、及び０．５Ｍ シクロ
    ヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）ｐＨ１
    ０．０からなる群より選ばれるものである請求項１１記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 アルカリ緩衝液が０．５−０．７５Ｍ
    炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム ｐＨ１０−１０．
    ５、０．５−１．０Ｍ ビスヒドロキシエチルアミノエ
    タンスルホン酸（ＢＥＳ）ｐＨ７．５、１Ｍ ヒドロキ
    シエチルピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）ｐ
    Ｈ８．５及び１Ｍ トリスヒドロキシメチルアミノエタ
    ンスルホン酸（ＴＥＳ）ｐＨ８．０からなる群より選ば
    れるものである請求項１１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 接触工程が、１つの注射筒には該組成
    物、もう一方の注射筒には該アルカリ緩衝液又は蒸留水
    が充填されている２重注射筒シリンジを使用する請求項
    １１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 組成物が水性組成物であり、ｐＨ１−
    ｐＨ５を示すものであるか又はカオトロピズム剤を含有
    するものである請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 組成物が更に酢酸、コハク酸、グルク
    ロン酸、システイン酸、クロトン酸、イタコン酸、グル
    タミン酸、ギ酸、アスパラギン酸、アジピン酸及びそれ
    らの塩よりなる群より選ばれる酸緩衝剤よりなる請求項
    １７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 酸緩衝剤がコハク酸、アスパラギン
    酸、アジピン酸及び酢酸の塩からなる群より選ばれるも
    のである請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 酸緩衝剤が酢酸ナトリウムである請求
    項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 酸緩衝剤の濃度が０．０２Ｍ〜１Ｍで
    ある請求項１８記載の方法。
  22. 【請求項２２】 酸緩衝剤の濃度が０．１Ｍ〜０．３Ｍ
    である請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 カオトロピズム剤が、尿素、臭化ナト
    リウム、グアニジン塩酸塩、ＫＣＮＳ、ヨウ化カリウ
    ム、及び臭化カリウムからなる群より選ばれるものであ
    る請求項１７記載の方法。
  24. 【請求項２４】 カオトロピズム剤の濃度が０．２Ｍ〜
    ６．０Ｍの濃度である請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 カオトロピズム剤の濃度が３．５Ｍ〜
    ５．０Ｍの濃度である請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 フイブリンモノマーの水溶液中の濃度
    が１０ｍｇ／ｍ１〜２００ｍｇ／ｍｌである請求項１７
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 フイブリンモノマーの水溶液中の濃度
    が２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである請求項２６
    記載の方法。
  28. 【請求項２８】 水溶液が更にカルシウムイオン源を含
    有する請求項１７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 所望の部位が哺乳動物に関するもので
    ある請求項１記載の方法。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物がヒトである請求項２９記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 所望の部位が皮膚、血液循環系、リン
    パ系、呼吸器系、耳、鼻、咽喉、目、肝臓、脾臓、頭
    蓋、脊髄、上顎顔面、骨、腱、膵臓、生殖泌尿器官、及
    び消化器官からなる群より選ばれるものである請求項３
    ０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 （ａ）フイブリノゲンを含む組成物を
    トロンビン様酵素と接触させ、該フイブリノゲンを非架
    橋フイブリンポリマーに変換し； （ｂ）フイブリノゲンを含む組成物より非架橋フイブリ
    ンポリマーを分離し；そして （ｃ）該非架橋フイブリンポリマーを可溶化してフイブ
    リンモノマーを含む組成物にする；ことを特徴とするフ
    イブリノゲンからフイブリンモノマーを含む組成物を製
    造する方法。
  33. 【請求項３３】 トロンビン様酵素が支持体に固定され
    ており、接触工程でトロンビン様酵素が非架橋フイブリ
    ンポリマーと会合し、更にフイブリンモノマーを含有す
    る組成物よりトロンビン様酵素を除去することを特徴と
    する請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 支持体がセルローズ、ポリデキストラ
    ン、アガロース、ポリスチレン、シリカ、ポリアクリル
    酸、ポリアクリルアミド、ポリビニールアルコール、ガ
    ラスビーズ、ポリ炭酸、コラーゲン、セルローズ誘導
    体、ポリテトラフルオロエチレン及びそれらの混合体か
    らなる群より選ばれるものである請求項３３記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】 支持体がアガロース及びシリカからな
    る群より選ばれるものである請求項３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 トロンビン様酵素がフィルター上に固
    定されるか又はトロンビン様酵素が支持体上に固定され
    そしてフィルターの片面にあり、そして該接触工程の後
    得られたフイブリンモノマーを該フィルターに通過させ
    ることによる請求項３２記載の方法。
  37. 【請求項３７】 可溶化工程がｐＨ５以下の酸緩衝液又
    はカオトロピズム剤を使用することによって行われる請
    求項３２記載の方法。
  38. 【請求項３８】 酸緩衝液が酢酸、コハク酸、グルクロ
    ン酸、システイン酸、クロトン酸、イタコン酸、グルタ
    ミン酸、ギ酸、アスパラギン酸、アジピン酸、及びそれ
    らの塩からなる群より選ばれるものである請求項３７記
    載の方法。
  39. 【請求項３９】 酸緩衝液又はカオトロピズム剤が更に
    カルシウムイオン源を含む請求項３７記載の方法。
  40. 【請求項４０】 分離工程が濾過によって行われる請求
    項３２記載の方法。
  41. 【請求項４１】 トロンビン様酵素がフイブリノゲンを
    フイブリンに変換することが出来るものである請求項３
    ２記載の方法。
  42. 【請求項４２】 トロンビン様酵素がアンクロド（Ａｎ
    ｃｒｏｄ）及びバトロキソビン（ｂａｔｒｏｘｏｂｉ
    ｎ）からなる群より選ばれるものである請求項３２記載
    の方法。
  43. 【請求項４３】 トロンビン様酵素をフイブリンモノマ
    ーを含む組成物から、該トロンビン様酵素をビオチン化
    し、そしてフイブリンモノマーを含む該組成物を固定化
    したアビジンと接触させ、そこで該トロンビン様酵素を
    フイブリンモノマーを含む組成物より除去することによ
    るトロンビン様酵素の除去を更に包含する請求項３２記
    載の方法。
  44. 【請求項４４】 （ａ）所望の部位を非架橋フイブリン
    を含有する組成物と接触させ；そして（ｂ）該非架橋フ
    イブリンを該接触工程と同時に架橋フイブリンに変換す
    る；ことを特徴とするフイブリン密封剤の使用方法。
  45. 【請求項４５】 非架橋フイブリンが非架橋フイブリン
    Ｉ、デスＢＢフイブリン、及び非架橋フイブリンＩＩか
    らなる群より選ばれるものである請求項４４記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 非架橋フイブリンがフイブリンＩであ
    る請求項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 組成物が血液、フイブリノゲンを浸出
    する細胞培養又は組換えフイブリノゲンによって形成さ
    れる請求項４３記載の方法。
  48. 【請求項４８】 血液が自系の血液である請求項４７記
    載の方法。
  49. 【請求項４９】 変換工程が組成物をカルシウムイオン
    源と接触させることによって行われる請求項４４の方
    法。
  50. 【請求項５０】 フイブリンモノマーの濃度が１０ｍｇ
    ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであり、組成物のｐＨが１〜
    ５である非架橋フイブリンモノマーを含有する水性組成
    物。
  51. 【請求項５１】 フイブリンモノマーの濃度が２０ｍｇ
    ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである請求項５０記載の水性
    組成物。
  52. 【請求項５２】 フイブリンモノマーがフイブリンＩ、
    デスＢＢフイブリン及びフイブリンＩＩからなる群より
    選ばれるものである請求項５０記載の水性組成物。
  53. 【請求項５３】 フイブリンモノマーがフイブリンＩで
    ある請求項５２記載の水性組成物。
  54. 【請求項５４】 フイブリンモノマーの濃度が２０ｍｇ
    ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであるフイブリンモノマー水
    溶液。
  55. 【請求項５５】 フイブリンモノマーの濃度が２０ｍｇ
    ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである請求項５４記載の水性
    組成物。
  56. 【請求項５６】 フイブリンモノマーがフイブリンＩ、
    デスＢＢフイブリン及びフイブリンＩＩからなる群より
    選ばれるものである請求項５４記載の水性組成物。
  57. 【請求項５７】 フイブリンモノマーがフイブリンＩで
    ある請求項５６記載の水性組成物。
  58. 【請求項５８】 （ａ）フイブリンモノマー、及び
    （ｂ）カルシウムイオン源、を含有し、カルシウムイオ
    ン濃度が５ｍＭ〜２００ｍＭである水性組成物。
  59. 【請求項５９】 組成物が固型であることを特徴とする
    フイブリンモノマーを含有する組成物。
  60. 【請求項６０】 組成物がフイブリンモノマーを含有す
    る水溶液を凍結乾燥することにより形成される請求項５
    ９記載の組成物。
  61. 【請求項６１】 フイブリンモノマー、及び抗生物質、
    ヒスタミンＨ２−拮抗剤、抗癌剤、フイブロネクチン及
    びフイブリン溶解阻害剤からなる群より選ばれる化合物
    を含有する組成物。
  62. 【請求項６２】 （ａ）フイブリンモノマーを含有する
    組成物；及び（ｂ）アルカリ緩衝液及び蒸留水よりなる
    群より選ばれる組成物からなることを特徴とするキッ
    ト。
  63. 【請求項６３】 アルカリ緩衝液又は蒸留水がカルシウ
    ムイオン源を更に含有する請求項６２記載のキット。
  64. 【請求項６４】 （ａ）非架橋フイブリンを含む組成
    物；及び（ｂ）カルシウムイオン源を含む組成物からな
    ることを特徴とするキット。
  65. 【請求項６５】 活性化された第ＸＩＩＩ因子を更に含
    む請求項６４記載のキット。
  66. 【請求項６６】 フイブリンモノマーを含有する組成物
    を表面にもつ固型支持体。
  67. 【請求項６７】 固型支持体が包帯、縫合糸、人工器
    官、及び被覆剤からなる群より選ばれるものである請求
    項６６記載の固型支持体。
  68. 【請求項６８】 フイブリンモノマーがフイブリンＩ、
    デスＢＢフイブリン及びフイブリンＩＩからなる群より
    選ばれるものである請求項６６記載の固型支持体。
  69. 【請求項６９】 フイブリンモノマーがフイブリンＩで
    ある請求項６８記載の固型支持体。
  70. 【請求項７０】 組成物が固型である請求項６６記載の
    固型支持体。
  71. 【請求項７１】 組成物が、フイブリンモノマーを含有
    する水溶液を凍結乾燥することによって形成される請求
    項７０記載の固体支持体。
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