NO314412B1

NO314412B1 - Vandige blandinger, fibrinmonomerblandinger, fremgangsmate for fremstilling derav, samt utstyrsett og fast baerer

Info

Publication number: NO314412B1
Application number: NO19933624A
Authority: NO
Inventors: Peter Andrew David Edwardson; John Esam Fairbrother; Ronald Stephen Gardner; Derek Andrew Hollingsbee; Stewart Anthony Cederholm-Williams
Original assignee: Vivolution As
Priority date: 1992-10-08
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 2003-03-17
Also published as: CA2566574A1; BR9304185A; HU9302839D0; CA2108104A1; US5962420A; NZ280264A; DE69333080D1; NZ328064A; JP3771284B2; ES2065294A1; CA2510981A1; SG49640A1; PT592242E; EP0592242A1; US6048966A; EP1266666A2; NO933624L; CN1091315A; MX9306272A; DE69333080T2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører vandige blandinger, fibrinmonomerblandinger, fremgangsmåte for fremstilling derav, samt utstyrsett og fast bærer.

Én mekanisme for hemostase, dvs. forhindring av blodtap, hos et pattedyr er dannelse av en blodklump. Klumpdannelse hos mennesker, dvs. blodkoagulering, skjer ved hjelp av en kompleks kaskade av reaksjoner, hvor slutt-trinnene er omdannelse av fibrinogen - en monomer - ved innvirkning av trombin, kalsium-ioner og aktivert faktor XIII, idet det til slutt dannes tverrbundet fibrin Il-polymer, som er fibrinklumpen.

Dannelse av tverrbundet fibrin Il-polymer skjer ved at fibrinogenet omdannes ved innvirkning av trombin til fibrin I-monomer, som spontant polymeriseres under dannelse av fibrin I-polymer, som noen ganger omtales som løselig fibrin I på grunn av at fibrin I-polymeren ved behandling på hensiktsmessig kjemisk måte kan gjen-omdannes til fibrin I-monomer. Fibrin I-polymeren omdannes så ved innvirkning av trombin til fibrin Il-polymer, som noen ganger omtales som et løselig fibrin II på grunn av at fibrin II-polymeren ved behandling på hensiktsmessig kjemisk måte kan omdannes til fibrin II-monomer. Fibrin Il-polymeren blir så tverrbundet under innvirkning av faktor Xllla - kjent som aktivert faktor XIII - under dannelse av tverrbundet fibrin II, som er fibrinklumpen. Faktor XIII aktiveres ved innvirkning av trombin i nærvær av kalsium-ioner. Tverrbundet fibrin II omtales noen ganger som uløselig fibrin II på grunn av at det ikke kan omdannes til fibrin D-monomer.

Det skal bemerkes at trombin dannes fra protrombin. Protrombin omdannes til trombin ved innvirkning av faktor Xa i nærvær av kalsium og andre hjelpersubstanser.

Fibrinogen representerer ca. 2 - 4 g pr. liter av blodplasma-proteinet. Fibrinogen er en monomer som består av tre par disulfid-sammenbundne polypeptid-kjeder betegnet (Aotø, (BB)2, fl- "A" og "B" representerer de to små aminoterminale peptider, kjent som henholdsvis fibrinpeptid A og fibrinpeptid B. Spaltningen av fibrinpeptider A fra fibrinogen ved omdannelse av fibrinogen ved innvirkning av trombin resulterer i fibrin I-forbindelsen, og den etterfølgende spaltning av fibrinpeptider B resulterer i fibrin II-forbindelsen. Slik spaltning av fibrinpeptider A og B reduserer fibrinogens molekylvekt med en meget liten mengde, ca. 6.000 av 340.000 dalton, men polymeriseirngsstedene blir blottlagt. For en oversikt over mekanismene ved blodkoagulering og fibrinogens struktur, se CM. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49:765-811 (1980) og B. Furie og B.C. Furie, Cell, 53:505-518(1988).

Fibrinogenkomponenten som anvendes fremstilles ut fra blandede humanplasma. Fibrinogenet kan konsentreres fra det humane plasma ved hjelp av kuldeutfelling og utfelling med anvendelse av forskjellige reagenser, f.eks. polyetylenglykol, eter, etanol, ammoniumsulfat eller glycin. For en utmerket oversikt over fibrin tetningsmidler, se M. Brennan, Blood Reviews, 5:240-244 (1991); J.W. Gibble og P.M. Ness, Transfusion, 30:741-747 (1990); H. Matras, J. Oral Mazillofac Surg., 43:605-611 (1985) og R. Lemer ogN. Binur, J. of Surgical Research, 48:165-181 (1990).

En infeksjon kan overføres ikke bare via fibrinogenet, men også via den bovine aprotinin- og den bovine trombinkomponent. Bovint trombin har vært kjent for å være det infeksiøse middel bovint spongiform-encefallitt-(BSE)- og andre virus som er patogene for pattedyr. Videre er bovint trombin et potent antigen, som kan forårsake immunologiske reaksjoner hos mennesker. Anvendelse av bovint trombin kan således resultere i at mottakeren for det bovine trombin påvirkes på en uheldig måte. Se D.M. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A):141-146 (1991), S.B. Prusiner et al., Cornell Vet, 81, nr. 2: 85-96 (1991) og D. Matthews, J. Roy. Soc. Health, 3-5 (febr. 1991).

Det er følgelig behov for en blanding som kan gis til en pasient uten risiko for virusforurensning eller andre skadelig påvirkninger.

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en blanding som omfatter fibrinmonomer, ut fra fibrinogen, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) en blanding som omfatter fibrinogen, bringes i kontakt med et trombinliknende enzym under omdannelse av fibrinogenet til en ikke-tverrbundet fibrinpolymer; (b) den ikke-tverrbundne fibrinpolymer skilles fra blandingen som omfatter fibrinogen;

og

(c) den ikke-tverrbundne fibrinpolymer solubiliseres under dannelse av en blanding som omfatter fibrinmonomer.

Et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse angår en vandig blanding, kjennetegnet ved at den omfatter ikke-tverrbundet fibrinmonomer hvor konsentrasjonen av fibrin-monomer er fra ca. 10 mg/ml til ca. 200 mg/ml og blandingen har en pH på fra ca.l til ca.5.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en vandig blanding, kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) fibrinmonomer, og

(b) en kilde til kalsiumioner, hvor konsentrasjonen av kalsiumionene er fra ca. 5 mM til ca. 200 mM.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre blanding omfattende fibrinmonomer, kjennetegnet ved at blandingen er i fast form.

Det er videre beskrevet blanding, kjennetegnet ved at den omfatter fibrinmonomer og en forbindelse valgt fra gruppen som består av et antibiotikum, en histamin-H2-antagonist, et anti-kretfmiddel, fibronektin og en fibrinolytisk inhibitor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre utstyrsett, kjennetegnet ved at det omfatter:

(a) en blanding omfattende fibrinmonomer; og

(b) en blanding valgt fra gruppen som består av en alkalisk buffer og destillert vann.

Det er videre beskrevet utstyrsett, kjennetegnet ved at det omfatter:

(a) en blanding omfattende ikke-tverrbundet fibrin; og

(b) en blanding omfattende en kilde til kalsiumioner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også fast bærer, kjennetegnet ved at den på sin overflate har en blanding som omfatter fibrinmonomer.

For den foreliggende oppfinnelses formål anvendes følgende definisjoner: Fibrin Fibrin angir hvilken som helst form av fibrin. Ikke-begrensende eksempler

på fibrin innbefatter fibrin I, fibrin II og des-BB-fibrin. Fibrinet kan være i monomer eller polymer form, hvor den polymere form enten er ikke-tverrbundet eller tverrbundet.

Fibrinmonomer Fibrinmonomer innbefatter hvilken som helst form av fibrin, f.eks.

fibrin I, fibrin TJ eller des-BB-fibrin, hvor fibrinet er i monomer form eller oligomer form som kan solubiliseres i blandingen omfattende fibrinmonomer, og hvor fibrinmonomeren kan omdannes til fibrin-polymer.

Fibrinpolymer Fibrinpolymer innbefatter hvilken som helst form av fibrin, f.eks.

fibrin I, fibrin II eller des-BB-fibrin, hvor fibrinet er i polymer form, enten ikke-tverrbundet eller tverrbundet.

Ikke-tverrbundet fibrin Ikke-tverrbundet fibrin innbefatter hvilken som helst form av fibrin,

f.eks. fibrin I, fibrin II eller des-BB-fibrin, hvor fibrinet er ikke-tverrbundet og kan omdannes til tverrbundet fibrin. Det ikke-tverrbundne fibrin kan være fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin-polymer.

Tverrbundet fibrin Tverrbundet fibrin innbefatter hvilken som helst form av fibrin,

f.eks. fibrin I, fibrin II eller des-BB, hvor fibrinet er en fibrin-polymer som er tverrbundet.

4.1. Blandingen som omfatter fibrinmonomer

Fibrinblandingen ifølge den foreliggende oppfinnelse omfattende fibrinmonomer er en blanding som inneholder hvilken som helst form av fibrinmonomer som kan omdannes til fibrinpolymer. Dcke-begrensende eksempler på fibrinmonomer innbefatter fibrin I-monomer, fibrin II-monomer eller des-BB-fibrin-monomer, idet fibrin I-monomer er foretrukket. Blandinger av fibrinmonomeren kan selvfølgelig være til stede. For den foreliggende oppfinnelses formål innbefatter dessuten fibrinpolymer hvilken som helst polymer som er et resultat av polymerisering av fibrinmonomer. For eksempel kan således omdannelsen av fibrin I-monomer til fibrinpolymer resultere i fibrin I-polymer, tverrbundet eller ikke-tverrbundet, og/eller fibrin Il-polymer, tverrbundet eller ikke-tverrbundet, avhengig av hvordan omdannelsestrinnet utføres.

Fibrin I-monomer er foretrukket på grunn av at det, i motsetning til fibrinogen, lett kan omdannes til fibrinpolymer uten anvendelse av trombin eller faktor XIII. Fibrin I-monomeren kan faktisk spontant danne fibrin I-polymer, som kan virke som fibrinklumper, uansett hvorvidt fibrin I-polymeren er tverrbundet eller ikke-tverrbundet eller er omdannet videre til fibrin Il-polymer. Siden dannelsen av fibrin I-polymeren fra fibrin I-monomer er spontan, kan fibrin I-polymeren således dannes uten trombin og faktor XIII, hvorved man unngår problemene som er forbundet med bovint trombin. (Det skal bemerkes at hvis fibrin I-monomer anvendes slik at fibrin I-monomeren kommer i kontakt med pasientens blod, f.eks. på et sår, kan pasientens trombin og faktor XIII omdanne fibrin I-polymeren til tverrbundet fibrin Il-polymer.)

Blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, er en blanding som inneholder hvilken som helst form av ikke-tverrbundet fibrin. Dcke-begrensende eksempler på ikke-tverrbundet fibrin er ikke-tverrbundet fibrin I, ikke-tverrbundet fibrin II og des-BB-fibrin, idet ikke-tverrbundet fibrin I er foretrukket. Blandinger av ikke-tverrbundet fibrin kan selvfølgelig være til stede. For den foreliggende oppfinnelses formål innbefatter dessuten "tverrbundet fibrin" hvilken som helst form av fibrin som er et resultat av omdannelsen av ikke-tverrbundet fibrin til tverrbundet fibrin. Det tverrbundne fibrin, som f.eks. er et resultat av omdannelsen av ikke-tverrbundet fibrin I til tverrbundet fibrin, kan således være tverrbundet fibrin I og/eller tverrbundet fibrin JJ, avhengig av hvordan omdannelsestrinnet utføres.

Ikke-tverrbundet fibrin I er foretrukket på grunn av at det, sammenliknet med fibrinogen, lettere kan omdannes til tverrbundet fibrin. Det antas faktisk at fibrin I kan danne tverrbundet fibrin I, som kan virke som fibrintetningsmidlet. Dannelsen av det tverrbundne fibrin I fra ikke-tverrbundet fibrin I kan således utføres uten trombin, hvorved man unngår de problemer som er forbundet med bovint trombin, skjønt aktivert faktor XJJI kan være nødvendig. (Det skal bemerkes at hvis ikke-tverrbundet fibrin I anvendes slik at det ikke-tverrbundne fibrin I kommer i kontakt med pasientens blod, f.eks. på et sår, kan pasientens trombin og faktor XIII omdanne fibrin I til tverrbundet fibrin II).

Det ikke-tverrbundne fibrin kan dessuten være en polymer, oligomer eller monomer, skjønt en oligomer eller monomer er foretrukket, f.eks. fibrinmonomer. Dette skyldes det faktum at ikke-tverrbundet fibrin i polymer form vanligvis er en gel og derfor er meget vanskelig å avgi til det ønskede sted og gir mindre intim kontakt med celler på det ønskede sted. I motsetning til dette, er et resulterende ikke-tverrbundet fibrin i oligomer eller monomer form løselig og kan derfor lettere avgis til det ønskede sted, og har mer intim kontakt med cellene. Selvfølgelig kan blandingen inneholde en blanding av slike former av ikke-tverrbundet fibrin.

Kilden til blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin kan være hvilken som helst kilde som er kjent eller som kan utvikles så lenge fibrinmonomeren kan omdannes til fibrinpolymer, eller det ikke-tverrbundne fibrin kan omdannes til tverrbundet fibrin. Dcke-begrensende kilder til blandinger omfattende fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin er blod, fortrinnsvis blod fra pattedyr og enda mer foretrukket humant blod, cellekulturer som utsondrer fibrinogen og rekombinant fibrinogen, idet blod er fore-trakket. Blod kan være hvilken som helst form for blod, innbefattende f.eks. fullblod eller tillagede fibrinogenpreparater. Blod kan dessuten anvendes for fremstilling av et autologt fibrintetningsmiddel.

Det har vært observert at en blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin I, enten som fibrin I-monomer eller fibrin I-polymer, fremstilt utfra fullblod som beskrevet nedenfor, kan omdannes til tverrbundet fibrin II uten tilsetting av trombin, faktor XHI og andre nødvendige substanser for blodkoagulasjon. Det antas at dette skyldes det faktum at det i blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin I fremstilt utfra fullblod, er tilbake tilstrekkelige mengder av protrombin, faktor XUJ og slike andre nødvendige substanser fra plasmaet til at det ikke-tverrbundne fibrin I kan omdannes til tverrbundet fibrin U uten tilsetting av eksogent trombin og faktor XUJ. Dette endogene protrombin og faktor XIII kan anvendes i fibrintetningsmidlet ifølge den foreliggende oppfinnelse som komponenter i blandingen omfattende fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin.

Det skal imidlertid bemerkes at det ikke er tilbake tilstrekkelige mengder av dette endogene trombin og faktor XIH til omdannelse av fibrinogen til tverrbundet fibrin II ved en reaksjonshastighet som er egnet for et fibrintetningsmiddel. Det antas at mer trombin er nødvendig for omdannelse av fibrinogen til tverrbundet fibrin II enn for omdannelse av ikke-tverrbundet fibrin I til tverrbundet fibrin II ved ekvivalent reaksjonshastighet.

Hver av disse tre kilder inneholder fibrinogen, som kan omdannes til fibrin-monomeren eller ikke-tverrbundet fibrin. I tillegg til et slikt omdannelsestrinn, må den resulterende blanding som inneholder fibrinmonomeren eller ikke-tverrbundet fibrin, være i konsentrert form. Det er foretrukket at konsentrasjonen av fibrinmonomeren ikke er mindre enn ca. 10 mg/ml, mer foretrukket fra ca. 20 mg/ml til ca. 200 mg/ml, enda mer foretrukket fra ca. 20 mg/ml til ca. 100 mg/ml, og mest foretrukket fra ca. 25 mg/ml til ca.

50 mg/ml.

Blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, kan fremstilles ut fra blod. Fremgangsmåten kan resultere i en hydrogenbundet fibrinpolymer, som er en form for ikke-tverrbundet fibrin. En slik polymer kan så anvendes som en komponent i fibrintetningsmidlet eller omdannes til fibrin-monomer ved en fremgangsmåte som omtales som solubilisering, alt som beskrevet nedenfor. Det er også foretrukket at blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, fremstilles i sterilt miljø.

Blandinger som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, kan fremstilles ut fra fullblod ved at blod tas fra en donor, og fortrinnsvis i nærvær av en anti-koagulant. Hvilken som helst anti-koagulant kan anvendes. Dcke-begrensende eksempler på anti-koagulanter er heparin, EDTA, hirudin, citrat eller hvilket som helst annet middel som, direkte eller indirekte, kan forhindre dannelsen av trombin, idet citrat er foretrukket.

Plasmaet, som inneholder fibrinogenet, skilles så fra fullblodet. Hvilken som helst separasjons teknikk kan anvendes, f.eks. bunnfelling, sentrifugering eller filtrering. Sentrifugering kan utføres ved ca. 3.000 g. i ca. 10 minutter. Hvis det er ønskelig å oppnå plasma som er rikt på blodplater, kan imidlertid sentrifugeringen utføres ved lavere g.-kraft, f.eks. 500 g. i ca. 20 minutter. Supernatanten, som inneholder plasmaet, kan fjernes ved hjelp av standardteknikker.

Filtrering kan utføres ved at fullblodet ledes gjennom et egnet filter som skiller blodceller fra plasma. Det er foretrukket at filteret er en mikroporøs membran som gir god proteinoverføring.

Det resulterende plasma behandles så under omdannelse av fibrinogenet til fibrin-monomer eller ikke-tverrbundet fibrin. Denne omdannelse kan utføres ved hjelp av hvilken som helst teknikk som er kjent eller som kan utvikles.

En foretrukket teknikk for fremstilling av fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin er ved hjelp av et trombinliknende enzym, som innbefatter trombin. Et trombin-liknende enzym er hvilket som helst enzym som kan katalysere dannelsen av fibrin fra fibrinogen. En vanlig kilde til trombinliknende enzymer er slangegift. Det trombinliknende enzym renses fortrinnsvis fra slangegiften. Avhengig av valget av trombinliknende enzym, kan slikt trombinliknende enzym frigi fibrinpeptid A - som danner fibrin I - fibrinpeptid B - som danner des-BB-fibrin - eller både fibrinpeptid A og B - som danner fibrin II. Det skal bemerkes at de trombinliknende enzymer som frigir fibrinpeptid A og B, kan gjøre dette ved forskjellige hastigheter. Den resulterende blanding kan således f.eks. være en blanding av fibrin II og fibrin I eller en blanding av fibrin II og des-BB-fibrin.

Tabell 1 er en ikke-begrensende liste over kildene til de slangegifter som kan anvendes ved den foreliggende oppfinnelse, navnet på det trombinliknende enzym og hvilket fibrinpeptid (hvilke fibrinpeptider) som frigjøres ved behandling med enzymet.

Fibrinmonomeren eller det ikke-tverrbundne fibrin kan fremstilles ved at plasmaet bringes i kontakt med det trombinliknende enzym, hvorved fibrinogenet i plasmaet kan omdannes til en fibrinmonomer. Den resulterende fibrinmonomer polymeriseres imidlertid spontant under dannelse av en hydrogenbundet polymer i form av en gel, som utskilles fra det gjenværende serum, som er en løsning. Gelen er en form av blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin.

Denne ikke-tverrbundne fibringel kan høstes f.eks. ved sentrifugering (3.000 g. i 10 minutter), direkte manuell separasjon av det ikke-tverrbundne fibrin fra serumet, filtrering, direkte eller under trykk, fulgt av fjerning av det fraskilte serum. (Et filter med pore-størrelse 1-100 fim kan anvendes, f.eks. et sintrert polypropylenfilter med porestørrelse 20 fim fra Porex, Inc., et teflonfilter med porestørrelse 20 - 70 /im fra Fluorotechniques, Inc., eller et nylon 66-filter med porestørrelse 22-46 fim fra Costar, Inc.).

Denne høsting skiller den ikke-tverrbundne fibringel fra serum, som er en løsning, og konsentrerer derved den ikke-tverrbundne fibringel i forhold til plasmaet. Det skal bemerkes at den ikke-tverrbundne fibringel bibeholder minst en del protrombin, faktor XUJ, og slike andre nødvendige substanser fra plasmaet, slik at det ikke-tverrbundne fibrin I-kan omdannes til tverrbundet fibrin II uten tilsetting av eksogent trombin eller faktor XIII. Dette endogene protrombin og faktor XIH kan anvendes som komponenter i blandingen omfattende fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin.

Kraften av sentrifugering eller trykket av filtrering under høsting vil bestemme hvor mye av serumet som fjernes fra den ikke-tverrbundne fibringel; jo høyere kraften eller trykket er, dess mer konsentrert blir den resulterende ikke-tverrbundne fibringel. Det er imidlertid foretrukket at denne kraft eller dette trykk ikke er så stort av protrombinet og faktor XUJ fjernes fra den ikke-tverrbundne fibringel.

Den ikke-tverrbundne fibringel kan anvendes som en komponent i blandingen omfattende ikke-tverrbundet fibrin. Det er blitt observert at når en slik blanding fremstilles utfra fullblod, er fra ca. 60 til ca. 90% av det opprinnelige fibrinogen til stede i blandingen, men selvfølgelig i form av et ikke-tverrbundet fibrin.

Blandingen som omfatter det ikke-tverrbundne fibrin, kan anvendes umiddelbart etter at den er fremstilt. Det er faktisk spesielt foretrukket å anvende en slik blanding umiddelbart etter fremstillingen av den når blandingen er autolog. Hvis blandingen ikke anvendes umiddelbart etter fremstillingen, kan blandingen oppbevares. Oppbevaring av blandingen fordrer at blandingen konserveres f.eks. ved frysing eller frysetørking av blandingen eller ved at blandingen holdes ved 4°C. Blandingen vil i frosset eller frysetørket form være stabil i månedsvis. Når blandingen holdes ved 4°C, antas det at blandingen er stabil i minst flere dager.

Hvis blandingen fryses, må den tines før tidspunktet for anvendelse.

Denne teknikk, som resulterer i dannelse av den ikke-tverrbundne fibringel, omdanner fibrinogenet til den ikke-tverrbundne fibringel og konsentrerer en slik gel i hovedsakelig ett trinn. Alternativt, og mindre foretrukket, kan man konsentrere fibrinogen ved hjelp av vanlige teknikker, f.eks. kuldeutfelling og utfelling under anvendelse av forskjellige reagenser, f.eks. polyetylenglykol, eter, etanol, ammoniumsulfat eller glycin. Det konsentrerte fibrinogen kan så omdannes til den ikke-tverrbundne fibringel. Ved de teknikker som er beskrevet ovenfor, eller fortrinnsvis, siden fibrinogenet allerede er konsentrert, kan fibrinogenet omdannes til en blanding omfattende fibrinmonomer uten behov for at man først danner den ikke-tverrbundne fibringel. Dette kan utføres ved at det konsentrerte fibrinogen bringes i kontakt med et kaotropisk middel under oppnåelse av en fibrinogenløsning.

Det kaotropiske middel er nødvendig for forhindring av at fibrinmonomeren, som dannes ved kontakt mellom fibrinogenet og det trombinliknende enzym, polymeriseres spontant. Det kaotropiske middel blandes med en slik fibrinogenblanding og agiteres deretter i ca. 1 - 2 minutter under dannelse av fibrinogenløsningen. Fibrinogenet kan så omdannes til en fibrinmonomer f.eks. ved hjelp av et trombinliknende enzym, som beskrevet ovenfor, eller ved hjelp av et trombinliknende enzym som er gjort ubevegelig på en bærer, som beskrevet nedenfor.

Egnede kaotropiske midler innbefatter urea, natriumbromid, guanidinhydroklorid, KCNS, kaliumjodid og kaliumbromid. Den foretrakkede konsentrasjon av det kaotropiske middel er fra ca. 0,2 til ca. 6,0 molar og mest foretrukket fra ca. 0,3 til ca. 2,0 molar. Det er foretrukket å anvende den minst mulige mengde av kaotropisk middel som likevel forhindrer fibrinmonomeren fra å polymeriseres spontant.

Det skal bemerkes at det er foretrukket at en kilde til kalsiumioner ikke tilsettes til det kaotropiske middel før det er ønskelig å omdanne fibrinmonomeren til fibrinpolymer, som beskrevet nedenfor. Dette sikrer at fibrinmonomeren ikke vil tverrbindes på grunn av aktivering av eventuelle endogene blodkoagulasjonsfaktorer.

Det trombinliknende enzym bør bli gjort ubevegelig på en bærer. Man kan lett skille det ubevegeliggjorte enzym fra plasmaet, hvorved man hindrer at blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, forurenses med enzymet.

En bærer som det trombinliknende enzym kan festes til, kan anvendes ved den foreliggende oppfinnelse. Dcke-begrensende eksempler på egnede bærere er cellulose, polydekstraner, agarose, polystyrener, silika, polyakrylsyrer, polyakrylamider, polyvinylalkoholer, glassperler, polytetrafluoretylen, polykarbonat, kollagen, cellulosederivater og teflon og kompositter av disse, idet silika, polystyren og agarose er foretrukket, og agarose er mest foretrukket.

Det trombinliknende enzym kan festes til en bærer som er et filter, eller på én side av filteret og festet til en annen bærer, f.eks. en perle. Ellers vil det trombinliknende enzym gå gjennom filteret. Filterets porestørrelse bør således være slik at det ubevegeliggjorte trombinliknende enzym ikke kan gå gjennom filteret, men at det ikke-tverrbundne fibrin kan gå gjennom filteret. Det ikke-tverrbundne fibrin fremstilles ved at plasmaet bringes i kontakt med det trombinliknende enzym på én side av filteret under dannelse av en fibrin-monomer, som, sammen med resten av plasmaet, går gjennom filteret. Den resulterende blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, skilles således nødvendigvis fra det trombinliknende enzym. Etter at fibrinmonomeren har passert gjennom filteret, polymeriseres den spontant under dannelse av en ikke-tverrbundet fibrinpolymer.

For ubevegeliggjøring av det trombinliknende enzym på en bærer, må bæreren være aktivert. Dette kan utføres ved hjelp av hvilken som helst egnet teknikk. Forskjellige kjemiske midler som er tilgjengelige for derivatisering av bærere er f.eks.: Diazonium-grupper, isocyanatgrupper, syrekloridgrupper, syreanhydirdgrupper, sulfonylkloirdgrupper, dinitrofluorfenylgrupper, isotiocyanatgrupper, hydroksylgrupper, aminogrupper, n-hydroksysuksinimidgrupper, triazingrupper, hydrazingrupper, karbodiimidgrupper, silangrupper og cyanogenbromid. Se (a) Pentapharm Patent DT 2 440 254 AI; (b) P.D.G. Dean, W.S. Johnson og F.A. Middle (red.) (1991) IRL Press Oxford - Affinity Chromatography - A Practical Approach - kap. 2 - Activation Procedures, hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse.

Den foretrukkede aktiveringskjemi er ved hjelp av en hydrazidgruppe. Anvendelse av en hydrazidaktivert bærer resulterer i at en maksimal prosentandel [minst fra ca. 30 til ca. 50%, målt ved hjelp av S2238-analysen - se G. Axelsson et al., Thromb. Haemost., 36:517 (1976)] av det trombinliknende enzym beholder sin aktivitet med hovedsakelig intet enzymtap. Lave pH-verdier, f.eks. pH 4 - 6, kan dessuten anvendes for enzymkopling for forhindring av enzymnedbrytning.

Vanligvis aktiveres bæreren med en sterkt reaktiv forbindelse, som deretter reagerer med en funksjonell gruppe i en ligand, f.eks. -OH, -NH2, -SH, -COOH, -CHO, under dannelse av en kovalent binding. De foretrukkede aktiveringskjemier for anvendelse ved den foreliggende oppfinnelse er: (a) ved hjelp av en triazingruppe og fortrinnsvis triazinhalogenidgrupper; (b) ved hjelp av en tresylkloridgruppe; (c) ved hjelp av en karbonyldiimidazolgruppe;

(d) ved hjelp av en cyanogenbromidgruppe; og

(e) ved hjelp av en hydrazid- eller aminogruppe.

I (a) - (d) koples proteinet via reaksjon med -NH2-, -SH- eller -OH-grupper, mens proteinet i (e) koples via en oksydert karbohydratdel, dvs. -CHO. Anvendelse av disse kjemiteknikker resulterer i at en maksimal prosentandel (minst fra ca. 30 til ca. 50%, målt ved S2238-analyse) av det trombinliknende enzym beholder sin aktivitet med hovedsakelig intet enzymtap.

For triazinaktivering ble det anvendt to forskjellige fremgangsmåter. Den første fremgangsmåte innbefattet at triazin-ringen ble direkte knyttet til overflate-OH-grupper. Dette er likt den anvendte CNBr-aktiveirngsmetode, hvor overflate-diol-grupper ble omsatt med CNBr. For triazinaktivering ble OH-grupper i agarose omsatt med triazin (cyanurinklorid).

Vanligvis aktiveres bæreren ved hjelp av en sterkt reaktivt forbindelse, som deretter reagerer med en funksjonell gruppe i liganden, f.eks. -OH, -NH2, -SH eller -CHO, under dannelse av en kovalent binding. Gjenværende aktive grupper, som ikke har noe trombin-liknende enzym tilknyttet, kan, men ikke nødvendigvis, være blokkert med ikke-reaktive forbindelser, så som etanolamin, eddiksyreanhydrid eller glycin.

De foretrukkede aktiveringskjemiteknikker for anvendelse her er:

(a) Cyanogenbromidaktivering, fulgt av direkte kopling av enzym via -NH2"8ruPPer P&

proteinet.

(b) Aktivering av bæreren med monoklortriazin, fulgt av kopling av et enzym via

-NH2-, -OH- eller -SH-grupper.

(c) Aktivering av bæreren med diklortriazin, fulgt av kopling av enzymet via -NH2-,

-OH- eller -SH-grupper.

(d) Tresylkloridaktivering av bæreren, fulgt av kopling av enzymet via -NH2, -OH eller

-SH.

(e) Aktivering av bæreren med adipinsyrehydrazid eller hydrazin, fulgt av kopling av

oksydert enzym via -CHO-grupper.

(f) Aktivering av bæreren med en aminoligand, fulgt av kopling av oksydert enzym via

-CHO-grupper.

Ved alle de ovennevnte foretrukkede metoder anvendes det agarose som bærer, men det er mulig å anvende silika. Ved anvendelse av denne bærer er de foretrukkede aktiveringskjemiteknikker: (a) Garnma-glycidoksypropyltirmetoksysilan-aktivering med direkte kopling av det

trombinliknende enzym via -NH2-grupper på proteinet.

(b) Cyanogenbromid-aktivering, fulgt av direkte kopling av enzym via -NH2~SruPPer

på proteinet.

(c) Gamma-glycidoksytrimetoksysilan-aktivering, fulgt av åpning av epoksydringen under dannelse av en diolgruppe, som deretter kan aktiveres med cyanogenbromid.

Direkte kopling av enzymet kan oppnås via -NH2-grupper på proteinet.

(d) Gamma-glycidoksypropyltirmetoksysilan-aktivering, fulgt av fremstilling av

aminosilika ved behandling med ammoniakkløsning.

Aminosilika-forbindelsen kan deretter aktiveres med cyanurinklorid (triazin) og enzymet koplet via -NH2~> -OH- eller -SH-grupper.

Kopling av enzymet til den aktiverte bærer må bufres ved en viss pH-verdi for oppnåelse av optimal enzymbinding. Med standardaktiveringsteknikker, så som gamma-glycidoksypropyltrimetoksysilan-kopling av enzym til aktivert bærer, og cyanogenbromid-kopling av hvilket som helst protein til aktive grupper, fordres vanligvis bufring ved en pH-verdi som er 1 - 2 enheter høyere enn pKa for de primære og sekundære aminer i enzymet. Anvendelse av cyanurinklorid som aktivator muliggjør imidlertid anvendelse av buffere med mye lavere pH (optimal koplings-pH er 4 - 6). En annen fremgangsmåte for kopling av glykoproteiner, så som batroksobin, til en inert bærer er via deres karbohydrat-deler. Dette innbefatter først oksydering av sukkergruppen til -CHO-grupper, fulgt av direkte kopling ved sur pH til en aminogruppe. så som hydrazid. Et vidt område av koplingsbuffere kan anvendes. Se f.eks. tabell 2.

Etter aktivering vil bæreren ha flere aktive steder enn det som er nødvendig for enzymkopling. Disse steder kan, hvis de ikke deaktiveres, kovalent binde forurensende proteiner, som kan påvirke den biologiske funksjon av det ubevegeliggjorte enzym.

Overskuddsgrupper kan deaktiveres ved kovalent kopling av små, ikke-innvirkende aminer, så som etanolamin.

Hvis hydrazid- eller aminoaktiverte bærere anvendes, kan blokkering av reaktive restgrupper etter enzymkopling oppnås ved anvendelse av eddiksyreanhydrid.

Avhengig av metoden for ubevegeliggjøring og av bæreren, skjer enzym-inaktivering i løpet av ubevegeliggjøirngsprosessen. Anvendelse av en silikabærer med det mest ønskelige aktiveringskjemikalie (f.eks. cyanogenbromid) tapes ved opptil 80 - 90% enzymaktivitet. Anvendelse av agarose som bærer, med cyanurinkloirdaktivering, resulterer imidlertid i mindre tap av enzymaktivitet.

For karakterisering av effektiviteten av det ubevegeliggjorte enzym på bæreren, kan det anvendes to metoder for fastsettelse av mengden aktivt enzym som er gjort ubevegelig på bæreren; klump-tid-analysen ("Got Time Assay") A. Clauss, Acta Haematol., 17:237

(1957) og S2238-analysen - se G. Axelsson et al., Thromb. Haemost., 36:517 (1976).

For vurdering av utvasking av enzymet fra bæreren kan følgende analyse anvendes.

Utvasking kan analyseres ved radiomerking av det trombinliknende enzym, f.eks. <125>1-batroksobin. Før utførelse av utvaskingsanalysen, er det imidlertid nødvendig å fjerne eventuelt ubundet radioaktivt merkemateriale. Dette kan oppnås ved hjelp av sekvensiell vasking av bæreren med: 50 ml 50 mM natriumacetat pH 5,5,100 ml 50 mM glycin/l M natriumklorid pH 3,0,100 ml 50 mM natriumkarbonat/1 M natriumklorid pH 10,0,100 ml 50 mM natriumfosfat/1 M natriumklorid pH 7,0,100 ml vann og 100 ml 50 mM natriumfosfat/1 M natriumklorid pH 7,0. Etter en slik vaskeprosess var det intet påvisbart radioaktivt merkemateriale i vaskevæskene, idet >50% av det radioaktivt merkede begynnelses-enzym var koplet til bæreren,

(a) Nodvendig en^ ymTnengHfi

Den nødvendige enzymmengde for behandling av 30 - 70 ml plasma (fra 60-150 ml fullblod) er 30 - 200 enheter etter ca. 10 -15 minutters blanding.

Hvis agarose anvendes som bærermatriks, resulterer 30 - 200 enheter E batroksobin i dannelse av ikke-tverrbundet fibrin innen ca. 7-20 minutter. Ved dette system anvendes hydrazidaktivering og 0,25 g -1,0 g tørr agarose. I dette tilfelle er det ikke nødvendig med noen blokkering av gjenværende aktive grupper.

(b) Omsetting av lihevegeHggjrtrt en/ym med plasmafthrinngen

Omsetting av det ubevegeliggjorte enzym med fibrinogen i plasma utføres generelt som følger: Ca. 30 - 70 ml plasma tilsettes til en kjent mengde av en tørket bærer, som inneholder det ubevegeliggjorte trombinliknende enzym. Suspensjonen blandes forsiktig (rotering på en spiralblander eller blanding for hånd) i ca. 7 - 20 minutter. I løpet av dette tidsrom spaltes fibrinogen i plasma ved hjelp av det ubevegeliggjorte enzym under fri-gjøring av fibrinpeptid A og/eller fibrinpeptid B, hvilket resulterer i dannelse av en hydrogenbundet fibrin I-polymer, hydrogenbundet des-BB-fibrin-polymer eller hydrogenbundet fibrin Il-polymer, hvor hver polymer er forbundet med det ubevegeliggjorte enzym.

Som beskrevet ovenfor, er den hydrogenbundne fibrinpolymer i form av en gel og kan høstes f.eks. ved sentrifugering (3.000 g. i 10 minutter) eller filtrering (gjennom et 1 - 50 fim membranfilter). Slik høsting skiller den hydrogenbundne fibrinpolymer fra serum og konsentrerer derved polymeren.

Det skal bemerkes at hvis det anvendes et trombinliknende enzym i plasma som resulterer i aktivering av faktor XIII, er det foretrukket at plasmablandingen modifiseres på det tidspunkt hvor det trombinliknende enzym anvendes, for forhindring av at det ikke-tverrbundne fibrin, f.eks. ikke-tverrbundet fibrin I eller IL danner tverrbundet fibrin, f.eks. tverrbundet fibrin I eller II. Det er selvfølgelig kanskje ikke nødvendig å modifisere plasmablandingen hvis denne blanding anvendes som fibrintetningsmiddel umiddelbart etter at fibrinogenet er blitt omdannet til ikke-tverrbundet fibrin.

Plasmablandingen kan modifiseres under forhindring av tverrbinding av det ikke-tverrbundne fibrin ved hjelp av hvilken som helst teknikk som er kjent eller som kan utvikles. Dette kan utføres ved blokkering av det endogene trombin som kan aktivere faktor XUJ, f.eks. hirudin- eller trombininhibitorer, eller ved blokkering av virkningen av aktivert faktor XIII, f.eks. ved hjelp av tungmetaller (Hg), tiomerosal eller inhiberende antistoffer. Tverrbinding av fibrin I eller II fordrer tilstedeværelse av kalsiumioner. Hvis kalsiumet fjernes fra plasmablandingen, kan således tverrbinding av fibrin I eller II inhiberes. Se Carr et al., J. Biochem., 239:513 (1986); Kaminski et al., J. Biol. Chem. 258:10530 (1983) og Kanaide et al. 13:229 (1982). Kalsium-chelatdannere kan tilsettes til blandingen for forhindring av tverrbinding av fibrin I eller II. Slike chelatdannere bindes til kalsiumet, hvorved tverrbindingen forhindres. Hvilken som helst kalsium-chelatdanner kan anvendes. Ikke-begrensende eksempler på kalsium-chelatdannere innbefatter citronsyre, sakkarinsyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), nitriltrieddiksyre (NTA), hydroksyetylendiamin-trieddiksyre (HEEDTA), etylendiamindi-(o-hydroksyfenyleddiksyre) (EDDHA), etylen-glykolbis-(2-aminoetyleter)-tetra-eddiksyre (EGTA), dietylentriaminpenta-eddiksyre (DTP A), 1,2-diaminocykloheksantetraeddiksyre (DCTA), N,N-bishydroksyetylglycin, 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetan-sulfonsyre (HEPES) og N-hydroksyetylimino-eddiksyre (HIMDA) og salter derav, idet salter av citronsyre er foretrukket.

Hvilken som helst cellekultur som kan utsondre fibrinogen kan anvendes ved den foreliggende oppfinnelse. Fibrinogenet i cellekulturen kan omdannes til fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin ved de samme teknikker som den som er beskrevet ovenfor når det gjelder plasma. Før denne omdannelse er det imidlertid foretrukket at cellerester fjernes

Fremgangsmåten kan utføres som følger: HEPG2-celler dyrkes og opprettholdes som beskrevet i standardtekster som gjelder pattedyrcellekultur. Se også Liu et al., Cytotechnology, 5:129-139 (1991). Cellene utsås i kolber i et delingsforhold på mellom 1 : 4 og 1 : 8 i Minimal Essential Medium inneholdende 10% kalveserum og bufret med 5% C02.

Etter 24 - 36 timers vekst ved 37°C fjernes mediet og erstattes med serumfritt medium inneholdende en egnet proteaseinhibitor og 2 TE/ml heparin. Dyrkningen fortsettes i ytterligere 24 timers tidsrom med 3 etter hverandre følgende utskiftninger av serumfritt medium.

Det kondisjonerte medium sentrifugeres ved 3.000 g i 10 minutter under fjerning av eventuelle cellerester, og den klarede supematant, som inneholder fibrinogen, blandes så forsiktig med et trombinliknende enzym i 4 - 5 timer. Det trombinliknende enzym blir fortrinnsvis gjort ubevegelig. Et forhold på fra ca. 1,0 ml til ca. 50 ml fastsatt volum agarose-trombinliknende enzym pr. 500 ml medium er passende. Som beskrevet ovenfor, kan det anvendes andre bærere enn agarose. Den resulterende fibrinmonomer polymeriseres spontant og vikles rundt den ubevegelige bærer.

Supernatanten, som nå ikke inneholder noe fibrinogen, dekanteres fra bæreren/ fibringelen, som så vaskes suksessivt med fire skiftinger av NaCl - 0,15 M i et forhold på fra ca. 10 ml til ca. 100 ml pr. 1,0 ml opprinnelig fastsatt volum av bærer. Den vaskede gel blir så halvveis dehydratisert under anvendelse av en sintret glasstrakt under vakuum.

Anvendelse av cellekulturer som kan utsondre fibrinogen, er spesielt foretrukket når det anvendes en blanding som omfatter en fibrinmonomer. Dette er på grunn av at det antas at en slik blanding kan anvendes for dannelse av en fibrinpolymer som er egnet som fibrin-tetningsmiddel, uansett om fibrinpolymeren til slutt tverrbindes. Siden en slik cellekultur ikke inneholder faktor XIII, som er nødvendig for tverrbinding, behøver det således ikke tilsettes noe eksogen faktor Xm for dannelse av et effektivt fibrintetningsmiddel.

Den ikke-tverrbundne fibrinblanding kan også fremstilles ut fra rekombinant fibrinogen. Først i det siste er fibrinogen blitt fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Se S. Roy et al., The Journal of Biological Chemistry, 266:4758-4763 (1991), hvis innhold er medtatt i det foreliggende som referanse. Roy et al. ser ut til å være den første gruppe som uttrykker alle de tre kjeder av fibrinogen og lærer at COS-celler uttrykker, setter sammen og utsondrer kjedene i en form som er i stand til å danne en fibrinbevirket klump. Den resulterende fibrinogenblanding kan så anvendes for fremstilling av blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin ved hjelp av de samme teknikker som beskrevet ovenfor med hensyn til cellekulturer som utsondrer fibrinogen. Det er imidlertid foretrukket at cellerestene, før dannelse av blandingen omfattende fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, fjernes ved hjelp av de samme teknikker som beskrevet ovenfor med hensyn til cellekulturer. Cellerestene kan fjernes ved sentrifugering eller filtrering.

Anvendelsen av rekombinant fibrinogen er spesielt foretrukket når det anvendes en blanding som omfatter en fibrinmonomer. Dette er på grunn av at det antas at en slik blanding kan anvendes for dannelse av en fibrinpolymer som er egnet som fibrintetningsmiddel, uansett hvorvidt fibrinpolymeren til slutt tverrbindes eller ikke. Siden cellekulturen med rekombinant fibrinogen ikke inneholder faktor XJJJ, som er nødvendig for tverrbinding, behøver det ikke tilsettes noe endogen faktor XUI for dannelse av et effektivt fibrintetningsmiddel.

Omdannelse av fibrinogen til ikke-tverrbundet fibrin, f.eks. ved et trombinliknende enzym, resulterer i dannelse av fibrinet i form av en fibrinhydrogenbundet polymer. Som omtalt ovenfor, er det imidlertid foretrukket at blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, og det er nødvendig for blandingen som omfatter fibrinmonomer, er i oligomer eller monomer form. Dette kan utføres ved solubilisering av blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin.

Solubilisering er spesielt foretrukket når det ikke-tverrbundne fibrin dannes ved hjelp av et trombinliknende enzym som er gjort ubevegelig på en bærer. Dette skyldes det faktum at anvendelse av et trombinliknende enzym som er gjort ubevegelig på en bærer, vanligvis resulterer i at den ikke-tverrbundne hydrogenbundne fibrinpolymer knyttes sammen med et slikt ubevegeliggjort enzym. Siden det er foretrukket at bæreren ikke bindes i den resulterende blanding, gjør således solubilisering det mulig at man også kan fjerne bæreren fra blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, sammen med det ubevegeliggjorte enzym.

Solubilisering kan utføres ved hjelp av hvilken som helst teknikk som er kjent eller som kan utvikles, og som resulterer i en fibrinmonomer. Solubilisering kan utføres ved at blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin bringes i kontakt med en egnet syrebuffer-løsning, fortrinnsvis en syrebuffer med en pH på under ca. 5 og fortrinnsvis fra ca. 1 til ca. 5. Dcke-begrensende eksempler på egnede syrebufferløsninger innbefatter eddiksyre, ravsyre, glukuronsyre, cysteinsyre, krotonsyre, itakonsyre, glutaminsyre, maursyre, asparginsyre, adipinsyre og salter derav, idet ravsyre, asparginsyre, adipinsyre og salter av eddiksyre er foretrukket, og mest foretrukket er natriumacetat. Det er blitt observert at de foretrukkede syrebuffere hadde mye mer effektiv virkning enn andre syrebuffere som ble undersøkt.

Den foretrukkede konsentrasjon av syrebufferen er fra ca. 0,02 M til ca. 1 M og mest foretrukket fra ca. 0,1 M til ca. 0,3 M. En slik foretrukket konsentrasjon gjør blandingens ionestyrke mer biologisk forenlig.

Det er foretrukket å anvende det minst mulige volum av syrebuffer som likevel solubiliserer det ikke-tverrbundne fibrin under dannelse av en vandig løsning som omfatter fibrinmonomer. Dette resulterer i en vandig løsning omfattende fibrinmonomer som er sterkt konsentrert når det gjelder fibrinmonomer. Vanligvis er det nødvendig med fra ca. 1 til ca. 4 ml syrebuffer pr. ca. 1 ml blanding omfattende ikke-tverrbundet fibrin.

Syrebufferen blandes med det ikke-tverrbundne fibrin og agiteres deretter kraftig i ca. 1 - 2 minutter for å sikre at solubiliseringen er fullstendig.

Solubilisering kan også utføres ved nøytral pH ved hjelp av et kaotropisk middel. Egnede kaotropiske midler innbefatter urea, natriumbromid, guanidinhydroklorid, KCNS, kaliumjodid og kaliumbromid. Den foretrukkede konsentrasjon av det kaotropiske middel er fra ca. 0,2 til ca. 6,0 molar, og mest foretrukket fra 3,5 til ca. 5,0 molar.

Som for syrebufferen, er det foretrukket å anvende den minst mulige mengde av kaotropisk middel som likevel solubiliserer det ikke-tverrbundne fibrin. Vanligvis er det nødvendig med fra ca. 1,0 til ca. 1,5 ml kaotropisk middel pr. ca. 1 ml blanding omfattende ikke-tverrbundet fibrin.

Det kaotropiske middel blandes med en slik blanding og agiteres deretter kraftig i ca. 1 - 2 minutter for å sikre at solubiliseringen er fullstendig.

Følgelig resulterer solubilisering i en blanding som omfatter en fibrinmonomer, og spesielt en vandig løsning som omfatter fibrin-monomer. Det er foretrukket at fibrin-monomerkonsentrasjonen i den vandige løsning ikke er mindre enn ca. 10 mg/ml, mer foretrukket fra ca. 20 mg/ml til ca. 200 mg/ml, enda mer foretrukket fra ca. 20 mg/ml til ca. 100 mg/ml, og mest foretrukket fra ca. 25 mg/ml til ca. 50 mg/ml.

Hvis det anvendes et trombinliknende enzym som er blitt gjort ubevegelig på en bærer, som resulterer i at et slikt enzym er til stede i blandingen omfattende ikke-tverrbundet fibrin, kan det ubevegeliggjorte enzym etter solubilisering fjernes fra blandingen som omfatter fibrin-monomeren. Dette kan f.eks. utføres ved filtrering gjennom hvilket som helst egnet filter som kan fraskille enzymet. Egnede filt ere innbefatter et sintret polypropylenfilter med porestørrelse 20 nm fra Porex, Inc., et teflonfilter med porestørrelse 20 - 70 fim fra Fluorotechniques, Inc., eller et filter av typen nylon 66 med porestørrelse 22

- 46 pm fra Costar, Inc.

En alternativ fremgangsmåte for å sikre at det ikke er til stede noe trombinliknende enzym, f.eks. batroksobin, i blandingen som omfatter fibrinmonomer, er å anvende et løselig trombinliknende enzym i systemet og fjerne enzymet etter solubilisering av den hydrogenbundne fibrinpolymer. Fjerning av enzymet kan oppnås ved anvendelse av en affinitetsmatriks, f.eks. en ligand bundet til en inert bærer som har spesifikk affinitet for det trombin-liknende enzym eller en ionebytter- eller hydrofob-innvirknings-bærer eller mest effektivt under anvendelse av avidin-biotin-systemet. Biotin-avidin-vekselvirkningen har én av de sterkeste ikke-kovalente bindingskonstanter (Kots = 10"^ M) som sees i naturen. Se E.A. Bayer og M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, 26:1 (1980).

Ved denne fremgangsmåte er biotin kovalent bundet til f.eks. batroksobin, og biotin-batroksobin-konjugatet (som er løselig) omsettes direkte med plasma, f.eks. 10 BU pluss 50 ml plasma omsatt ved 37°C i 10 minutter. Den dannede fibrin I-polymer høstes ved sentrifugering eller filtrering og solubiliseres på nytt i ca. 4 ml 0,2 M natriumacetat pH 4,0 inneholdende 30 mM kalsiumklorid. Til fibrin I-løsningen tilsettes et molart overskudd av avidin koplet til en inert bærer så som agarose. Agarose:avidin:biotin-batroksobin-komplekset skilles så fra fibrin I ved sentrifugering eller filtrering, hvilket resulterer i en blanding som omfatter fibrinmonomer som er hovedsakelig fri for batroksobin, og som kan polymeriseres på nytt som beskrevet nedenfor under dannelse av et fibrintetningsmiddel.

Ved én utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er blandingen som omfatter fibrinmonomer, hovedsakelig fri for det trombinliknende enzym. Med "hovedsakelig fri"

menes enten at alt det trombinliknende enzym er blitt fjernet, eller at alt trombinliknende enzym som er tilbake i blandingen, finnes i nivåer som er utilstrekkelige til frembringelse av en uønsket farmakologisk effekt. Blandinger ifølge denne oppfinnelse som man ønsker skal være "hovedsakelig fri", kan således inneholde trombinliknende enzym i en mengde på mellom ca. 0 og 10% av det opprinnelige enzym, og fortrinnsvis mellom ca. 0 og 2% av det trombinliknende enzym anvendt til fremstilling av fibrinmonomerblandingen.

Skjønt disse utførelsesformer beskriver blandinger hvor det trombinliknende enzym er blitt fjernet etter den ønskede omdannelse til løselig fibrin, er blandinger hvor det er tilbake størstedelen av alt det trombinliknende enzym, også antatt å være egnede, og er som sådanne en del av den foreliggende oppfinnelse.

Blandingen som omfatter fibrinmonomeren, kan anvendes umiddelbart etter at den er fremstilt. Det er faktisk spesielt foretrukket å anvende en slik blanding umiddelbart etter fremstillingen av den når blandingen er autolog. Hvis blandingen ikke anvendes umiddelbart etter fremstillingen, kan blandingen oppbevares. Oppbevaring av blandingen fordrer at blandingen konserveres f.eks. ved frysing eller frysetørking av blandingen eller ved at blandingen holdes ved 4°C. Det antas at blandingen i frosset eller frysetørket form vil være stabil i månedsvis. Når blandingen holdes ved 4°C, antas det at den er stabil i minst flere dager.

Hvis blandingen er frosset, må blandingen tines på tidspunktet for anvendelsen. Hvis blandingen er frysetørket, er det foretrukket at den rekondisjoneres på anvendelses-tidspunktet ved tilsetting av den samme syrebuffer som ble anvendt i solubiliseirngstrinnet hvis denne syre var flyktig, f.eks. eddiksyre, eller hvis et koatropisk middel ble anvendt, ved tilsetting av destillert vann. Ved rekondisjonering, som i solubiliseirngstrinnet, bør det anvendes den minste mengde syrebufferløsning eller destillert vann som likevel resulterer i at fibrinmonomeren er løselig. Faktisk kan rekondisjonering av en frysetørket blanding som omfatter fibrinmonomer, resultere i en vandig løsning som omfatter fibrinmonomer hvor en slik monomerkonsentrasjon er opptil 200 mg/ml. Før frysetørking kan det tilsettes et volumøkende middel, f.eks. mannitol eller laktose, til blandingen. Alternativt kan den frysetørkede blanding anvendes i frysetørket form. En slik form er spesielt foretrukket når det er ønskelig & tilsette hjelpestoffer, f.eks. antibiotika, til blandingen.

Blandingen som omfatter fibrinmonomer, kan være i praktisk talt hvilken som helst form, f.eks. som løsning, suspensjon, emulsjon eller faststoff, idet en løsning er foretrukket. Således kan f.eks. en slik blanding være en væske, gel, pasta eller salve. Blandingen kan selvfølgelig også være i form av en "granul", f.eks. frysetørket fibrin-monomer, som kan være, men ikke nødvendigvis, behandlet under dannelse av en løsning, emulsjon eller suspensjon, umiddelbart før anvendelse.

Hvilket som helst egnet løsningsmiddel kan anvendes for dannelse av løsningen, men det er selvfølgelig foretrukket at løsningen er ikke-toksisk. Dcke-begrensende eksempler på løsningsmidler innbefatter vann, etylalkohol, glycerol og propylenglykol, idet vann er foretrukket.

Et eksempel på en suspensjon er at blandingen som omfatter fibrinmonomer, kan blandes med organiske løsningsmidler, f.eks. etanol, til en sluttkonsentrasjon av etanol på over 3,0 M, og rystes. Fibrinmonomeren vil utfelles og kan gjenvinnes ved sentrifugering. Utfellingen bør vaskes med organisk fase for fjerning av den vandige løsning som anvendes i solubiliseirngstrinnet. En etanolisk suspensjon av monomert fibrin kan så påføres direkte på en bandasje eller annen bærer, eller den kan til og med påføres direkte på et sårområde. Den organiske fase får avdampes. Når det gjelder en bandasje eller annen bærer, kan suspensjonen hydratiseres på nytt ved at den bringes i kontakt med påførings-stedet, eller på en annen måte, og fibrinet får polymeriseres.

Alternativt kan en organisk suspensjon av fibrinmonomer fremstilt i en meget flyktig fase, f.eks. dietyleter, forstøves og avleveres som en sprøytesuspensjon på det ønskede sted. Det er foretrukket at den flyktige fase er ikke-brennbar. Det er mulig at en organisk suspensjon av fibrinmonomer kan avgis til ørene, nesen, halsen eller lungene ved sprøyting eller innånding, eller at den kan avgis til et blødende spiserør- eller magesår ved inntak.

Blandingene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan f.eks. anvendes for sammenknytting av vev eller organer, for stansing av blødning, tilheling av sår, tildekking av et kirurgisk sår, anvendelse ved vaskulær kirurgi, innbefattende tilveiebringelse av hemostase for blødning i stinghull ved distal-kransarterie-anastomoser; suturlinjer i venstre ventrikkel; aortotomi- og kannuleringssteder; diffus epimyokardial blødning som sees ved gjentatte operasjoner; og siving fra veneblødningssteder, f.eks. på atrie-, brysthule- eller høyre-ventrikkel-nivåer. Den foreliggende oppfinnelse er også egnet for tetting av dacron-arterie-transplantater før transplantering, tildekking av vev på utsiden av kroppen, dannelse av fibrinklumper for cellevekst, stopping av blødning fra ødelagt milt (hvorved organet reddes), lever, og andre parenchymatøse organer; tetting av luftrørs- og bronkie-nastomoser og luftlekkasjer eller opprivninger i lungen, tiltetting av bronkie-avskjæringer, bronkiefistler og spiserørsfistler; for suturløs, sømløs tilheling ("Zipper"-teknikk), og embolisering ved vaskulær radiologi av intracerebrale AVM'er, lever-AVM'er, angiodysplasi i tykktarm, spiserørs-varicer, "pumping" av GI-blødere sekundært til peptiske sår, osv. Foreliggende oppfinnelse er videre egnet for tilveiebringelse av hemostase i hornhinnetransplantater, ved neseblødning, etter tonsillektomier, tannuttrekkinger og ved andre anvendelser. Se G.F. Gestring og R. Lermer, Vascular Surgery, 294-304, sept./okt. 1983. Fibrintetningsmidlet ifølge den foreliggende oppfinnelse er dessuten særlig egnet for individer med koagulasjonsforstyrrelser.

Doseringen av blandingen som omfatter fibrinmonomer eller blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, avhenger av den spesielle anvendelse av fibrintetningsmidlet, men doseringen bør være en effektiv mengde slik at blandingen kan brukes til den påtenkte anvendelse. For en blanding som omfatter fibrinmonomer som er i vandig løsning, antas det vanligvis at fra ca. 3 til ca. 5 ml av en slik blanding er tilstrekkelig til at man får et effektiv fibrintetningsmiddel. Avhengig av blandingens anvendelse, kan imidlertid doseringen være i området fra ca. 0,05 til ca. 40 ml. Hvis en blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin i polymer form anvendes, eller hvis blandingen er i fast form, bør blandingen dessuten inneholde den mengde av fibrin som er i slik vandig løsning.

Omdannelsen av fibrinmonomeren til fibrinpolymer, eller ikke-tverrbundet fibrin til tverrbundet fibrin "samtidig" med sammenbringingstrinnet, omfatter at et slikt omdannelsestrinn og et slikt sammenbringingstrinn skjer innenfor et tidsrom i hvert trinn slik at fibrinklumpen dannes på det ønskede sted. Således kan samtidig angi at fibrin-monomeren etter sammenbringingstrinnet omdannes til fibrinpolymer, eller at det ikke-tverrbundne fibrin omdannes til tverrbundet fibrin. Dette utføres ved at blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, etter at en slik blanding er blitt påført på det ønskede sted bringes i kontakt med en blanding som kan omdanne fibrinmonomeren til fibrinpolymer eller det ikke-tverrbundne fibrin til tverrbundet fibrin. Omdannelsestrinnet før vanligvis skje innen ca. 1/2 minutt etter sammenbringingstrinnet. Ellers kan blandingen som omfatter fibrinmonomeren eller det ikke-tverrbundne fibrin, særlig hvis det ikke-tverrbundne fibrin er en fibrinmonomer, strømme bort fra det ønskede sted.

Samtidig kan man også angi at sammenbringingstrinnet og omdannelsestrinnet finner sted på samme tid. Dette utføres ved at det ønskede sted bringes i kontakt med blandingen som omfatter fibrinmonomeren eller det ikke-tverrbundne fibrin på samme tid som en slik blanding bringes i kontakt med en blanding som kan omdanne fibrin-monomeren til fibrinpolymer eller det ikke-tverrbundne fibrin til tverrbundet fibrin.

Omdannelsen av fibrinmonomeren til fibrinpolymer eller det ikke-tverrbundne fibrin til tverrbundet fibrin kan utføres ved hjelp av hvilken som helst teknikk som er kjent eller som kan utvikles. Hvordan omdannelsestrinnet utføres avhenger imidlertid av kilden til blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, f.eks. fullblod eller rekombinant fibrinogen, formen av fibrinmonomeren eller det ikke-tverrbundne fibrin, f.eks. fibrin I eller des-BB-fibrin, og, i mindre utstrekning, om hvorvidt det ønskede sted vil inneholde pasientens blod eller andre kroppsfluider på tidspunktet for anvendelse av fibrintetningsmidlet.

Hvis det anvendes en adskilt blanding, så som en alkalisk buffer (omtalt nedenfor) for omdannelsestrinnet, kan det anvendes en dobbelttrommelsprøyte. Dobbelttrommel-sprøyten kan være Y-formet, hvorved blanding av blandingen omfattende fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin, og blandingen som skal anvendes i omdannelsestrinnet, får skje umiddelbart før sammenbringingstrinnet. I stedet for en Y-formet dobbelttrommel- ( sprøyte kan det dessuten anvendes en dobbelttrommelsprøyte med to åpninger. Dette muliggjør at sammenbringing med det ønskede sted og omdannelse til fibrinpolymer eller tverrbundet fibrin kan finne sted samtidig. Dessuten kan blandingene i dobbelttrommel-sprøyten sprøytes på det ønskede sted. Se H.B. Kram et al., The American Surgeon, 57:381

(1991).

Hvis kilden til blandingen som omfatter fibrin-monomer eller ikke-tverrbundet fibrin er blod, antas det, som omtalt ovenfor, at det vil være tilbake nok protrombin, faktor Xm og andre nødvendige substanser i blandingen til at en slik fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin kan omdannes til tverrbundet fibrin, f.eks. aktivatorer for protrombin. Hvis det ikke-tverrbundne fibrin er en fibrinpolymer, dvs. at det ikke-tverrbundne fibrin ikke er blitt solubilisert, kan det ikke-tverrbundne fibrin omdannes til tverrbundet fibrin ved aktivering av protrombin og faktor XIII i en slik blanding under dannelse av tverrbundet fibrin. En slik aktivering kan utføres ved at blandingen bringes i kontakt med en kilde til kalsiumioner. Ikke-begrensende kilder til kalsiumioner innbefatter kalsiumklorid, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på 30 mM. Alternativt, og mindre foretrukket, kan kalsiumionene tilføres via blodet på det ønskede sted.

Hvis det ikke-tverrbundne fibrin er blitt solubilisert, dvs. er en fibrinmonomer, vil måten på hvilken fibrinmonomeren omdannes til tverrbundet fibrin, avhenge av hvordan solubiliseringen ble utført. Hvis det ikke-tverrbundne fibrin er blitt solubilisert ved hjelp av en syrebuffer, kan det tverrbundne fibrin dannes ved at pH i blandingen som omfatter fibrinmonomer økes slik at fibrinmonomeren kan polymeriseres. Dette kan utføres ved at en slik blanding bringes i kontakt med hvilken som helst egnet alkalisk buffer. Ikke-begrensende eksempler på egnede alkaliske buffere innbefatter HEPES, natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, kalsiumhydroksyd, bikarbonatbuffere så som natriumbikarbonat og kaliumbikarbonat, tri-metallsalter av citronsyre, salter av eddiksyre og salter av svovelsyre. Foretrukkede alkaliske buffere innbefatter: 0,5 - 0,75 M natriumkarbonat/bikarbonat pH 10 -10,5, 0,5 - 0,75 M natriumbikarbonat/NaOH pH 10,0,1,5 M glycin/NaOH pH 10,0, 0,5 - 1,0 M bis-hydroksyetylaminoetan-sulfonsyre (BES) pH 7,5,1 M hydroksyetylpiperazinpropan-sulfonsyre (EPPS) pH 8,5,0,5 M tricin pH 8,5,1 M morfolinopropan-sulfonsyre (MOPS) pH 8,0,1 M trishydroksymetylaminoetan-sulfonsyre (TES) pH 8,0 og 0,5 M cykloheksylaminoetan-sulfonsyre (CHES) pH 10,0; idet 0,5 - 0,75 M natriumkarbonat/ bikarbonat pH 10 -10,5,0,5 -1,0 M bis-hydroksyetylaminoetan-sulfonsyre (BES) pH 7,5, 1 M hydroksyetylpiperazinpropan-sulfonsyre (EPPS) pH 8,5 og 1 M trihydroksymetylaminoetan-sulfonsyre (TES) pH 8,0 er mest foretrukket.

Mengden av alkalisk buffer som anvendes, bør være nok til polymerisering av det ikke-tverrbundne fibrin. Det er foretrukket at fra ca. 10 deler til ca. 1 del blanding omfattende fibrin-monomer blandes med ca. 1 del alkalisk buffer. Det er enda mer foretrukket at et slikt forhold er ca. 9 :1. Det skal bemerkes at det foretrukkede forhold avhenger av valget av buffer og den ønskede "styrke" av fibrinpolymeren. Selvfølgelig avhenger den ønskede styrke av fibrinpolymeren av sluttanvendelsen for fibrintetningsmidlet.

Hvis solubiliseringen er blitt uført med et kaotropisk middel, kan fibrinmonomeren omdannes til tverrbundet fibrin ved fortynning av blandingen omfattende fibrinmonomer med f.eks. destillert vann. Fortynningen bør utføres slik at den minimale mengde fortynningsmiddel anvendes. Vanligvis bør den resulterende konsentrasjon av det kaotropiske middel etter fortynning være fra ca. 0,5 til ca. 0,1 molar.

I tillegg til øking av pH eller fortynning av det kaotropiske middel i blandingen omfattende fibrinmonomer, er det foretrukket at protrombinet og faktor XUI i en slik blanding aktiveres under dannelse av det tverrbundne fibrin. En slik aktivering kan utføres ved at blandingen bringes i kontakt med en kilde til kalsiumioner. Kilden til kalsiumionene kan være en del av den alkaliske buffer eller en del av syrebufferen som anvendes i solubiliseirngstrinnet. Ikke-begrensende kilder til kalsiumioner innbefatter kalsiumklorid, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på 30 mM. Alternativt, og mindre foretrukket, kan kilden til kalsiumioner tilføres via blodet på det ønskede sted.

Det skal bemerkes at hvis den alkaliske buffer er en karbonat/bikarbonatbuffer, må kilden til kalsiumioner tilsettes til syrebufferen i løpet av solubiliseirngstrinnet. Dette skyldes det faktum at kalsiumkloridet ikke er løselig i karbonat/bikarbonatbufferen. Det er foretrukket at konsentrasjonen av kalsiumioner i syrebufferløsningen er fra ca. 5 millimolar til ca. 150 millimolar og mer foretrukket fra mM til ca. 50 mM.

Det antas at den resulterende fibrinklump vil være tverrbundet fibrin II, uansett hvilken form for ikke-tverrbundet fibrin, dvs. fibrin-monomer eller fibrinpolymer, som er til stede. Hvis imidlertid formen for ikke-tverrbundet fibrin er des-BB-fibrin, antas det at det i tillegg kan være nødvendig med en kilde til ytterligere trombin for omdannelse av des-BB-fibrin til tverrbundet fibrin. En slik kilde til trombin kan f.eks. være plasma fra pasienten hvor slik plasma tilsettes til blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin.

Hvis det ønskede sted inneholder blod og det anvendes en blanding som omfatter en fibrinmonomer, dvs. at det ikke-tverrbundne fibrin er blitt solubilisert, kan dette blod anvendes som fortynningsmiddel for det kaotropiske middel eller til å øke pH i blandingen som omfatter fibrinmonomer. Man behøver således ikke anvende noe fortynningsmiddel eller alkalisk buffer. Ved denne utførelsesform er det foretrukket at kilden til kalsiumioner finnes i syrebufferen eller det kaotropiske middel som anvendes i solubiliseringstrinnet. Ved denne utførelsesform kan dessuten blandingen som omfatter fibrinmonomer, anbringes på en fast bærer, f.eks. bandasje, sutur, protese eller forbinding, som vil være i kontakt med det ønskede sted. En slik bærer anbringes så i kontakt med det ønskede sted inntil f.eks. fibrinklumpen dannes.

Det skal imidlertid bemerkes at hvis blandingen som omfatter fibrinmonomer, ikke holder tilbake nok protrombin og faktor XIII, slik at det dannes tverrbundet fibrin, er en slik blanding likevel egnet som fibrintetningsmiddel på grunn av at polymeriseringen av fibrinmonomer i seg selv er egnet for dannelse av en fibrinklump. En slik blanding kan dessuten likevel anvendes for dannelse av tverrbundet fibrin ved tilsetting av en kilde til kalsiumioner og aktivert faktor XUJ (eller forløpere for aktivert faktor XIH) og eventuelt trombin. En slik kilde til kalsiumioner, aktivert faktor XIII og trombin kan tilsettes til blandingene som omfatter fibrinmonomer. Den aktiverte faktor XIII kan tilsettes til blandingen som omfatter fibrinmonomer, med en sluttkonsentrasjon på fra ca. 1,0 til ca. 20 enheter av faktor XUI pr. ml blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin. Alternativt kan faktor XUJ tilføres via blodet eller kroppsfluidene på det ønskede sted eller ved tilsetting av autologt plasma til blandingen som omfatter fibrinmonomer. Dcke-begrensende kilder til kalsiumioner innbefatter kalsiumklorid, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på 30 mM. Alternativt, og mindre foretrukket, kan kalsiumioner tilføres via blodet eller kroppsfluider på det ønskede sted. Fra ca. 4 enheter til ca. 500 enheter trombin pr. ml blanding omfattende fibrinmonomer kan tilsettes, eller trombinet kan tilveiebringes ved det ønskede sted.

Hvis kilden til blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, er cellekulturer

som utsondrer fibrinogen eller rekombinant fibrinogen, og det ikke-tverrbundne fibrin er en fibrinpolymer, dvs. at det ikke-tverrbundne fibrin ikke er blitt solubilisert, må det anvendes en kilde til kalsiumioner og aktivert faktor XIII (eller forløpere for aktivert faktor XIU) for dannelse av tverrbundet fibrin. Faktor XUJ må anvendes på grunn av at disse kilder til ikke-tverrbundet fibrin ikke inneholder noe faktor XIII. Den aktiverte faktor XUJ kan tilsettes til blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, med en sluttkonsentrasjon på fra ca. 1,0 til 20 enheter faktor XIU pr. ml blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin. Alternativt kan faktor XIII tilføres via blodet eller kroppsfluidene på det ønskede sted eller ved tilsetting av autologt plasma til blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin. Dcke-begrensende kilder til kalsiumioner innbefatter kalsiumklorid, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 30 mM. Alternativt, og mindre foretrukket, kan kalsiumioner tilføres via blodet eller kroppsfluidene på det ønskede sted. Eventuelt kan dessuten trombin tilsettes til en slik blanding for å sikre at det dannes tverrbundet fibrin II. Det kan tilsettes fra ca. 4 til ca. 500 enheter trombin pr. ml blanding inneholdende ikke-tverrbundet fibrin, eller trombinet kan tilveiebringes på det ønskede sted.

Hvis det ikke-tverrbundne fibrin er blitt solubilisert, dvs. at det er en fibrin-monomer, avhenger måten på hvilken fibrinmonomeren omdannes til fibrinpolymer, av hvordan solubiliseringen er blitt utført, f.eks. ved hjelp av syrebuffer eller kaotropisk middel. Dannelsen av fibrinpolymer kan utføres ved hjelp av de samme fremgangsmåter som beskrevet ovenfor. Denne fibrinpolymer kan, hvis ønskelig, så omdannes til tverrbundet fibrin ved tilsetting av en kilde til kalsium-ioner og aktivert faktor XIII (eller forløpere for aktivert faktor XIU) og eventuelt trombin, til blandingen som omfatter fibrin-monomer, som beskrevet ovenfor. Den aktiverte faktor XUI kan tilsettes til blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, til en sluttkonsentrasjon på fra ca. 1,0 til ca. 20 enheter av faktor XIII pr. ml blanding inneholdende ikke-tverrbundet fibrin. Alternativt kan faktor XUI tilføres via blodet eller kroppsfluidene på det ønskede sted, eller ved tilsetting av autologt plasma til blandingen som omfatter ikke-tverrbundet fibrin. Dcke-begrensende kilder til kalsiumioner innbefatter kalsiumklorid, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 30 mM. Alternativt, og mindre foretrukket, kan kalsiumioner tilføres via blodet eller kroppsfluidene på det ønskede sted. Det kan tilsettes fra ca. 4 til ca. 500 enheter trombin pr. ml blanding omfattende fibrinmonomer, eller trombinet kan tilveiebringes på det ønskede sted.

Det er mulig å tilsette hjelpestoffer, f.eks. antibiotika, så som gentamycin, cefotaxim, nebacetin og sisomicin, histaminin-H2-antagonister så som ranitidin, og antikreftmidler så som OK-432 til blandingene. Dette kan utføres ved tilsetting av det ønskede antibiotikum til blandingen som omfatter fibrinmonomer eller ikke-tverrbundet fibrin. Se M.C.H. Gersdorff og T.A.J. Robillard, Laryngoscope, 95:1278-80 (1985); A. Ederle et al., Ital. J. Gastroenterol., 23:354-56 (1991); V. Ronfard et al., Bums, 17:181-84

(1991); T. Sakurai et al., J. Control. Release, 18:39-43 (1992); T. Monden et al., Cancer, 69:636-42 (1992); F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25:39-51 (1991) og H.B." Kram et al., Joumal of Surgical Research, 50:175-178 (1991), hvis innhold er medtatt i det foreliggende som referanse. Andre hjelpestoffer kan også tilsettes, f.eks. fibronectin, fibrinolytiske inhibitorer så som aprotinin, alfa-2-antiplasmin, PAI-1, PAI-2, 6-amino-heksansyre, 4-aminometylcykIo-heksansyre, kollagen eller keratinocytter. Det antas at doseringen av slikt hjelpestoffer det samme som det som anvendes i vanlige fibrintetnings-midler.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også som angitt utstyrsett. Utstyrsettet kan som en første komponent inneholde en blanding omfattende fibrinmonomer, og som en andre komponent en alkalisk buffer som kan polymerisere fibrinmonomeren, eller destillert vann, avhengig av hvordan solubiliseirngstrinnet er blitt utført. Den andre komponent kan eventuelt inneholde en kilde til kalsiumioner. Alternativt kan den første komponent være en blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, og den annen komponent kan være en kilde til kalsiumioner. Hvis kilden til fibrinogen som anvendes for fremstilling av en blanding omfattende ikke-tverrbundet fibrin, er fra cellekulturer som utsondrer fibrinogen eller rekombinant fibrinogen, kan den første komponent være en blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin, den annen komponent kan være en kilde til kalsiumioner og en tredje komponent er aktivert faktor XIII.

5. EKSEMPLER

5 1 Plasma- frernstilling iitfra fiillhlod

Fullblod (100 ml) oppsamles i en kommersielt tilgjengelig standard blodpose inneholdende en antikoagulant så som citrat/fosfat/dekstrose. Blodet overføres så til en beholder som er egnet for sentrifugering, og sentrifugeres ved romtemperatur i 10 minutter ved 3.000 g. Det klare supemantantplasma (ca. 50 ml) dekanteres av og cellekomponentene kastes.

En alternativ metode for plasmafremstilling ut fra fullblod er ved filtrering. Igjen oppsamles 100 ml fullblod i en pose som inneholder en egnet antikoagulant så som citrat/- fosfat/dekstrose. Blodet blir så resirkulert over et filter som gir god proteingjennomgang, ved hjelp av en peristalstisk pumpe. Trykkfallet over membranen resulterer i at plasma tvinges gjennom, idet cellekomponenter blir tilbake i det resirkulerende blod. Plasma (50 ml) oppsamles for ytterligere bearbeidelse.

5.2. 1 Ihevegeliggjøring av hatrnksnhin på perle- agarose

Perleagarose (Pharmacia) ble anvendt ved ubevegeliggjøringsundersøkelse. Den anvendte agarose var 4% tverrbundet, 45 - 265 fim (90% av partiklene). Dette materiale sveller til 5 ganger av sitt volum ved hydratisering. Batroksobin oksyderes først med 0,1 M natriumperjodat i 1 time ved romtemperatur i et tildekket scintillasjonsglass. Batroksobinet renses ved at det ledes gjennom en Sephadex PD-10-gelgjennomtrengningskolonne. Det oksyderte batroksobin koples så til en hydrazidaktiverings-agarosegel over natten ved romtemperatur i 50 mM natriumacetat pH 5,5 pluss 10 mM natriumborhydrid (30 - 200E pr. 1,75 g fuktig gel). De ikke-bundne reaksjoner fjernes fra gelen ved vasking med: 50 ml 50 mM natriumacetat pH 5,5,100 ml 50 mM glycin/1 M natriumklorid pH 3,0,100 ml 50 mM natriumkarbonat/1 M natriumklorid pH 10,00,100 ml 50 mM natriumfosfat/1 M natriumklorid pH 7,0,100 ml vann, 100 ml 50 mM natriumfosfat/1 M natriumklorid pH 7,0,100 ml 50 mM natriumfosfat pH 7,0.

5.3. Omsetting av nhevegeliggjort pnflyr n med plasmafihrinogen under dannelse av en hlanding omfat tende ikke- tverronnriet fihrin

Det ubevegeliggjorte enzym (350 mg) tilsettes til ca. 50 ml sentrifugert eller filtrert plasma og blandes forsiktig i 7 - 20 minutter inntil det er dannet en klump av ikke-tverrbundet fibrin I-polymer.

Fibrin I-polymeren pluss tilknyttet ubevegeliggjort enzym høstes så enten ved: a) sentrifugering ved 3.000 g i 10 minutter, fulgt av fjerning av supernatantserumet ved dekantering, eller b) filtrering gjennom et egnet filter med lav proteinbinding, fulgt av fjerning av det filtrerte serum og bibeholdelse av fibrin I-polymeren pluss ubevegeliggjort enzym for ytterligere behandling. Denne fibrin I-polymer er et eksempel på en blanding som omfatter ikke-tverrbundet fibrin.

5.4. Solnhilise ring av fihrin T- polymeren under dannelse av en blanding omfattende fihrinmonomer

Solubilisering av fibrin I-polymeren oppnås ved tilsetting av ca. 1 - 4 ml 0,2 M natriumacetat pH 4,0 inneholdende 30 mM kalsiumkloridbuffer til den høstede fibrin I-polymer pluss ubevegeliggjort enzym. Prøven agiteres deretter kraftig, f.eks. på en virvelblander, i 2 minutter. Fjerning av det ubevegeliggjorte enzym kan så oppnås ved filtrering av fibrin I-løsningen gjennom et 1 - 20 fim filter med lav proteinbinding. Agarose-enzymet vil bli holdt tilbake av filteret, idet det således kan fjernes fra systemet. Den gjenværende løsning, en blanding omfattende fibrin I-monomer, består av en konsentrert, sur fibrin I-monomerløsning i forbindelse med andre plasmaproteiner. Vanligvis resulterer ca. 100 ml fullblod i ca. 4 ml eller 5 ml av blandingen omfattende fibrinmonomer hvor konsentrasjonen av fibrinmonomer er fra ca. 25 mg/ml til ca. 35 mg/ml. Denne er nå klar for avgivelse til pasienten, enten alene eller ekstrudert sammen med gjenpolymeriseringsbuffer under dannelse av et fibrintetningsmiddel.

5.5. fijenpnlymerisering av hlandingen omfattende fihrin T- mnnomer

Gjenpolymerisering oppnås ved samtidig blanding av 9 deler av løsningen omfattende fibrin I-monomer med 1 del av en egnet gjenpolymeriseringsbuffer, f.eks. 0,75 M natriumkarbonat/natriumbikarbonat, pH 10,0. Blandingsforholdet kan forandres; imidlertid opprettholder et forhold på 9 : 1 den høye konsentrasjon av fibrin i slutt-produktet. Ved koekstrudering gjenpolymeriseres fibrin I spontant og omdannes til fibrin H, fulgt av tverrbinding av fibrinet i løpet av et tidsrom på ca. 30 minutter.

Den foreliggende oppfinnelses ramme begrenses ikke ved de spesifikke beskrevne utførelsesformer, som er ment som enkeltillustrasjoner av individuelle aspekter ved opp-finnelsen. Forskjellige modifikasjoner av den foreliggende oppfinnelse, i tillegg til dem som er vist og beskrevet i det foreliggende, vil faktisk åpenbares for fagfolk på området utfra den foregående beskrivelse. Slike modifikasjoner er ment å ligge innenfor rammen av de tilknyttede krav.

5.6. Hydray. irilfktivering av agarose og kopling via karhohydratdelfin av Rn7ymet

For omsetting av karbohydrat-delen av batroksobin med en hydrazidaktivert bærer må sukkeret først oksyderes under dannelse av frie -CHO-grupper. Dette utføres som følger.

Batroksobin 1-7 mg oppløses i 2 ml vann og 0,2 ml 0,1 M natriumperjodat. Blandingen inkuberes ved romtemperatur i 1 time, hvoretter den avsaltes på en gel-filtreringskolonne av typen Sephadex G-25. Det oksyderte aktive batroksobin elueres fra kolonnen med 0,9 vekt/volum% natriumklorid.

Kommersielt tilgjengelig standard-hydrazid-aktivert agarose (Bio-rad Laboratories Ltd. UK) eller hvilken som helst gruppe med en fri terminal-aminogruppe kan anvendes til direkte kopling av frie aldehydgrupper (-CHO). Hvis det anvendes hydrazidagarose, er koplingsmetoden som følger. 1 - 5 g hydrazidagarosegel suspenderes i 4 ml 50 mM natriumacetat pH 5,5. Til suspensjonen tilsettes 1 ml 10 mM natriumborhydrid sammen med den ønskede mengde av oksydert batroksobin (typisk 100 - 200 BU pr. gram fuktig gel).

Prøven blandes over natten ved romtemperatur og vaskes deretter på en sintret glasstrakt med 50 ml 50 mM natriumacetat pH 5,5,100 ml 50 mM glycin/1 M natriumklorid pH 3,0,100 ml 50 mM natriumkarbonat/1 M natriumklorid pH 10,00,100 ml 50 mM natriumfosfat/1 M natriumklorid pH 7,0,100 ml vann og 100 ml 50 mM natriumfosfat/1 M natriumklorid pH 7,0 og til slutt 100 ml 50 mM natriumfosfat pH 7,0.

Fremgangsmåten for omsetting av det ubevegeliggjorte batroksobin med plasma er som følger.

Plasmaets (50 ml) pH reduseres til pH 5,5 ved tilsetting av eddiksyre. Til plasmaet tilsettes det ekvivalente til 100 - 200 BU batroksobin som er gjort ubevegelig, til ca. 1,75 g (vekt av fuktig gel) agarose. Plasmaet inkuberes ved 37°C i 10 -15 minutter, hvoretter pH økes til pH 7,4 ved tilsetting av natriumhydroksyd. Fibrin I-polymerisering skjer nesten øyeblikkelig. Fibrin I-polymeren høstes ved sentrifugering ved 3.500 omdreininger pr. minutt i 10 minutter og oppløses på nytt i 3 - 4 ml 0,2 M natriumacetat pH 4,0 inneholdende 30 mM kalsiumklorid. Agarose-enzym kan så skilles fra fibrin I ved sentrifugering eller filtrering. Fibrin I polymeriseres deretter på nytt under dannelse av fibrintetningsmidlet ved tilsetting av 9 deler fibrin I-løsning til 1 del 0,75 M natriumkarbonat/ bikarbonat pH 10,0.

5.7. FnzymnppfangingRsystRmet vad anvp. nrtekft av hintinavidin

Enzyminnfanging utføres ved at man først biotinylerer batroksobinet og fanger opp biotin-enzymet med ubevegeliggjort avidin (avidin koplet til 6% tverrbundet agarose).

Biotinylering av proteiner kan oppnås ved anvendelse av en rekke reagenser. I dette tilfelle anvendes N-hydroksysuksinimid-biotin (vann-uløselig) (kommersielt tilgjengelig fra Amersham). NHS-biotin (50 /il) tilsettes til 1 mg batroksobin ved pH 8,6 og løsningen inkuberes ved romtemperatur i 1 time. Overskudd av biotinyleirngsreagens fjernes ved hjelp av gelfiltrering på en kolonne av type Sephadex G-25 med 0,1 M kaliumfosfat pH 7,5 som elueringsmiddel.

Det ekvivalente til 10BU (biotin-batroksobin) tilsettes til 50 ml plasma og inkuberes ved 37°C i 10 minutter. Fibrin I-polymer høstes ved sentrifugering (3.500 omdreininger pr. minutt i 10 minutter) og oppløses på nytt i 3 - 4 ml 0,2 M natriumacetat pH 4,0 inneholdende 30 mM kalsiumklorid. Til fibrin I tilsettes avidinagarose (kommersielt tilgjengelig fra Sigma Chemical Co.) med 0,2 g (fuktig gel) pr. ml fibrin I. Prøven inkuberes ved romtemperatur i 10 minutter og sentrifugeres med 2.000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter. Det dannede fibrin I er hovedsakelig fritt for batroksobin. Fibringjenpolymerisering under dannelse av fibrintetningsmidlet oppnås som beskrevet i eksempel 5.6.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en blanding som omfatter fibrinmonomer, ut fra fibrinogen, karakterisert ved at den omfatter: (a) en blanding som omfatter fibrinogen, bringes i kontakt med et trombinliknende enzym under omdannelse av fibrinogenet til en ikke-tverrbundet fibrinpolymer; (b) den ikke-tverrbundne fibrinpolymer skilles fra blandingen som omfatter fibrinogen; og (c) den ikke-tverrbundne fibrinpolymer solubiliseres under dannelse av en blanding som omfatter fibrinmonomer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det trombinliknende enzym gjøres ubevegelig på en bærer, og sammenbringingstrinnet resulterer i at det trombinliknende enzym knyttes sammen med den ikke-tverrbundne fibrinpolymer, og videre skilles det trombinliknende enzym fra blandingen som omfatter fibrinmonomer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bæreren er valgt fra gruppen som består av cellulose, polydekstraner, agarose, polystyrener, silika, polyakrylsyrer, polyakrylamider, polyvinylalkoholer, glassperler, polykarbonat, kollagen, cellulosederivater, polytetrafluoretylen og deres kompositter.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at bæreren er valgt fra gruppen som består av agarose og silika.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det trombinliknende enzym gjøres ubevegelig på et filter, eller det trombinliknende enzym gjøres ubevegelig på en bærer og er på én side av et filter, og etter sammenbringingstrinnet ledes den resulterende fibrinmonomer gjennom filteret.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at solubiliseirngstrinnet utføres ved hjelp av en syrebufferløsning med en pH på under ca. 5 eller et kaotropisk middel.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at syrebufferløsningen er valgt fra gruppen som består av eddiksyre, ravsyre, glukuronsyre, cysteinsyre, krotonsyre, itakonsyre, glutaminsyre, maursyre, asparaginsyre, adipinsyre og salter derav.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at syrebufferløsningen eller det kaotropiske middel videre omfatter en kilde til kalsiumioner.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at separasjonstrinnet utføres ved hjelp av filtrering.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det trombinliknende enzym kan omdanne fibrinogen til fibrin I.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det trombinliknende enzym er valgt fra gruppen som består av ancrod og batroksobin.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter at det trombinliknende enzym fjernes fra blandingen som omfatter fibrinmonomer, ved at det trombinliknende enzym biotinyleres og blandingen omfattende fibrinmonomer bringes i kontakt med ubevegeliggjort avidin, hvorved det trombinliknende enzym fjernes fra blandingen som omfatter fibrinmonomer.

13. Vandig blanding, karakterisert ved at den omfatter ikke-tverrbundet fibrinmonomer hvor konsentrasjonen av fibrinmonomer er fra ca. 10 mg/ml til ca. 200 mg/ml og blandingen har en pH på fra ca. 1 til ca. 5.

14. Vandig blanding ifølge krav 13, karakterisert ved at konsentrasjonen er fra ca. 20 mg/ml til ca. 100 mg/ml.

15. Vandig blanding ifølge krav 13, karakterisert ved at fibrinmonomeren er valgt fra gruppen som består av fibrin I, des-BB-fibrin og fibrin II.

16. Vandig blanding ifølge krav 15, karakterisert ved at fibrinmonomeren er fibrin I.

17. Vandig blanding, karakterisert ved at den omfatter fibrinmonomer hvor konsentrasjonen av fibrinmonomeren er fra ca. 20 mg/ml til ca. 200 mg/ml.

18. Vandig blanding ifølge krav 17, karakterisert ved at konsentrasjonen er fra ca. 20 mg/ml til ca. 100 mg/ml.

19. Vandig blanding ifølge krav 17, karakterisert ved at fibrinmonomeren er valgt fra gruppen som består av fibrin I, des-BB-fibrin og fibrin II.

20. Vandig blanding ifølge krav 19, karakterisert ved at fibrinmonomeren er fibrin I.

21. Vandig blanding, karakterisert ved at den omfatter: (a) fibrinmonomer, og (b) en kilde til kalsiumioner, hvor konsentrasjonen av kalsiumionene er fra ca. 5 mM til ca. 200 mM.

22. Blanding omfattende fibrinmonomer, karakterisert ved at blandingen er i fast form.

23. Blanding ifølge krav 22, karakterisert ved at blandingen er dannet ved frysetørking av en vandig løsning omfattende fibrinmonomer.

24. Blanding, karakterisert ved at den omfatter fibrinmonomer og en forbindelse valgt fra gruppen som består av et antibiotikum, en histamin-H2-antagonist, et antikreftmiddel, fibronektin og en fibrinolytisk inhibitor.

25. Utstyrsett, karakterisert ved at det omfatter: (a) en blanding omfattende fibrinmonomer; og (b) en blanding valgt fra gruppen som består av en alkalisk buffer og destillert vann.

26. Utstyrsett ifølge krav 25, karakterisert ved at den alkaliske buffer eller det destillerte vann videre omfatter en kilde til kalsiumioner.

27. Utstyrsett, karakterisert ved at det omfatter: (a) en blanding omfattende ikke-tverrbundet fibrin; og (b) en blanding omfattende en kilde til kalsiumioner.

28. Utstyrsett ifølge krav 27, karakterisert ved at det videre omfatter aktivert faktor Xm.

29. Fast bærer, karakterisert ved at den på sin overflate har en blanding som omfatter fibrinmonomer.

30. Fast bærer ifølge krav 29, karakterisert ved at den faste bærer er valgt fra gruppen som består av en bandasje, en sutur, en protese og et forbindingsmateriale.

31. Fast bærer ifølge krav 29, karakterisert ved at monomeren er valgt fra gruppen som består av fibrin I, des-BB-fibrin og fibrin II.

32. Fast bærer ifølge krav 31, karakterisert ved at monomeren er fibrin I.

33. Fast bærer ifølge krav 29, karakterisert ved at blandingen er i fast form.

34. Fast bærer ifølge krav 33, karakterisert ved at blandingen er dannet ved frysetørking av en vandig løsning omfattende fibrinmonomer.