CN113925997B - 一种含止血微胶囊的明胶海绵及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含止血微胶囊的明胶海绵及其制备方法，本发明通过微胶囊技术将凝血酶包裹在具有囊壁结构的微胶囊中，以明胶为载体，负载止血微胶囊制备高效率的止血材料。第一，本发明的止血海绵具有蓬松多孔结构，协同凝血酶止血性能，增强了该材料的止血效率；第二，本发明的微胶囊囊壁结构具有很好的机械性能，提供的制备方法能够很好地将凝血酶成功包裹到囊壁结构中；第三，本发明的止血微胶囊在使用过程中能够避免受环境温度影响而失活，能够保持较长时间的活性，克服了现有凝血酶止血材料易变性失活，稳定性较差，要求冻干后10℃以下低温保存等缺点。

Description

一种含止血微胶囊的明胶海绵及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药制造技术领域，尤其涉及一种含止血微胶囊的明胶海绵及其 制备方法。
背景技术
血液凝固，是指血液由流动的液体状态变成不能流动的凝胶状态的过程，是 生理性止血的重要环节。血液凝固的实质就是血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不 可溶的纤维蛋白的过程，大体上分为三个阶段，凝血酶原激活物形成，凝血酶形 成，纤维蛋白形成。血小板破裂时，会释出凝血致活酶，在钙离子的作用下催化 凝血酶原变成凝血酶，凝血酶将血浆中原本可水溶的纤维蛋白原凝固成为变成不 溶于水的纤维蛋白，纤维蛋白扭结其他血细胞成团，凝固成为血块。
凝血机理可分为内源性途径、外源性途径、共同凝血途径。其中，外源性途 径参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血，由于 组织损伤释放出因子Ⅲ，从而激活因子Ⅶ，启动凝血过程。这一过程是从组织因 子暴露于血液而启动，到因子Ⅹ被激活的过程。临床上以凝血酶原时间测定来反 映外源性凝血途径的状况。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜 蛋白。当组织损伤后，释放该因子，在钙离子的参与下，它与因子Ⅶ一起形成1： 1复合物。一般认为，单独的因子Ⅶ或组织因子均无促凝活性。但因子Ⅶ与组织 因子结合会很快被活化的因子Ⅹ激活为Ⅶa，从而形成Ⅶa组织因子复合物，后 者比Ⅶa单独激活因子Ⅹ增强16000倍。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。外源性凝血途径主要受组织因子途径抑制物(TFPI)调节。TFPI是存在于正常人血 浆及血小板和血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过与因子Ⅹa或因子Ⅶa-组织 因子-因子Ⅹa结合形成复合物来抑制因子Ⅹa或因子Ⅶa-组织因子的活性。另外， 研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。
目前可吸收止血材料主要有胶原类(含微纤维蛋白胶)、明胶、海藻酸盐、 壳聚糖、氧化纤维素(氧化再生纤维素)、氰基丙烯酸类组织胶以及很有前景的 短肽等，这些材料来源各不相同，止血机理也各异。尽管也有研究者认为可通过 吸附红细胞封堵或激活补体系统等实现止血，但是通常是3类止血机制：(1) 通过直接激活或参与凝血系统；(2)通过大量吸水等物理及其他化学途径富集 伤口部位凝血成分间接激活生理止血过程；(3)通过强黏着物理封闭血管。其 中，胶原类的止血机理是对血小板有吸附作用，可以促进血小板聚集并刺激血小 板释放凝血因子实现凝血；明胶由于可以大量吸水富集浓缩血小板和凝血因子从 而实现止血；海藻酸盐类除能大量吸水实现富集浓缩血小板和凝血因子来加速止 血外，还能释放钙镁锌等离子促进凝血；氧化纤维素类则主要是分子中的羧基与 Fe2+结合成棕色块而达到封堵血管效果；羟基丙烯酸类组织胶主要依靠其良好 的粘性对血管进行封堵。
壳聚糖的止血性在于壳聚糖带有一定量的电荷，它的分子可以直接将创面上 的红细胞连接在一起，促使血液凝固，从而达到止血效果。此外，还有抑制多种 细菌和真菌生长的作用，由壳聚糖做成的创面敷料还具有吸水透氧性，使得敷料 下的创面组织可以得到足够的氧分压，有利于上皮细胞从周围爬行，抑制成纤维 细胞的生长的功能，所有这些特点都赋予它作为创面止血材料的良好性能。
凝血酶(Thrombin Ec 3.4.21.5))是一种丝氨酸蛋白酶，是凝血因子II，在凝 血系统起着重要作用，是凝血酶原经凝血酶原激活物激活而成的，具有很强的专 一性。凝血酶能够特异的水解纤维蛋白原内的Arg-Gly肽键，使血液中可溶性的 纤维蛋白原转化为不溶的纤维蛋白，从而使血液凝固而达到止血的目的。
凝血酶由308个氨基酸残基所组成，分子量为36000，是一个双链分子，由 A、B两条链组成，两条链之间由二硫键连接。其中，A链有36个氨基酸残基， B链有259个氨基酸残基，A、B两条肽连是由一个二硫键(Cys1-Cys122)共价相 连的，B链内部有三个二硫键(Cys42-Cys58、Cys168-Cys182、Cys191-Cys220)， 这些肽键对凝血酶的结构起到稳定作用。A链稳定着凝血酶整体结构的功能性、 完整性，B链是凝血酶的功能键，它具有典型的Ger蛋白水解酶结构，其功能结 构都位于折叠结构之间，包括一个活性中心，两个外结合位点，一个钠离子结合 位点，一个自我催化水解环和一个W60d环，凝血酶有两种构象，“fast”型和“slow” 型，由于这两种构象对底物的催化效率不同，所以其生理功能也有所不同。“fast”型对血小板受体、纤维蛋白原有高度专一性、促进凝血功能；相反“slow”型对血 小板受体、纤维蛋白原有较低专一性，反而对抗凝血蛋白C有高度的催化活性 (Di Cera E et al,1997)。生理条件下，凝血酶就是通过两种构象的相互转化，来完 成其凝血和相反功能的。
凝血酶分子至少有三个相互独立的结构位点，即催化位点(或称激活位点)、 阴离子结合位点(或称纤维蛋白结合位点)和肝素结合位点。这三个位点均表现 为不同分子以不同的结合形式相结合，这是由于对不精确结合的耐受和(或)配 位子主链方向的逆转所引起的。
凝血酶是通过蛋白酶活化受体(Protease-Activated ReceptorPAR)介导而发 挥其激活血小板、凝血和调节细胞活性功能。凝血酶产品主要成分为牛血或猪血 中提取的凝血酶原，经激活而得到凝血酶的无菌冻干品，为白色至灰白色的冻干 块状物或粉，每1ml中含500单位的0.9％氯化钠溶液微显浑浊，需密封，在4℃～ 10℃保存，遇酸、碱、重金属发生反应而降效。不是酶的活性低温会保持它的活 性，因为高温酶会失活，要达到一定的温度才失活，所以为了防止意外，就用低 温保存，因为低温保存时，酶的活性不会失去，只是被抑制而已，当温度恢复时， 活性自然就恢复了。凝血酶配成溶液后，在室温状态下经8h或冷冻后48h内失 去活性，H<5时失效。
虽然凝血酶具有良好的促凝血性能，由于凝血酶的本质是蛋白质，易变性失 活，稳定性较差，要求冻干后10℃以下低温保存。尤其是在野战条件这种更为 恶劣的情况下，提供理想的储存和酶催化环境比较困难，凝血酶作为止血剂的应 用受到了极大限制。研究表明，常温下凝血酶的水溶液在保持24h就完全失活。 目前对凝血酶稳定化的研究不多，有研究者用甘氨酸和明胶作为凝血酶溶液的稳 定剂，在40、℃相对湿度75％及室温下保存6个月后，酶活力几乎没有下降。 李平等以取代度为0.65的羧甲基壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂对凝血酶进行 了固定化研究，结果表明，0.6g羧甲基壳聚糖对1000IU凝血酶固定化，0.1％ 戊二醛加入量0.3mL时，固定化凝血酶的活性回收率为87％。在40和℃低温保 存10天，固定化酶活性降低分别为20％和13％，高于40℃时，经一天，固定 化凝血酶的活性完全丧失。目前还没有发现壳聚糖固定化凝血酶方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，而提出一种含止血微胶囊的明胶海 绵及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种含止血微胶囊的明胶 海绵，由明胶海绵和止血微胶囊组成，所述止血微胶囊包含壁材和囊芯物质，其 特征在于，所述囊芯物质为凝血酶/甘氨酸/明胶的混合溶液,所述壁材为柠檬酸/ 京尼平与明胶/壳聚糖交联后形成的聚合物，所述聚合物的化学结构式如式(I) 所示：
Figure BDA0003301110340000041
式(I)中:R1至R9选自十八种不同氨基酸甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天 门冬氨酸、谷氨酸氨基、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮 氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、赖氨酸的 残基中的一种。
优选地，所述式(I)中：
R5、R6选自十八种不同氨基酸甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、谷 氨酸氨基、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸、 蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、赖氨酸的残基中的一种；
R3、R7为赖氨酸或者精氨酸的残基；
R2、R4、R8为天门冬氨酸或谷氨酸氨基的残基；
R1、R9为丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的残基。
本发明还提供一种含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，具体包括如下步骤：
a.将明胶和甘氨酸溶解于水中，然后再加入凝血酶溶液，得到凝血酶混合 溶液；
b.将明胶溶解于1.0％醋酸溶液中，得到明胶醋酸溶液，再加入壳聚糖，搅 拌使壳聚糖溶解，得到明胶/壳聚糖混合溶液，并调节pH至5.8-6.2；
c.在植物油中加入凝血酶混合溶液，水浴加热后搅拌均匀，然后加入大豆 磷脂乳化剂进行乳化；
d.向步骤c后的体系中加入步骤b制得的明胶/壳聚糖混合溶液进行加热， 反应完全后关闭加热，自然冷却至室温；
e.向步骤d后的溶液体系中加入京尼平进行交联反应，充分反应后得到京尼 平交联明胶/壳聚糖微胶囊；
f.在步骤e后的反应体系中加入柠檬酸，并加入冰醋酸，调节pH至2-3，在 N2保护下充分反应，得到止血微胶囊；
g.取明胶加入去离子水，水浴加热并搅拌溶解形成均一明胶溶液，快速搅 拌至呈均匀细腻的泡沫；
h.向步骤g中的明胶泡沫加入止血微胶囊，再搅拌至止血微胶囊分散均匀；
i.将步骤h中含有止血微胶囊的明胶泡沫进行真空冷冻干燥，得到含止血微 胶囊的明胶海绵。
优选地，所述步骤f和步骤g之间还包括：将步骤f后的反应体系静置，倾 去上层油相后再进行离心和去离子水洗涤，分离出油相，去除未反应京尼平和柠 檬酸，即得到纯化的止血微胶囊。
优选地，所述步骤b中，优选调节pH至6；所述步骤c中所述植物油为玉 米油、橄榄油、大豆油、花生油中的一种或几种，水浴加热温度控制为37℃， 搅拌速度为600rpm，乳化时间为20-30min。
优选地，所述步骤d中，加热温度控制为37℃，搅拌速度为400-700rpm， 时间为40-80min；所述步骤f的具体步骤为：在步骤e的反应体系中加入质量 分数为1.0％的柠檬酸，并加入冰醋酸，调节pH至2-3，在N2保护下将反应温 度升至40℃，反应8h后再冷却至室温，得到止血微胶囊。
优选地，所述步骤g的具体步骤为：明胶质量分数为5-10％，将明胶溶液快 速搅拌20-60min形成均匀细腻的泡沫；所述步骤h中明胶与止血微胶囊质量比 为1:1至1:4，明胶泡沫与止血微胶囊搅拌时间为20-30min。
优选地，所述步骤i的具体步骤为：将含有止血微胶囊的明胶泡沫快速转移 至-10℃预冷1h的模具中，再将其转移至温度为-40℃的条件下预冷冻2h，最 后转移至冷冻干燥机中，真空度为0.09-2.0MPa，干燥温度为-10℃，干燥时间 为30-40h。
优选地，所述步骤e中，加入京尼平的质量分数为0.5％。
优选地，按照重量份数计，各组分的配比为：明胶12-32份，壳聚糖1.2-3.2 份，1.0％醋酸溶液160-300份，大豆磷脂15-25份，京尼平80-120份，柠檬酸 10-35份，植物油800-1800份，凝血酶/甘氨酸/明胶混合溶液50-100份。
再进一步优选，按照重量份数计，各组分的配比为：明胶选择22.0份，壳 聚糖选择2.2份，1.0％醋酸溶液选择240份，大豆磷脂选择20份，京尼平选择 100.0份，柠檬酸选择25份，植物油选择1000份，凝血酶/甘氨酸/明胶混合溶 液选择80份。
与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明通过微胶囊技术将凝血酶包 裹在具有囊壁结构的微胶囊中，一方面，本发明的微胶囊囊壁结构具有很好的机 械性能，提供的制备方法能够很好地将凝血酶成功包裹到囊壁结构中，另一方面， 本发明的止血微胶囊在使用过程中能够避免受环境温度影响而失活，能够保持较 长时间的活性，克服了现有凝血酶止血材料易变性失活，稳定性较差，要求冻干 后10℃以下低温保存等缺点。以明胶海绵为载体，负载止血微胶囊，明胶海绵 具有的蓬松多孔结构，可吸收自身重量30倍以上的水分和血液，压迫创面，同 时止血微胶囊破裂，释放凝血酶，从而达到速度止血的作用。
附图说明
图1为实施例1明胶、壳聚糖以及不同质量比例壳聚糖/明胶的等电点曲线 图；
图2为明胶、壳聚糖、明胶/壳聚糖复合物、京尼平交联明胶壳聚糖和柠檬 酸改性明胶/壳聚糖的热分析曲线图。
图3为图3是止血微胶囊合成过程的显微镜图。
图4为止血微胶囊破裂后的光学显微镜图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地说明。
实施例1明胶、壳聚糖、明胶壳聚糖复合材料的等电点测定
1.1明胶等电点
称取0.5g明胶，加入100ml去离子水中，于50℃水浴温度下搅拌至完全 溶解，得到0.5％的明胶溶液。使用0.001mol/L的HCl和0.001mol/L NaOH调 节PH，采用PH计和电导仪记录不同PH下明胶溶液的电导率。
1.2壳聚糖等电点
称取0.5g壳聚糖，加入100ml，0.01mol/L HCl溶液中，于室温下搅拌至壳 聚糖完全溶解，得到0.5％的壳聚糖溶液。采用0.001mol/L NaOH调节溶液PH， 采用PH计和电导仪记录不同PH下明胶溶液的电导率。
1.3壳聚糖/明胶(GE/CS)复合生物材料等电点
取100mL，1.0％GE溶液于烧杯中，磁力搅拌，水浴温度为50。℃向明胶 溶液中加入一定体积的1.0％壳聚糖溶液，搅拌1h，得到GE/CS均一混合溶液。 壳聚糖与明胶的体积比分别为：4:100、10:100、20：100、50:100、75:100、100:100， 使用1.0％盐酸和0.1mol/L氢氧化钠溶液改变混合溶液的PH，使用PH计和电导 仪测定不同PH条件下明胶/壳聚糖溶液的电导率。
按上述方法测定得到明胶、壳聚糖的等电点以及不同质量比例壳聚糖/明胶 的等电点如表1所示；明胶、壳聚糖以及不同质量比例壳聚糖/明胶的等电点曲 线图如图1所示。
表1明胶、壳聚糖的等电点以及不同质量比例壳聚糖/明胶的等电点
Figure BDA0003301110340000071
Figure BDA0003301110340000081
实施例2止血微胶囊的制备方法
a.称取0.1g明胶和0.1g份甘氨酸于样品瓶中，加入5mL去离子水，置于37℃ 水浴中至完全溶解，向1000u凝血酶中加入3mL去离子水溶解，溶解完全后加 入明胶甘氨酸溶液中混匀，得到凝血酶混合溶液；；
b.称取2.2g明胶于烧杯中，加入12mL，1％醋酸溶液，置于37℃水浴中溶解 完全，向明胶溶液中加入0.22g的壳聚糖，搅拌至完全溶解。向明胶壳聚糖混合 溶液中加入12mL去离子水，然后加入1.0mL，0.1mol/L NaOH溶液调节pH值 至6；
本步骤中，调节pH至6，是因为明胶为两性聚合物，其等电点为5.0，pH 大于其等电点，明胶上明胶分子显负电，即-NH3 +有一部分与-OH-结合转化为-NH2， 从而明胶分子中的-COO-(负电荷)含量大于-NH3 +(正电荷)含量，分子显负电。 当明胶在小于等电点的介质中时，明胶分子显正电，即-COO-有一部分与-H+结合 转化为-COOH，从而明胶分子中的-NH3 +(正电荷)含量大于-COO-(负电荷)含 量，分子显正电。因此调节体系pH至6，使明胶负电荷，壳聚糖带由于在酸性 介质中，其分子上的游离氨基因质子化而带正电，从而使带负电的明胶与带正电 荷的壳聚糖因静电相互作用而发生复凝聚反应；明胶在不同的PH下的电离反应 如式所示：
Figure BDA0003301110340000082
壳聚糖的在酸性介质中质子化反应过程如式Ⅲ所示：
Figure BDA0003301110340000083
Figure BDA0003301110340000091
明胶与壳聚糖复凝聚反应如式IV所示：
Figure BDA0003301110340000092
c.向三口烧瓶中加入138mL的玉米油，置于37℃水浴中，在搅拌条件下加入凝 血酶混合溶液，搅拌5min，然后加入2.0g大豆磷脂乳化剂进行乳化25min，大 豆磷脂是一种两性表面活性剂，其可从大豆中提取，天然无毒；
d.加入明胶/壳聚糖混合溶液进行包覆，时间为60min，温度为37
Figure BDA0003301110340000094
关闭加 热，自然冷却至室温；明胶可发生溶胶和凝胶转变，温度高于35℃时，明胶溶 胀溶解，发生溶胶，当温度低于35℃时，明胶发生凝胶。从而降低温度至室温， 有利于微粒因明胶凝胶而形成较为固定的壳膜，提高微粒的稳定性，有利于下一 步的交联反应；
e.向体系中加入10mL，0.5％的京尼平溶液，在室温下进行交联反应，反应时间 为10h，得到京尼平明胶壳聚糖微胶囊；
本步骤中，京尼平可与含游离氨基聚合物发生交联反应，在酸性条件下，壳 聚糖和明胶上的游离氨基基团亲攻击京尼平C-3位的烯碳原子，二氢吡喃环打开， 形成杂环胺；另外，京尼平上的酯基基团可与氨基发生SN2亲核取代反应，形成 酰胺，释放甲醇，从而形成由短链京尼平为交联桥的三维网状结构聚合物； 京尼平与壳聚糖交联反应过程如式V所示：
Figure BDA0003301110340000093
Figure BDA0003301110340000101
f.将反应得到的微胶囊进行封端，向反应体系中加入2.5mL，1.0％的柠檬酸，并加入冰醋酸，调节pH至2-3，在N2保护下，反应温度升至37
Figure BDA0003301110340000102
反应8h，冷 却至室温，得到柠檬酸改性的止血微胶囊。
本步骤中，京尼平与明胶和壳聚糖上游离氨基反应，产生交联，而壳聚糖和 明胶分子上还存在游离羟基，向反应体系中加入柠檬酸，在一定条件下，柠檬酸 上的羧基与大分子上游离羟基发生酯化反应，对以明胶和壳聚糖为囊壁的微胶囊 进行酯化封端改性；柠檬酸改性明胶壳聚糖结构式如式I所示：
Figure BDA0003301110340000111
g.将反应得到的微胶囊静置2h，明胶/壳聚糖微胶囊沉积在下层，玉米油在上层，倾去上层油相，再取下层微胶囊再进行离心和去离子水洗涤，分离出油相，去除 未反应的京尼平和柠檬酸，即得到改性止血微胶囊。
h.取2.0g明胶加入25mL去离子水，置于水浴温度为45℃下搅拌溶解得到8.0％ 的明胶溶液，快速搅拌40min至呈均匀细腻的泡沫，泡沫体积为原溶液体积的 4～7倍；
i.向步骤h中的明胶泡沫加入步骤g的止血微胶囊4.0g，再搅拌至止血微胶囊 分散均匀；
j.将步骤i中含有止血微胶囊的明胶泡沫快速转移至-10℃预冷1h的模具中，再将其转移至温度为-40℃的条件下预冷冻2h，最后转移至真空冷冻干燥机中，真 空度为0.09-2.0MPa，干燥温度为-10
Figure BDA0003301110340000123
干燥时间为35h，即得到含止血微胶 囊的明胶止血海绵。
实施例3热重分析(TG)
3.1分析方法
称取6mg样品，采用TG/DSC同步热分析仪进行分析，以升温速率为 10℃/min将温度从室温升温至600℃，气体氛围为氮气。
3.2分析结果
不同样品的热分解温度如表2所示，
表2不同样品的热分解温度
Figure BDA0003301110340000122
图2为明胶、壳聚糖、明胶/壳聚糖复合物、京尼平交联明胶壳聚糖和柠檬酸改 性微胶囊的热分析曲线图，由表2和图2可见，经过柠檬酸二次交联得到的微胶 囊的热分解温度最大，达到293℃，其热稳定性较京尼平的一次交联明胶/壳聚 糖高。因此，经过柠檬酸二次交联的微胶囊囊壁强度较大，热稳定较高。
上述结果的原因在于：本专利实施例2采用的是双交联剂，第一次交联采用 的是京尼平，京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然 生物交联剂。第二次交联采用的是柠檬酸，天然存在于柠檬柑橘等果实中，一个 柠檬酸分子上含有三个羧基和一个羟基，在一定反应条件下，柠檬酸可与明胶和 壳聚糖上的羟基发生酯化反应，可进一步对微胶囊囊壁上的明胶/壳聚糖进行交 联固化，从而提高囊壁的强度，增加微胶囊的热稳定性。
实施例4制备过程中微胶囊的光学显微镜观察
采用吸管吸取适量固化后的微胶囊溶液于玻璃载玻片上，置于型号为 WV-CP240/G光学显微镜下观察，并拍照记录。
图3是止血微胶囊合成过程的显微镜图，止血微胶囊的制备过程包括：加入 明胶壳聚糖囊壁乳化，冷却，加入交联剂进行交联。当加入明胶壳聚糖对囊芯进 行包覆，当时间为60min时，微粒的粒径分布较为均匀，稳定性较好。加入京 尼平和柠檬酸交联剂后，得到的止血微胶囊粒径600–800μm，粒径较大。
实施例5凝血酶稳定溶液的止血稳定性测定
凝血酶是通过蛋白酶活化受体(Protease-Activated Receptor PAR)介导 而发挥其激活血小板、凝血和调节细胞活性功能。凝血酶产品主要成分为牛血或 猪血中提取的凝血酶原，经激活而得到凝血酶的无菌冻干品，需密封在4℃～10℃ 保存，当凝血酶配成溶液后，在室温状态下经8h或冷冻后48h内失去活性， 且pH<5时失效。所以为了解决凝血酶配成溶液后其稳定性较差的问题，本发明 采用明胶和甘氨酸作为凝血酶的稳定剂研究其在室温下存放时间与凝血时间的 关系，溶液pH为中性。研究发现，当存放时间达到27天时，其止血时间大约增 大10s；存放56天时，止血时间增大约24s，增幅不大，大表明明胶和甘氨酸是良好的凝血酶溶液稳定剂，凝血酶稳定溶液的稳定性较好。下表3为凝血酶稳 定溶液止血性能表。
表3凝血酶稳定溶液止血性能表
Figure BDA0003301110340000132
实施例6止血微胶囊的止血性能测定
采用本发明实施例2的反相乳化交联法制备W/O型止血微胶囊，比较破裂 微胶囊、未破裂微胶囊、经过水洗后按压破裂微胶囊、凝血酶粉末、凝血酶稳定 溶液的止血性能，五个样品的所含凝血酶单位均为26u。图4为止血微胶囊破裂 后的光学显微镜图片，由图4可见经过按压后为微胶囊破裂，囊芯凝血酶流出来， 发挥凝血作用。
由表4为不同样品的止血性能表，由表4可见，按压后破裂微胶囊的凝血时 间与凝血酶粉末的凝血时间接近，而相同质量未破裂微胶囊的凝血时间达到456 s，对比可见，明胶和壳聚糖可较好包覆凝血酶，得到止血微胶囊。经过水洗后 按压破裂微胶囊则相差较大，凝血时间达到400多秒，可能原因为经过去离子水 洗涤后，部分微胶囊破裂以及未包覆的凝血酶损失造成相同质量微胶囊的凝血时 间延长。
表4不同样品的止血性能表
Figure BDA0003301110340000141
综上，与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明通过微胶囊技术将凝 血酶包裹在具有囊壁结构的微胶囊中，一方面，本发明的微胶囊囊壁结构具有很 好的机械性能，提供的制备方法能够很好地将凝血酶成功包裹到囊壁结构中，另 一方面，本发明的止血微胶囊在使用过程中能够避免受环境温度影响而失活，能 够保持较长时间的活性，克服了现有凝血酶止血材料易变性失活，稳定性较差， 要求冻干后10℃以下低温保存等缺点。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限 于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明 的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之 内。

Claims (10)

1.一种含止血微胶囊的明胶海绵，由明胶海绵和止血微胶囊组成，所述止血微胶囊包含壁材和囊芯物质，其特征在于，所述囊芯物质为凝血酶/甘氨酸/明胶的混合溶液,所述壁材为柠檬酸/京尼平与明胶/壳聚糖交联后形成的聚合物，所述聚合物的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003301110330000011
式(Ⅰ)中:R1至R9选自十八种不同氨基酸甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸氨基、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、赖氨酸的残基中的一种。
2.根据权利要求1所述含止血微胶囊的明胶海绵，其特征在于：所述式(Ⅰ)中：
R5、R6选自十八种不同氨基酸甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸氨基、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、赖氨酸的残基中的一种；
R3、R7为赖氨酸或者精氨酸的残基；
R2、R4、R8为天门冬氨酸或谷氨酸氨基的残基；
R1、R9为丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的残基。
3.一种含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，具体包括如下步骤：
a.将明胶和甘氨酸溶解于水中，然后再加入凝血酶溶液，得到凝血酶混合溶液；
b.将明胶溶解于1.0％醋酸溶液中，得到明胶醋酸溶液，再加入壳聚糖，搅拌使壳聚糖溶解，得到明胶/壳聚糖混合溶液，并调节pH至5.8-6.2；
c.在植物油中加入凝血酶混合溶液，水浴加热后搅拌均匀，然后加入大豆磷脂乳化剂进行乳化；
d.向步骤c后的体系中加入步骤b制得的明胶/壳聚糖混合溶液进行加热，反应完全后关闭加热，自然冷却至室温；
e.向步骤d后的溶液体系中加入京尼平进行交联反应，充分反应后得到京尼平交联明胶/壳聚糖微胶囊；
f.在步骤e后的反应体系中加入柠檬酸，并加入冰醋酸，调节pH至2-3，在N2保护下充分反应，得到止血微胶囊；
g.取明胶加入去离子水，水浴加热并搅拌溶解形成均一明胶溶液，快速搅拌至呈均匀细腻的泡沫；
h.向步骤g中的明胶泡沫加入止血微胶囊，再搅拌至止血微胶囊分散均匀；
i.将步骤h中含有止血微胶囊的明胶泡沫进行真空冷冻干燥，得到含止血微胶囊的明胶海绵。
4.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤f和步骤g之间还包括：将步骤f后的反应体系静置，倾去上层油相后再进行离心和去离子水洗涤，分离出油相，去除未反应京尼平和柠檬酸，即得到纯化的止血微胶囊。
5.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，优选调节pH至6；所述步骤c中所述植物油为玉米油、橄榄油、大豆油、花生油中的一种或几种，水浴加热温度控制为37℃，搅拌速度为600rpm，乳化时间为20-30min。
6.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤d中，加热温度控制为37℃，搅拌速度为400-700rpm，时间为40-80min；所述步骤f的具体步骤为：在步骤e的反应体系中加入质量分数为1.0％的柠檬酸，并加入冰醋酸，调节pH至2-3，在N2保护下将反应温度升至40℃，反应8h后再冷却至室温，得到止血微胶囊。
7.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤g的具体步骤为：明胶质量分数为5-10％，将明胶溶液快速搅拌20-60min形成均匀细腻的泡沫；所述步骤h中明胶与止血微胶囊质量比为1:1至1:4，明胶泡沫与止血微胶囊搅拌时间为20-30min。
8.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤i的具体步骤为：将含有止血微胶囊的明胶泡沫快速转移至-10℃预冷1h的模具中，再将其转移至温度为-40℃的条件下预冷冻2h，最后转移至冷冻干燥机中，真空度为0.09-2.0MPa，干燥温度为-10℃，干燥时间为30-40h。
9.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤e中，加入京尼平的质量分数为0.5％。
10.根据权利要求3所述含止血微胶囊的明胶海绵的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，各组分的配比为：明胶12-32份，壳聚糖1.2-3.2份，1.0％醋酸溶液160-300份，大豆磷脂15-25份，京尼平80-120份，柠檬酸10-35份，植物油800-1800份，凝血酶/甘氨酸/明胶混合溶液50-100份。
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