CN113667706B

CN113667706B - 载氨甲环酸交联多孔淀粉及其制备方法

Info

Publication number: CN113667706B
Application number: CN202111230334.4A
Authority: CN
Inventors: 孙云波; 赵新红; 窦桂芳; 孟志云; 甘慧; 顾若兰; 吴卓娜; 朱晓霞; 孙文种
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-10-22
Also published as: CN113667706A

Abstract

本发明公开了一种载氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料及其制备方法。该载氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料由淀粉酶解制孔、经BOC保护的氨甲环酸发生酰氯反应、酶解淀粉与BOC‑氨甲酰氯发生酯化反应制备而得，其原料包括：淀粉、BOC‑氨甲环酸、氯化亚砜、淀粉酶。本发明提供的载氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料主要原料来源丰富、安全性好、无残留，可广泛用于体内实质性脏器及弥漫性出血等不规则出血的止血应用，止血后不需清创，止血效果可延续至术后，术后可在人体降解吸收。

Description

载氨甲环酸交联多孔淀粉及其制备方法

技术领域

本发明属于医用材料领域，具体涉及一种载氨甲环酸交联多孔淀粉及其制备方法。

背景技术

氨甲环酸在美容及止血领域应用广泛。氨甲环酸退黑除斑的功效比维生素C高约50倍，是果酸的近10倍左右。氨甲环酸能与纤溶酶和纤溶酶原上的纤维蛋白亲和部位的赖氨酸结合位点强烈吸附，阻抑了纤溶酶、纤溶酶原与纤维蛋白结合，从而强烈地抑制了由纤溶酶所致纤维蛋白分解，发挥止血功效。

淀粉是高分子碳水化合物，是由单一类型的糖单元组成的多糖，基本构成单位为α-D-吡喃葡萄糖。目前对淀粉的改性主要有物理、化学或酶法改性，在淀粉分子上引入新的官能团或改变淀粉分子大小和淀粉颗粒性质，从而改变淀粉的天然特性，使其更适合于一定应用的要求。

利用氨甲环酸对淀粉改性的产物主要有载氨甲环酸交联淀粉酯，即淀粉分子中的羟基被有机酸或者无机酸通过酯化作用而得到的一类改性淀粉。淀粉酯化反应常用的方法有干法、水相法、有机溶剂法等。干法酯化是在催化剂存在条件下，干淀粉与有机酸或无机酸的酯化；湿法酯化是在催化剂存在条件下，以水为分散介质，淀粉与有机酸或无机酸的反应；有机溶剂法是淀粉悬浮在惰性有机溶剂中，与有机酸或无机酸的反应。干法制备工艺简单，容易操作，但是反应不均匀；湿法制备最常用，反应均匀，但反应效率不高，取代度低；而有机溶剂法是在有机溶剂中，无催化剂的条件即可发生的反应，反应速率快。复合变性淀粉采用两种以上处理方法得到的变性淀粉：如氧化交联淀粉、交联酯化淀粉、酶解酯化淀粉等，采用复合变性得到的变性淀粉具有两种变性淀粉各自的优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种载氨甲环酸交联多孔淀粉及其制备方法。

本发明所提供的载氨甲环酸交联多孔淀粉是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1）将淀粉溶于磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液中，水浴加热，机械搅拌；然后再加入α淀粉酶和糖化酶，再继续搅拌；加入碱溶液，使体系pH值为10~14，搅拌，使α淀粉酶和糖化酶灭活，离心、洗涤，冷冻干燥得酶解淀粉；

2）将BOC-氨甲环酸与N，N-二甲基甲酰胺、氯化亚砜在二氯甲烷中进行反应，得到BOC-氨甲酰氯；

3）将步骤1）得到的酶解淀粉与步骤2）得到的BOC-氨甲酰氯进行反应，反应结束后离心、洗涤，冷冻干燥，得到所述载氨甲环酸交联多孔淀粉。

上述方法步骤1）中，所述淀粉与磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液的配比为（2~3）g：（50~100）ml；所述磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液的pH值为4~5。所述机械搅拌的转速为300~600rpm。

上述方法步骤1）中，所述水浴的温度为45~55℃；

上述方法步骤1）中，所述加入α淀粉酶和糖化酶，再继续搅拌的时间可为5~10h。

上述方法步骤1）中，所述α淀粉酶的用量为25~75KNU/g淀粉（具体如50KNU/g淀粉）；所述糖化酶的用量为5000~15000U/g淀粉（具体如10000U/g淀粉）。

上述方法步骤1）中，所述碱溶液具体可为氢氧化钠溶液，如0.5M氢氧化钠溶液。

上述方法步骤1）中，加入碱溶液后，所述搅拌的时间可为20~40min。

上述方法步骤1）中，所述离心的条件可为5500rpm*5min。

上述方法步骤1）中，所述洗涤是用去离子水洗涤，具体可洗涤三次。

上述方法步骤1）中，所述冷冻干燥的条件为-60℃、24h。

上述方法步骤1）具体可按照下述步骤进行：称取2~3g淀粉，溶于50~100ml磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液中，50℃水浴，500rpm机械搅拌，加入适量的α淀粉酶和糖化酶，搅拌5~10h，加入15~20ml 0.5M氢氧化钠溶液，使pH值为10~14，搅拌30min，离心5500rpm*5min，去离子水洗涤三次，冷冻干燥得酶解淀粉。

上述方法步骤2）中，所述BOC-氨甲环酸、N，N-二甲基甲酰胺、氯化亚砜、二氯甲烷的配比为（5~10 ）g：（200~400）μL ：（5~11）ml ：（50~100）ml。

上述方法步骤2）中，所述反应的反应温度为25~30℃；反应时间为2~4h。所述反应在搅拌状态下进行，搅拌的转速为300~600rpm。

上述方法步骤2）具体可按照下述步骤进行：5~10 g BOC-氨甲环酸，50~100 ml二氯甲烷溶解，30℃、500rpm回流磁力搅拌10min，加入200~400 μL N，N-二甲基甲酰胺，5~11ml氯化亚砜搅拌2~4h。旋蒸，得BOC-氨甲酰氯粉末。

上述方法步骤3）中，所述酶解淀粉与BOC-氨甲酰氯的质量比为1~2 g：5~10 g。

上述方法步骤3）中，所述反应的反应温度为40~80℃（具体如40℃、60℃或80℃），反应时间为4~12h（具体如4h、8h或12h）。所述反应在搅拌状态下进行，搅拌的转速为300~600rpm。

上述方法步骤3）中，所述离心的条件可为5500rpm*5min。

上述方法步骤3）中，所述洗涤是用去离子水洗涤，具体可洗涤三次。

上述方法步骤3）中，所述冷冻干燥的条件为-60℃、24h。

上述方法步骤3）具体可按照下述步骤进行：1~2 g 酶解淀粉，40~80℃、500rpm磁力搅拌，加入1~10 g BOC-氨甲酰氯，搅拌4~12h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

本发明还提供了上述载氨甲环酸交联多孔淀粉的应用。

本发明所提供的载氨甲环酸交联多孔淀粉的应用是其在制备止血材料中的应用。

本发明还保护一种止血材料。

本发明所提供的止血材料，其活性成分包括本发明所提供的载氨甲环酸交联多孔淀粉。

当然，所述止血材料，其活性成分也可仅为上述载氨甲环酸交联多孔淀粉。

本发明提供的载氨甲环酸交联多孔淀粉止血材料主要原料来源丰富、安全性好、无残留，可广泛用于体内实质性脏器及弥漫性出血等不规则出血的止血应用，止血后不需清创，止血效果可延续至术后，术后可在人体降解吸收。

附图说明

图1为实施例1制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉的红外光谱分析结果图；

图2为实施例1制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉的扫描电镜结果图：A1, A2和A3:马铃薯淀粉；B1, B2 和 B3：酶解淀粉；C1, C2 和C3：载氨甲环酸交联多孔淀粉；

图3为实施例1制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉吸液率结果图；

图4为实施例1制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉的体外细胞毒性试验结果图；

图5为实施例1制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉的急性毒性试验结果图；

图6为实施例制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉的体外凝血时间结果图（*:P小于0.05，结果均与阳性对照欣速聆止血颗粒对比）；其中，照片是实验结果图，描述体外凝血时间记录时，样品凝血的最终状态

图7为小鼠断尾出血模型止血后各组止血材料的止血照片：A载氨甲环酸交联多孔淀粉，B欣速聆止血颗粒组，C空白纱布组。

图8为小鼠断尾出血模型止血过程中失血量的统计（*:P小于0.05，**:P＜0.01，结果均与阳性对照欣速聆止血颗粒对比）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例中所使用的酶的来源如下：

α淀粉酶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：L2008186 ，酶活≥500KNU/g。

糖化酶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：D2102059，酶活100000U/ml。

下述实施例中所使用的欣速聆止血颗粒购自杭州协和医疗用品有限公司，规格1.0g/支。

下述实施例中所使用的淀粉均为马铃薯淀粉。

实施例1：制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（1）称取2g淀粉，溶于100ml pH=4.5的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液中，50℃水浴，500rpm机械搅拌，加入50KNU/g α淀粉酶和10000U/g糖化酶，搅拌6h，加入17ml 0.5M氢氧化钠溶液，使pH值为12，搅拌30min，离心5500rpm*5min，去离子水洗涤三次，冷冻干燥得酶解淀粉。

（2）10 g BOC-氨甲环酸，100 ml二氯甲烷溶解，30℃、500rpm回流磁力搅拌10min，加入200 μL N，N-二甲基甲酰胺，5.646 ml氯化亚砜搅拌3h。旋蒸，得BOC-氨甲酰氯粉末。

（3）1 g 酶解淀粉，40℃、500rpm磁力搅拌，加入3g BOC-氨甲酰氯，搅拌8h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

实施例2：制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（3）1 g 酶解淀粉，60℃、500rpm磁力搅拌，加入3g BOC-氨甲酰氯，搅拌8h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

实施例3：制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（3）1 g 酶解淀粉，80℃、500rpm磁力搅拌，加入3g BOC-氨甲酰氯，搅拌8h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

实施例4：制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（3）1 g 酶解淀粉，80℃、500rpm磁力搅拌，加入3g BOC-氨甲酰氯，搅拌4h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

实施例5：制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（3）1 g 酶解淀粉，80℃、500rpm磁力搅拌，加入3g BOC-氨甲酰氯，搅拌12h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

实施例6、制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（3）1 g 酶解淀粉，80℃、500rpm磁力搅拌，加入5g BOC-氨甲酰氯，搅拌8h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

实施例7：制备载氨甲环酸交联多孔淀粉

（3）1 g 酶解淀粉，80℃、500rpm磁力搅拌，加入1g BOC-氨甲酰氯，搅拌8h，离心5500rpm*10min，去离子水洗涤3次，离心，-60℃冷冻干燥24h得载氨甲环酸交联多孔淀粉。

对比例1、

将马铃薯淀粉与氨甲环酸按照质量比1:5的比例混合，得到物理混合物。

实施例8、实施例6制备的载氨甲环酸交联多孔淀粉的材料表征

1红外光谱：

红外光谱分析采用免压片法，将约1mg样品研磨，均匀的平铺在样品载物台上扫描光谱，测定波数范围4000~600cm^-1。红外光谱分析结果见图1。

经过一系列化学反应合成的载氨甲环酸交联多孔淀粉，其红外光谱与原料马铃薯淀粉相比较有较大的不同之处。马铃薯淀粉在3326cm^-1处为氢键缔合的O-H伸缩振动峰，在2910cm^-1为C-H的不对称伸缩振动峰，在1640cm^-1为C=C伸缩振动峰，在1411cm^-1为-OH面内弯曲振动峰，在1146cm^-1、1076cm^-1和995cm-1处出现的峰是非对称C-O-C伸缩振动峰、C-O伸缩振动峰。氨甲环酸在2921cm^-1处为-CH₂对称伸缩峰，在1635cm^-1处为C=O的伸缩振动峰，在1566cm^-1处为-NH₂的弯曲振动峰，在1491cm^-1处为-CH₂的弯曲振动，在1379cm^-1处为-CH₂的弯曲振动峰，在1328cm^-1处为-CH的弯曲振动峰、CC伸缩振动峰、-CH₂的弯曲振动峰，在1278cm^-1处为-OH的弯曲振动峰、CO伸缩振动峰，在1228cm^-1处为CNH₂的弯曲振动峰、CH₂弯曲振动峰，在1194cm^-1处为CO的弯曲振动峰、CH₂的弯曲振动峰，在1089cm^-1处为CC的伸缩振动峰、COH弯曲振动峰、NH₂弯曲振动峰，在1070cm^-1处为CC弯曲振动峰、CH₂弯曲振动峰，在970cm-1处为CH弯曲振动峰，在921cm^-1为-NH₂的弯曲振动峰、-CH₂的弯曲振动峰，在842、768cm^-1为CC弯曲振动峰、CH₂弯曲振动峰。而载氨甲环酸交联多孔淀粉在3288cm^-1处吸收峰尖锐且发生位移是因为淀粉中O-H伸缩振动峰偏移导致，在1710cm^-1处为酯键中C=O的伸缩振动峰，在1633cm^-1处为-NH₂的剪式振动，在1553cm^-1处为-CH₂的剪式振动，在1398cm^-1处为-OH的面内弯曲振动峰、CO拉伸振动峰，在1203cm^-1处为CC的拉伸振动峰、COH面内弯曲振动峰、NH₂对称弯曲振动峰，在1025cm^-1处为脱水葡萄糖环C-O-C的C-O的伸缩振动峰，在935cm^-1处为-NH₂的摇摆振动峰、-CH₂的摇摆振动峰。综上所述，载氨甲环酸交联多孔淀粉在1710cm^-1处有典型的酯键特征吸收峰，充分说明酯化反应发生，并且取代度已经达到了仪器的检测范围。

2场发射扫描电镜：

测试步骤：将马铃薯淀粉、酶解淀粉和载氨基环酸交联多孔淀粉样品分散于载样台上，经过喷金和抽真空后，使用日立S-4800 型电子显微镜进行扫描和照片采集。

扫描电镜结果图见图2，图中A1, A2 和A3: 马铃薯淀粉；B1, B2 和 B3：酶解淀粉；C1, C2 和C3：载氨甲环酸交联多孔淀粉。

通过扫描电镜结果图发现：马铃薯淀粉颗粒呈卵圆形，表面光滑。酶解淀粉表面变得粗糙，有部分颗粒开始分离，颗粒表面被分解成一些较浅的孔。而载氨甲环酸交联淀粉表面粗糙，淀粉酯化过程后，淀粉的晶体结构和团粒结构受到破坏，加之淀粉氢键的断裂也会导致淀粉表面粗糙现象，发生酯化反应时，酸性环境同样会使淀粉有序结构遭到破坏，得到表面粗糙多孔的酯化淀粉颗粒。

3取代度：

称量1~2g载氨甲环酸交联多孔淀粉置于50ml锥形瓶中，加入15~30ml去离子水，5~10ml无水乙醇，20~40ml 0.5M NaOH 溶液，50℃水浴、600rpm搅拌3h，加入100-200μL1%酚酞，溶液变红色，用0.5M 盐酸标准返滴定多余的氢氧化钠，直至溶液颜色消失，记录消耗盐酸标准溶液的体积。以酶解淀粉做空白，平行测定3次。

酯基含量A=[（V-V_空白）×10-3×C_HCl×M_{氨甲环酸残基}×100%]/W_称量量=[（19.2-13.8）×10-3×0.5×140.21×100%]/1=37.612%

取代度=162A/[M_{氨甲环酸残基}×100-（M_氨甲环酸-1）×A]

=162*0.37612/[14021-（140.21-1）×0.37612]=0.436（中取代）

载氨甲环酸交联多孔淀粉取代度的测定是通过酸碱滴定法测定的，取代度小于0.2属于低取代，在0.2-2之间属于中取代，大于0.2属于高取代，载氨甲环酸交联多孔淀粉取代度为0.436，属于中取代。

4吸液率：

（1）分别称取0.1g*3马铃薯淀粉、0.1g*3酶解淀粉、0.1g载氨甲环酸交联多孔淀粉，备用。

（2）连通器原理：砂芯漏斗筛板与移液管相平，漏斗内及橡胶管内全部储满PBS液（实验装置图见图3（左））。

（3）样品均匀洒在砂芯漏斗筛板上，初始20s记录体积，之后每隔10s记录一次。

结果见图3（右）。根据吸液率实验结果可知：相对于酶解过程，酯化过程对淀粉吸液率的影响较大，结合扫描电镜结果图可知，淀粉酯化后，颗粒表面出现粗糙现象，同时颗粒表面出现较多的微孔，大大增加材料的比表面积，增加吸液体积。

实施例9、载氨甲环酸交联多孔淀粉的安全性测试

1体外细胞毒性实验：

（一）样品浸提

参照“国家标准医疗器械生物学评价-第十二部分：样品制备与参照样品”（GB/T16886.12-2017），0.4g载氨甲环酸交联多孔淀粉加入4.4mL的无血清DMEM培养基，37℃浸提24h，所得浸提液上清按体积比加入10 %胎牛血清混匀即为100 %浸提液，另将该100 %浸提液以含10 %胎牛血清的DMEM培养基等比稀释混匀即为75%浸提液、50 %浸提液、25%浸提液。

1g马铃薯淀粉加入5mL的无血清DMEM培养基，37℃浸提24h，浸提液处理方式同载氨甲环酸交联多孔淀粉，分别得到100%浸提液、75%浸提液、50%浸提液、25%浸提液。

（二）实验步骤：

（1）取生长旺盛的L929细胞，常规0.25%胰酶-EDTA溶液消化，血细胞板计数，完全培养基稀释成1×10⁵ /mL细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔培养板。置于5%(v/v)二氧化碳混合空气、37℃恒温细胞培养箱内预培养24 h。

（2）培养24h后弃去旧培养基，实验组分别加入100 μL100 %浸提液、75 %浸提液、50 %浸提液和25 %浸提液，阴性对照组加入100 μL 含10%肽牛血清培养基，阳性对照组加入100 μL0.2%的苯酚溶液，继续培养24 h。

（3）培养24 h后取出培养板，弃去各孔中的液体，每孔加入50 μL新鲜配制的MTT溶液，继续放入培养箱培养3~5 h。

（4）取出培养板，弃去各孔内液体，每孔加入 100 μL异丙醇，震荡摇匀至充分溶解。酶标仪570 nm波长测定吸光度(O.D.值)。参比波长 650 nm。

按下述计算细胞相对增殖度（Relative Growth Rate，RGR）。

RGR (%)=（试验样品100%浸提液光密度平均值/空白光密度平均值）×100%

注：存活率较低时，试验样品潜在的细胞毒性较高。如存活率下降到＜空白的70%，则具有潜在的细胞毒性。

结果见图4。由图4可知，以阴性对照组细胞增殖率为100%参照，阳性对照组细胞相对增殖率仅为阴性对照组的2.0%，说明建模成功，结果数据可靠。载氨甲环酸交联多孔淀粉和马铃薯淀粉的100%浸提液、75%浸提液、50%浸提液和25%浸提液相对于阴性对照组的相对细胞增殖率均值均大于70%，提示样品载氨甲环酸交联多孔淀粉在体外对L929成纤维细胞无细胞毒性。

2急性毒性试验：

（一）样品浸提

参考GB/T 16886.12-2017医疗器械生物学评价第十二部分样品制备与参照样品。准确称取0.88 g载氨甲环酸交联多孔淀粉，用10.4ml生理盐水在37℃条件下浸提24小时。准确称取2g马铃薯淀粉，用10ml生理盐水在37℃条件下浸提24小时。

（二）实验步骤

（1）健康昆明种小鼠，18只，18-22 g，雄性，随机分成3组，分别随机设定为生理盐水组、马铃薯淀粉实验组和载氨甲环酸交联多孔淀粉实验组。

（2）给药剂量和途径：实验组按50 mL/kg剂量腹腔注射给予对应组的生理盐水浸提液；对照组动物按 50 mL/kg 剂量腹腔注射给予生理盐水。

（3）观察：给药后观察各实验组和对照组动物的一般状态（精神状态、外观、大小便、进食情况）、毒性表现，记录死亡动物数。给药后一周记录动物体重。

结果见图5。两实验组与对照组动物的一般状态均良好，小鼠饮食、行为等一般情况无异常，各组动物均无死亡。如图5所示，马铃薯淀粉和载氨甲环酸交联多孔淀粉实验组浸提液小鼠腹腔注射后，1天后小鼠体重呈稳定上升趋势，与对照生理盐水组小鼠反应一致，表明马铃薯淀粉和载氨甲环酸交联多孔淀粉无全身急性毒性反应。

实施例10、载氨甲环酸交联多孔淀粉的有效性

1体外凝血时间试验：

载氨甲环酸交联淀粉体外凝血而时间测定：

（1）取若干规格5ml离心管，备用。精确称量30mg所得载氨甲环酸交联多孔淀粉样品置于离心管中，以空白离心管做阴性对照，欣速聆止血粉为阳性对照（用量为30mg），对比例1物理混合物的用量为30mg。

（2）新西兰兔（雄性，2.0-2.5kg）称重，1ml/kg剂量耳缘静脉注射、兔子仰卧固定，股动脉快速取血，立即向每个离心管管内加入1ml新鲜血液，轻轻晃动，使材料与血液充分接触，37℃水浴条件，每15s倾斜一次离心管，以血液不流动为止，记录凝血时间。

结果见图6。由图6可知，新西兰兔空白组血液凝固时间为830s，与空白组相比较，其他实验组显著缩短凝血时间。与阳性对照组欣速聆止血颗粒相比较，实施例6载氨甲环酸交联多孔淀粉血液凝固时间显著降低（p＜0.05）。与物理混合物组相比，载氨甲环酸交联多孔淀粉血液凝固时间显著降低（p＜0.05）。而且载氨甲环酸交联多孔淀粉可以与血液充分接触，发挥止血性能，而不会形成一层膜，进而阻止血液与止血材料的接触，导致在材料的表面发挥止血的功效。

小鼠断尾止血：

空白纱布、欣速聆止血颗粒和载氨甲环酸交联多孔淀粉分别准确称取100mg，置于2ml离心管中作为样品。雄性昆明小鼠33-39g左右，30只，按体重随机分成3组，每组10只，按50mg/kg剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠水溶液麻醉，将小鼠固定于鼠板，尾巴自由下垂，量取尾巴长度，自尾尖，使用手术剪刀断尾1/2长度，自由出血10s（记录自由出血量），后插入至离心管中，轻轻按压。按压2min后，取出，如继续出血则插入另外一份样品中，同样止血2min，取出观察。鼠尾自然下垂，十分钟内，无活动性出血则记为止血成功；如两次按压止血后，仍未止住出血则记为止血失败，每只小鼠止血过程中最多按压两次；如第一次按压止血后便止血成功，则不再进行第二次按压止血。小鼠断尾出血模型止血后各组止血材料的止血照片见图7。

表1止血材料在小鼠断尾模型中止血效果的比较（n=10）

据图8和表1可知，各组小鼠断尾10s内自由出血量组间无显著性差异（P＞0.05），说明模型创建成功，重现性良好，各实验组具有可比性。载氨甲环酸交联多孔淀粉止血迅速、效果稳定，止血成功率100%，并且止血按压次数小于另外两组止血材料，出血量显著小于欣速聆止血颗粒（P＜0.05）。综上所述，在小鼠断尾模型止血实验中，与国内同类止血材料相比，载氨甲环酸交联多孔淀粉可以有效的应对小型动静脉的出血情况。

Claims

1.一种载氨甲环酸交联多孔淀粉的制备方法，包括下述步骤：

1）将淀粉溶于磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液中，水浴加热，机械搅拌；然后再加入α淀粉酶和糖化酶，继续搅拌；接着加入碱溶液，调节体系pH值为10~14，使α淀粉酶和糖化酶灭活，离心、洗涤，冷冻干燥得酶解淀粉；

3）将步骤1）得到的酶解淀粉与步骤2）得到的BOC-氨甲酰氯进行反应，反应结束后离心、洗涤，冷冻干燥，得到所述载氨甲环酸交联多孔淀粉；

所述步骤1）中，所述淀粉与磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液的配比为（2~3）g：（50~100）ml；

所述磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液的pH值为4~5；

所述水浴的温度为45~55℃；

所述步骤1）中，所述α淀粉酶的用量为25~75KNU/g淀粉；所述糖化酶的用量为5000~15000U/g淀粉；

所述加入α淀粉酶和糖化酶，再继续搅拌的时间为5~10h；

所述步骤2）中，所述BOC-氨甲环酸、N，N-二甲基甲酰胺、氯化亚砜、二氯甲烷的配比为（5~10 ）g：（200~400）μL ：（5~11）ml ：（50~100）ml；

所述步骤2）中，所述反应的反应温度为25~30℃；反应时间为2~4h；

所述反应在搅拌状态下进行，搅拌的转速为300~600rpm；

所述步骤3）中，所述酶解淀粉与BOC-氨甲酰氯的质量比为（1~2）：（5~10）；

所述反应的反应温度为40~80℃，反应时间为4~12h；所述反应在搅拌状态下进行，搅拌的转速为300~600rpm。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，

所述碱溶液为氢氧化钠溶液；加入碱溶液后，所述搅拌的时间为20~40min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，

所述离心的条件为5500rpm*5min；

所述洗涤是用去离子水洗涤，洗涤的次数为三次；

所述冷冻干燥的条件为-60℃冷冻24h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，

所述离心的条件为5500rpm*5min；

所述洗涤是用去离子水洗涤，洗涤的次数为三次；

所述冷冻干燥的条件为-60℃冷冻24h。

5.权利要求1-4中任一项所述方法制备得到的载氨甲环酸交联多孔淀粉。

6.一种止血材料，其活性成分包括权利要求5所述的载氨甲环酸交联多孔淀粉。