JPS63258579A - 生理活性物質固定化用担体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｘ産業上の利用分野】 本発明はアミノ基を有する酵素等の生理活性物質を固定
化させるのに好適な担体の製造法に関するものである。 Ｋ従来の技術】 従来、キトサンを用いて生理活性物質を固定化させるた
めに、キトサンのアミノ基を利用してゲルタールアルデ
ヒド等のジアルデヒドを用いることはかなり以前より知
られており、又、カルボジイミド試薬によるペプチド結
合による方法も特公昭５３−１０１５０＠に開示されて
いる。水元明石等は先に特願昭６０−２１０７３１号と
して多孔質キトサン粒状体をＮ−アセチル化し、多孔質
キチン粒状体となし、架橋剤で処理後カルボキシアルキ
ル化しその後で脱アセチル化処理して担体を得ること、
特願昭６０−２１８９８０号として多孔質キトサン粒状
体を有償溶媒中でアシル化剤で処理して担体を得る方法
、特願昭６１−１８８２５９号で多孔質キトサン粒状体
をジカルボン酸誘導体で架橋後アセチル化して担体を得
ること、又、特願昭６１−１８８２６０号で多孔質キト
サン粒状体を過剰のジカルボン酸エステルで処理する方
法を提案して９＼る。 Ｋ発明が解決しようとする問題点】 多孔質キトサン粒状体をゲルタールアルデヒド等のジア
ルデヒドで処理して担体とした場合、酵素等を固定化す
るときにアミノ基とアルデヒド基間が、シッフ塩基の形
で結合するために酸に弱い性質となってしまう。また還
元すれば結合は強くなるが、酵素等が変性し易いもので
は使用する）！元剤とその処理方法が限定されてしまう
欠点がある。又、カルボジイミドで処理する場合には酵
素等との結合がアミド結合となり、酸、アルカリに対す
る性質は改善されるが固定化に際してのＰＨ調卯に手間
を要し、Ｆｆ素等を変性させる可能性が大きい。ジカル
ボン酸活性エステルで処理した担体では酵素等の固定は
アミド結合によるものであり、しかも温和な条件で固定
化が可能であるが、残存アミノ基が必ず生じるために、
アミノ基のイオン性による非特異的吸着を生じる可能性
が大きい。 本発明は、上述の欠点を解決し、耐酸性に勝れ固定化も
容易であって、更に固定化後の非特異的吸着をも解決し
た生理活性物質固定化用担体を得ることを目的とする。 Ｋ問題点を解決するための手段】 本発明は、カルボキシル基を有する粒状多孔質キトサン
誘導体を、ジシクロヘキシルカルボジイミドの等のカル
ボジイミド類結合剤と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
で処理する生理活性物質固定化用担体の製造法である。 多孔質キトサン粒状体は、先に特開昭６１−４０３３７
号で開示した方法によって得ることができる。 多孔質キトサン粒状体の製造に使用するキ１ヘサンは、
特に限定はないが平均分子量が１０．０００〜２３ｏ。 ０００の低分子量キトサンを用いることが好ましい。 キトサンは酢酸、ジクロル酢Ｍ、’ＩＨＩ等の単独若し
くは混合物の水溶液に溶解し、キ１へサン酸性水溶液と
する。キトサン酸性水溶液の濃度は２〜２０％が好まし
い。該キトサン酸性水溶液は、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、炭酸ナトリウム。 炭酸カリウム、アンモニア、エチレンジアミノ等のアル
内り性物質を含む塩基性水溶液中で凝固再生させる。こ
の時、塩基性水溶液にアルコール等を加えて使用するこ
ともできる。 咳キトサン水溶液を吐出孔より圧力下で塩基性水溶液中
に一定量づつ落下させて凝固再生させ、中性になる迄充
分水洗を行い、多孔質主１−サンを得る。多孔質キトサ
ンは、必要に応じ、更に極性溶媒中で有機ジイソシアネ
ート化合物を用いて架橋処理を行ってもよい。 上述の如くして得た多孔質キトサン粒状体からカルボキ
シル基を有する粒状多孔質キトサン誘導体を得るには、
ジカルボン酸無水物によるアシル化の方法、ジカルボン
酸ハロゲン化物による方法又はモノクロル酢酸等による
カルボキシアルキルによる方法等を採用すればよい。ま
た、キトサンの残存アミノ基をブロックするために無水
酢酸でアミノ基をアセチル化させる。このようにして得
られたカルボキシル基を持つ粒状多孔質キトサン誘導体
を極性溶媒例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド、
ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホオキシド、テ１
〜ラヒドロフラン等に懸濁させた後に、Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミドを加え更にジシクロヘキシルカルボジイ
ミド イミド系の結合剤を加え数時間攪拌反応させる。 反応後、該粒状体を使用した極性溶媒で充分洗浄するこ
とにより優れた生理活性物質固定化用担体を得ることが
できる。

【実　施　例】

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施
例記載の範囲に限定されるものではない。 尚、イオン交換容量及び比表面積は、下記の方法により
求めた。 ◎イオン交換容量 試料約５０成をＩＮ−ＨＣＩ　５００厩中でゆるやかに
攪拌しながら、１時間処理し、脱イオン水で中性になる
迄充分洗浄し、空気中の炭酸ガスを吸収させない様に注
意しながら脱水した試料３０ｄを正確に迅速に計りとり
、１１５Ｎ　−　ＮａＯ８　５００ｄ中に投入し、ゆる
やかに攪拌しながら５時間放置する。この上澄液を試験
液とする。これを１０ｄ搾取し、メチルレッド溶液を指
示薬として１／１０　Ｎ−ＨＣｌで中和滴定し次式で求
めた。 ■×１６ ａ：試験液１０成を中和するに要した１／１０　Ｎ−Ｈ
Ｃ！Ｑ吊 ｂ：試料を入れる前の１１５Ｎ−ＮａＯＨ１０戒を中和
するのに要した１／１Ｏ１０Ｎ−１−１ １：　１／１０　Ｎ−ＨＣ，９の力価 Ｖ；湿潤試料量（３０ｄ　） ◎比表面積：比表面積測定装置を用いてＢＥＴ法で測定
した。 実施例１ 脱アセチル化度７７％、平均分子ｆｆ１４２，０００の
キトサン７０ｇを３．５％酢酸水溶液９３０ｇに溶解し
、該溶液を７％の苛性ソーダ、３０％のエタノール、６
３％の水からなる混合溶液中に０．１５．、φの孔径ノ
ズルから落下させ、凝固再生させた後、中性になるまで
水洗し、平均粒径０．１順φの多孔質キトサン粒状体０
．８１を臂だ。得られた多孔質キトサン粒状体１００戒
（湿潤状態）に５，０りのへキサメチレンジイソシアネ
ートを加え、ジメチルホルムアミド中で常温１時間攪拌
反応させ架橋させた。ジメチルホルムアミドで洗浄後、
ジメチルホルムアミド１００厩中１２．２ｇの無水酢酸
を加え、常温で２４時間攪拌しアミノ基をアセチル化さ
せ、これを４８°Ｂｅ苛性ソーダでＯ″Ｃ２１時間浸潤
後、イソプロピルアルコールで充分洗浄し、イソプロピ
ルアルコール１ｏｏｉ中にモノクロル酢Ｈ１ｏｇを加え
１時間反応させてカルボキシメチル化を行った。水洗し
てカルボキシル基を有する粒状多孔質キトサン誘導体９
５−を得た。これのイオン交換容量は０、３５１ｅｑ／
　ｒｄ　、比表面積は９４ｍ／９であった。該粒状体５
０成をジオキサン１００威中に懸濁した後、ジシクロへ
キシル力ルボジイミ°ドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドを共に０．１Ｍになる様に加え、常温で２時間反応さ
せジオキサンとメタノールで充分洗浄して比表面積９１
ｍ／！７の生理活性物質固定化用担体４８ｄを得た。該
担体１ｄを１％Ａｊグロビン溶液（０，１ＭホウＭａ！
衝溶液、　ＰＨ８，３）　　２ｄに加え、２時間振盪し
て固定化した。固定化量を５７Ｏｎ１Ｍの吸光度から測
定した処、３．３ｔｔｒｙ／−であった。又、ヘモグロ
ビンを固定化した担体を１〜の１％牛血清アルブミン溶
液（０，ＩＮ　トリス−８１２ｍ１Ｉｉｉ液、　ＰＨ７
，４＞　　２−中に入れ２時間振盪し牛血清アルブミン
を吸着させ、上澄液の２８０ｎｔａにおける吸光度から
吸着量を測定したら１．２３り／−で非特異的吸着が少
なかった。更にヘモグロビンを固定化した担体の１ｒｄ
！を０．１Ｎ−ＨＣ，９２−中に入れて１５分振盪後上
澄液の５７０ｎｌにおける吸光度によって脱落量を測定
したところ、０．０５ａｇ／戒で殆ど酸に対する脱落も
なかった。 実施例２ 実施例１と同様にして（ｑだ粒状多孔質キトサン１００
ｍ１をエタノール１００戴に懸濁させ無水コハク酸２．
Ｏｇを加え常温で２４時間反応させた。その後エタノー
ルで充分洗浄後エタノール１０〇−中に無水酢１１２．
２ｇを加え、１時間攪拌してアミノ基をブロックさせカ
ルボキシル基を有するイオン交換容量０．２５１１ｅｑ
／　ｍ　、比表面積６３．５ＴＩｔ／９の多孔質キトサ
ン誘導粒状体９５ｄｌｆｆだ。該粒状多孔質キトサン誘
導体５０Ｉｒｔｌを実施例１と同様にジオキサン中でジ
シクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドで活性エステル化して比表面積７２．３ＴＩｔ
、７ｇの生理活性物質固定化用担体４０威を得た。 該担体１１ｄを用いて実施例１と同様にヘモグロビンを
固定したところ、固定化量は８．４４／−で、牛血清ア
ルブミン吸ｆｉｌは０．９５■／威、　　０．ｌＮ−Ｈ
Ｃｌ処理後の脱落量は０．０６７１ｇ／−で非特異吸着
が少なく、脱落が殆どないことが確認された。 実施例３ 平均分子ｆｆ１４５，０００．脱アセチル化度８２％の
キトサン７０ｇを３．５％酢酸水溶液９３０ｇに溶解し
、該溶液を１０％の苛性ソーダ、３０％のメタノール、
６０％の水よりなる混合溶液中に０．１５１１ＩｊＩφ
の孔径ノズルより落下させ、凝固再生させた後、中性に
なる迄水洗し平均粒径０．３ａφの多孔質キトサン粒状
体１１を得た。 該粒状体１００ｄをジオキサン１００ｉ中でアジピン酸
ジクロリド８．３ｇとトリエチンアミノ１２．０ｇを加
え常温で１時間攪拌反応させた。その後充分エタノール
で洗浄し、１００ｄエタノール中で１２．２９の無水酢
酸を加え、常温２４時間攪拌し残存アミノ基をアセチル
化し、充分水洗して交換容量０．３１＋１ｅＱ／ｄ、比
表面積８５．２ＴＩｔ／ｇのカルボキシル基を有する粒
状多孔質キ（・サン誘導体８８成を得た。 該粒状多孔質キトサン誘導体５０ｄを実施例１と同様に
ジオキサン１００ｉ中でジシクロヘキシルカルボジイミ
ドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドで活性エステル化し
て、比表面ｖ４Ｂ３．８ｒｒｔ／ｇの生理活性物質固定
化用担体４５戒を得た。 該担体１戒を用い実施例１と同様にヘモグロビンを固定
したところ、固定化量は１２．３ｍｇ／ｄ、牛血清アル
ブミンの吸１ｔｆｆｉは０．７５ｍｇ／ｍＡで、０．１
Ｎ−ＨＣＪｇ処理後の吸光度によって測定した脱落量は
　０．１１１Ｒｙ／戒で非特異吸着が少なく脱落が殆ど
ないことが確認された。 比較例１ 実施例１と同様の操作で冑だ多孔質キトサン粒状体１蛇
を１０％のゲルタールアルデヒド水溶液２−に加えて常
温で２時間振盪した後充分水洗し、これに１％のヘモグ
ロビン水溶液２ｄを加えて常温で２時間振通してヘモグ
ロビンを固定化した。 固定化量は１４．３＃／−である。この担体１−に０、
ＩＮ　−１１ｃ℃を加えて１５分間振虐した結果７．Ｏ
ＩＲｇ／成のヘモグロビンが脱落した。 比較例２ 実施例３の方法で得られた多孔質キトサン粒状体１００
厩を１００戒のジメチルホルムアミドで洗浄した後、予
め３２ｇのアジピン酸ジーＮ−ヒドロキシスクシイミド
エステルを加温溶解したジメチルホルムアミド５００−
を加え、２時間７０°Ｃで殴拌し架橋反応を行った。反
応後ジメチルホルムアミド５００−で四回洗浄し、更に
水で洗ってジメチルホルムアミドを除去して比表面積８
８．３ｒＩｔ／ｇの担体を得た。この担体１ｉにヘモグ
ロビン１％溶液（０，ＩＭホウ酸＃ｆｉ衝溶液、　ＰＨ
８，３＞　　２戒を加え室温で２時間振盪したところ、
１３．ｈ＋ｙ／ｄのヘモグロビンが固定化された。この
ヘモグロビン固定化担体１ｄを１％牛血清アルブミン溶
液（０，１Ｈ１゛リス−ＨＣλ緩Ｗｇ溶液、　ＰＨ７，
４＞　　２戒中に入れ牛血清アルブミンの吸着量を残液
の吸光度から測定したところ、５．３１Ｒｇ／ｍｌの牛
血清アルブミンが吸着され、非特異吸着が大きいことが
示された。 ｒ発明の効果！ 本発明よる生理活性物質固定化用担体は、多孔性で比表
面積の大きい粒状多孔質キトサン誘導体から得られるも
のであるので、比表面積が大きく、吸Ｗｆｆｉが大きく
、特に耐酸性に勝れている点に特徴がある。更に、本発
明による生理活性物質固定化用担体は、カルボキシル基
を有する粒状多孔質主１−サン誘導体をカルボジイミド
類結合剤を用いてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドで処理
したものであり、また、残存アミノ基がブロックされて
いるので、非特異吸着を極めて少くすることが可能であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カルボキシル基を有する粒状多孔質キトサン誘導体
   をジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシコ
   ハク酸イミドで処理することを特徴とする生理活性物質
   固定化用担体の製造法。 ２、該カルボキシル基を有する粒状多孔質キトサン誘導
   体の残存アミノ基がアセチル化されているものであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生理活性
   物質固定化用担体の製造法。