JPH0236233B2

JPH0236233B2 -

Info

Publication number: JPH0236233B2
Application number: JP61188259A
Authority: JP
Inventors: Mitsunori Itoyama; Hiroaki Yabe
Original assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Current assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Priority date: 1986-08-11
Filing date: 1986-08-11
Publication date: 1990-08-16
Also published as: JPS6344884A

Description

【発明の詳細な説明】

〓産業上の利用分野〓本発明は、有用な酵素であるリゾチームの精製
に好適なアフイニテイークロマトグラフイー担体
を提供するものである。〓従来の技術〓リゾチームは酵素の中でも比較的多量に存在し
ているもので、例えば卵白から精製するときは等
電点沈澱法により、比較的容易に結晶として得る
ことができる。しかし、細菌、細胞等からリゾチ
ームを精製する場合には、その含有濃度が極めて
希薄であるために、長時間とかなりの手間を必要
とする。アグリカルチユラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Agricultural and
Biological Chemistry）37(3)巻、465〜470頁、
1973年の報文には、キチン粉末を利用したアフイ
ニテイークロマトグラフイーによる精製法及び、
セルロース粉末にアルカリキチンをコーテイング
して酸性溶液でキチン化する、セルロースにキチ
ンをコーテイングしたものを用いてリゾチームを
精製する試みが発表されている。しかし、キチン
そのものを粉砕し粉末にして使用した場合には、
水とのなじみも悪く、カラムに充填した際にも通
液性等に問題があり、又リゾチームの吸着量が低
い欠点がある。キチンコーテイングセルロースはキチン粉末よ
り水になじみ易い点は勝れているがキチンがセル
ロース粉末の表面のみを覆つているため持ちが悪
く吸着量もそれ程高くなく、又、セルロースが粉
末のため通液性を悪くする欠点がある。又、キチ
ンはリゾチームの基質であるため、長時間にわた
る使用時その分解を防ぐために、低温で使用しな
ければならないという制約があつた。〓発明が解決しようとする問題点〓本発明は、リゾチームの吸着量が高く、カラム
に充填した際の通液性に優れた、多孔質キチンよ
りなるリゾチーム精製用アフイニテイークロマト
グラフイー担体を得ることを目的とする。多孔質粒状キトサンをアセチル化することによ
りキチンの多孔質化とその比表面積の増大によ
り、リゾチーム吸着量の増大化を計ることが考え
られるが、リゾチーム受容量を増しても更に、粒
状体の強度を向上させる必要がある。粒状体の強
度を向上させるために架橋反応を行う場合、架橋
剤として非特異的な吸着を増大させるような試薬
を用いることは避けなければならない。このよう
な条件を満足する架橋剤について本発明者等は検
討した結果、ジカルボン酸誘導体が架橋剤として
勝れていることを見出して本発明をなすに至つた
ものである。〓問題点を解決するための手段〓本発明は、多孔質粒状キトサンをジカルボン酸
誘導体で架橋させた後、アセチル化剤でアセチル
化して得られる新規なリゾチーム精製用アフイニ
テイークロマトグラフイー担体に関するものであ
る。本発明に用いる多孔質粒状キトサンの製造法
は、特開昭61−40337号に開示された方法で作ら
れる。即ち、平均分子量が10000〜230000低分子
量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸の単独、
若しくは混合物の水溶液に溶解し、該溶液を塩基
性溶液よりなる凝固浴中に落下せしめて多孔質粒
状キトサンを得る。凝固浴としては、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモ
ニア、エチレンジアミン等のアルカリ性物質を
水、又はメタノール、エタノール等の極性を有す
るアルコール類、又は水とアルコールとの混合物
に加えたものを用いる。上記のような方法で製造された多孔質粒状キト
サンを常温で約24時間ジカルボン酸誘導体と溶媒
中で撹拌して架橋反応をさせる。架橋剤として
は、ジカルボン酸の誘導体であるジカルボン酸の
活性エステルの例えば、ジ―ｐ―ニトロフエニル
エステル、ジ―Ｎ―ヒドロキシスクシイミドエス
テル等もしくは酸クロライド、酸ブロマイド等の
ジカルボン酸ハロゲン化物が用いられる。そして
ジカルボン酸としては一般式のｎが０〜８の範囲にあるシユウ酸、アジピン
酸、セバシン酸を用いるのが好ましい。ジカルボン酸を活性化することなく、直接キト
サンと架橋させるためには、ジシクロヘキシルカ
ルボイミド等の縮合試薬を用いれば可能である
が、ジカルボン酸をキトサンのアミノ基のみに反
応させることは困難で、キトサンの水酸基とも反
応しエステル結合を生ずる。このエステル結合は
アルカル域で脱離しやすくアルカリ域で使用する
ときには脱離しカルボン酸を生じ、これにより非
特異吸着を起こし不都合となる欠点がある。これ
らの架橋剤を溶解させる溶媒としてはジメチルホ
ルムアミド、ジメチルアセトアミド等が用いら
れ、架橋剤の濃度は望ましい吸着能に応じて自由
に選択可能であるが、キトサンのアミノ基残基当
り0.1〜1.5当量モルの架橋剤濃度が好ましい。架橋反応後、未反応の架橋剤を溶媒で充分洗浄
除去し、次いでこのジカルボン酸誘導体で架橋さ
せた多孔質粒状キトサンをアセチル化剤でアセチ
ル化させ、中性になるまで充分洗浄し、ジカルボ
ン酸誘導体で架橋させた多孔質粒状キチンとす
る。アセチル化剤としては架橋剤に影響の少いもの
として無水酢酸、アセチルクロライド、アセチル
ブロマイドが好ましい。アセチル化処理はアセチ
ル化剤をジメチルホルムアミド、ジメチルアセト
アミド等の溶剤に溶解して使用する。このリゾチ
ーム精製用アフイニテイークロマトグラフイー担
体を使用する際には、例えばトリス―HCI緩衝液
等公知の方法で処理して使用する。〓実施例〓以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、本
発明はこれらの範囲に限定されるものではない。実施例１脱アセチル化度98.0％、分子量約45000のキト
サン70ｇを3.5％酢酸水溶液930ｇに溶解させて、
濃度７％の溶液とした。これを孔径0.25ｍ／ｍφ
のノズルから苛性ソーダ７％、エタノール30％の
水溶液中に落下させて成形し、粒径１ｍ／ｍφの
多孔質粒状キトサン１を得た。これを充分水
洗、湯洗を行つた後、10mlを採取しジメチルホル
ムアミドで一回洗浄後、アミノ基残基当り0.1モ
ルのアジピン酸ジ―Ｎ―ヒドロキシスクシイミド
エステルのジメチルホルムアミド溶液を加え、室
温で一日撹拌して架橋した。未架橋のアジピン酸ジ―Ｎ―ヒドロキシスクシ
イミドエステルをジメチルホルムアミドを用いて
洗浄除去し、無水酢酸を0.5ｇ加えたジメチルホ
ルムアミド50ml中で室温で一日撹拌し、未反応の
アミノ基をアセチル化させる。続いて充分に水洗
し、1N―NaOH水溶液中で室温で１時間撹拌し
た後、洗液が中性になるまで充分水洗した。得ら
れた粒状物（試料）は、比表面積93.0m²／ｇの
多孔質のリゾチーム精製用のアフイニテイークロ
マトグラフイー担体であつた。同様に上記の多孔
質粒状キトサンをアミノ基残基当り0.5モル、1.0
モルのアジピン酸ジ―Ｎ―ヒドロキシスクシイミ
ドエステルでそれぞれ処理した比表面積が92.5
m²／ｇと95.3m²／ｇの粒状物（試料及び試料
）と、1.0モルのセバシンン酸ジ―Ｎ―ヒドロ
キシスクシンイミドエステル及び0.4モルのアジ
ピン酸クロライドでそれぞれ処理した比表面積
96.7m²／ｇと88.3m²／ｇの粒状物（試料及び試
料）とを得た。尚、上記多孔質粒状キトサンの
比表面積は、試料を液体窒素中で急冷凍結し、
10^-4トール（Torr）、−40℃、８時間真空乾燥し、
140℃、40分間脱ガス後比表面自動測定装置（島
津マイクロメリテイツクス2200形）にてBET法
で測定した。これら５種の粒状物を、それぞれトリス―塩酸
緩衝液中に充分浸漬後、夫々１mlをとり１％牛血
清アルブミン（以下BSAと略記する）溶液２ml
に浸漬してBSAを吸着させ、280nmの吸光度よ
りその吸着量を測定した。又、同様にこれら粒状
物を0.5％リゾチーム溶液２mlに浸漬し、吸光度
280nmより吸着量を測定した。参考例として上記のようにして得られた多孔質
粒状キトサンを単にアセチル化させた多孔質粒状
キチン及び多孔質粒状キトサンに上記BSA、リ
ゾチームをそれぞれ吸着させてその吸着率を求め
た。また、比較例として、本発明による架橋剤で
あるアジピン酸ジ―Ｎ―ヒドロキシスクシイミド
エステルの代りにエピクロルヒドリン等量モルで
架橋後アセチル化したものについてもBSA、リ
ゾチームの吸着を行つた。以上の結果を第１―
１，１―２表に示す。

【表】

【表】応用例実施例１において得られた試料の粒状体30ml
をカラムに充填し、卵白のトリス―HCl緩衝希釈
液（50倍）を流した後トリス―HCl緩衝希釈液で
充分洗浄し、リゾチームのみを吸着させた。これ
に0.1M酢酸を流したところ、280nmに吸収をも
つた分画が得られた。これを高速液体クロマトグ
ラフイーで測定したところ、第１図に示した如
く、殆どがリゾチームであり、アフイニテイーク
ロマトグラフイー用担体として効果のあることが
判明した。尚、卵白のタンパクを同様に測定する
と第２図に示すように、卵白アルブミンとリゾチ
ームに起因する二つのピークが見られる。〓発明の効果〓本発明により多孔質粒状キトサンをジカルボン
酸誘導体で架橋させた後、アセチル化剤でアセチ
ル化して得られる多孔質キチンよりなるリゾチー
ム精製用アフイニテイークロマトグラフイー担体
は、通液性に優れ、長時間の使用が可能である。
本発明によりジカルボン酸誘導体で架橋処理を行
つたものは、リゾチームに対する親和性が増大
し、キチンに比較して約２倍以上もの吸着量を有
するものが得られる。エピクロルヒドリンや他の
架橋剤を用いてもキチンに比較して吸着量が減少
することはあるものの、増大させることはできな
かつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるアフイニテイークロマト
グラフイー担体を用いて精製を行つた場合のリゾ
チーム吸着量を示すグラフであり、第２図は卵白
の蛋白成分を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１多孔質粒状キトサンをジカルボン酸誘導体で
架橋後、アセチル化して得られるリゾチーム精製
用アフイニテイークロマトグラフイー担体。２ジカルボン酸誘導体が、ジカルボン酸のジ―
ｐ―ニトロフエニルエステル、ジ―Ｎ―ヒドロキ
シスクシイミドエステルよりなる活性エステル、
もしくは酸クロライド、酸ブロマイドのジカルボ
ン酸ハロゲン化物である特許請求の範囲第１項記
載のリゾチーム精製用アフイニテイークロマトグ
ラフイー担体。３ジカルボン酸が次の一般式で表わされ、ｎが
０〜８である特許請求の範囲第２項記載のリゾチ
ーム精製用アフイニテイークロマトグラフイー担
体。４アセチル化が、無水酢酸、アセチルクロライ
ド、アセチルブロマイドよりなるアセチル化剤を
用いてなされるものである特許請求の範囲第１項
記載のリゾチーム精製用アフイニテイークロマト
グラフイー担体。