JP3025947B2 - 乾燥固定化リパーゼ担体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、有機溶剤中で酵素
を用い、光学活性アルコールのラセミ化合物の一方に優
先的にエステル結合の転移反応を行い光学分割を行う際
に、優れた触媒作用を有する乾燥固定化リパーゼ担体の
製造方法に関し、有機溶剤中の水分濃度によらず優れた
触媒性能を示し、高い効率でエステル転移反応を行うこ
とが可能な乾燥固定化リパーゼ担体を提供する。

【０００２】

【従来の技術】水を微量にしか含まない有機溶剤中では
加水分解酵素によって各種合成反応が可能である。酵素
は常温，常圧で反応するため熱的に不安定な物質の合成
も可能な上に、反応が省エネルギーでクリーンである
事、反応の特異性に優れ位置選択的，基質選択的反応や
不斉合成が可能であるという、合成触媒にない優れた特
徴を有している。

【０００３】しかし有機溶剤中で酵素は反応速度が遅く
効率的な反応方法の開発が近年、活発に研究されてい
る。有機溶剤中での固定化酵素の使用は効率が高く、高
価な酵素を繰り返し使用できることから有用である。特
開昭６４−２５８８号公報には、界面活性剤およびポリ
オール化合物からなる群から選ばれた活性発現剤存在下
に、固定化担体にリパーゼを固定化し、水分３００ｐｐ
ｍ以下の系で、油脂の改質を行う、改質油の製造法およ
びこれに用いる固定化リパーゼについて開示されてい
る。

【０００４】該公報に開示された方法は、活性発現剤と
して界面活性剤もしくはポリオール化合物をリパーゼと
共に水に溶解し、この水溶液中に固定化用担体を入れリ
パーゼを担体に吸着し、固定化リパーゼを調製しようと
するものである。しかし該方法で得られる固定化リパー
ゼは、担体とリパーゼが共有結合で固定化されておら
ず、リパーゼと界面活性剤が吸着のみで担体についてい
るため不安定なものであり、化学合成に匹敵する安定な
触媒活性で数百時間といった長時間にわたって連続的に
有機合成を行うには不適であった。

【０００５】また、先に本出願人らが特開平７−８７９
７４号公報にて乾燥固定化リパーゼ担体について開示し
たが、この乾燥固定化リパーゼ担体は基質溶液中に微量
の水分を加えないと賦活化も、高いエステル転移活性も
得ることが出来ない欠点があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、有機溶剤中
で酵素を用い、光学活性アルコールのラセミ化合物の一
方に優先的にエステル結合の転移反応を行い光学分割を
行う際に、基質を含む有機溶剤中に極微量の水分しか含
まない場合でも、高い効率でエステルの転移反応を行う
ことのできる高いエステル転移活性と活性発現率の性能
を具備した乾燥固定化リパーゼ担体の製造方法を提供す
るものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意検討
し、再生粒状多孔質キトサン担体を脂肪族ポリアルコー
ルのグリシジルエーテルで処理し、次いで有機溶剤中で
高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物で処理し
架橋再生粒状多孔質キトサン担体とし、これにリパーゼ
を吸着させ、多官能性試薬で処理し湿潤固定化リパーゼ
担体を得、湿潤固定化リパーゼ担体１重量部に対し１〜
２０重量部の濃度０．１〜５重量％の常温で固体の界面
活性剤を含む有機溶剤中で振とう後、減圧乾燥する乾燥
固定化リパーゼ担体の製造方法を見出した。本発明方法
によれば、基質を含む有機溶剤中の水分濃度によらず、
優れた触媒性能を示し、高い効率でエステルの転移反応
が可能な乾燥固定化リパーゼ担体が得られる。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる再生粒状多孔
質キトサン担体は、本出願人が特公平１−１６４２０号
公報で開示した方法で得られる。即ち、平均分子量１
０，０００〜２３０，０００の範囲にある低分子量キト
サンを酸性水溶液に溶解し、該溶解液を塩基性溶液中に
落下せしめて多孔質キトサンを凝固再生させることによ
り得られる。

【０００９】再生粒状多孔質キトサン担体に対する脂肪
族ポリアルコールのグリシジルエーテルによる架橋反
応、及び、次いで行われる高級脂肪酸の酸ハロゲン化物
もしくは酸無水物との反応で架橋再生粒状多孔質キトサ
ン担体を得る方法は、本出願人が特開平６−２３７７６
９号公報で開示した方法による。

【００１０】架橋反応に用いられる脂肪族ポリアルコー
ルのグリシジルエーテルとしては、エチレングリコール
ジグリシジルエーテル，ジエチレングリコールジグリシ
ジルエーテル等のポリエチレングリコールジグリシジル
エーテル，プロピレングリコールジグリシジルエーテ
ル，ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル等の
ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル，グリ
セロールポリグリシジルエーテル等が用いられ、脂肪族
ポリアルコールのグリシジルエーテルを導入する反応
は、その濃度が０．０１〜０．５エポキシ当量／Ｌ、液
量は再生粒状多孔質キトサン担体容積の１〜５倍量、反
応温度は２０〜９０℃、反応時間は１〜２４時間緩やか
に攪拌しながら行う。次いで該担体に含まれる水分を有
機溶剤で充分に除去し、有機溶剤中で高級脂肪酸の導入
を行う。有機溶剤としては、ジオキサン，ヘキサン，エ
タノール，イソプロピルアルコール，ジメチルホルムア
ミド，ジメチルアセトアミド，ジメチルスルホキシド，
ピリジン等の中から導入する高級脂肪酸の酸ハロゲン化
物もしくは酸無水物に対し不活性の溶剤を選択し使用す
ればよい。高級脂肪酸の酸無水物としては、無水ラウリ
ン酸，無水ミリスチン酸，無水ステアリン酸、又、酸ハ
ロゲン化物としては、塩化ラウロイル，塩化ミリストイ
ル，塩化ステアロイル等が用いられ、その反応は、その
濃度が５０〜１，０００ｍｍｏｌ／Ｌ、液量は使用する
担体容積の１〜５倍量、反応温度は１０〜７０℃、反応
時間は１〜２４時間で緩やかに攪拌しながら行い、反応
残液を除去後有機溶剤で洗浄し、有機溶剤を純水で置換
除去する。この際に生成する脂肪酸もしくは無機酸を除
去する目的でトリエチルアミンやピリジン等の脱酸剤を
添加してもよい。このようにして架橋再生粒状多孔質キ
トサン担体を得る。

【００１１】引き続き、得られた架橋再生粒状多孔質キ
トサン担体にリパーゼの吸着を行う。リパーゼとして
は、例えばリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペル
ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕ
ｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）属、ク
ロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の微生物起源
のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物由来のリパーゼが
用いられる。

【００１２】架橋再生粒状多孔質キトサン担体を、上述
のリパーゼを含む水溶液に浸漬し攪拌させ、リパーゼを
該担体に吸着させる。この際、リパーゼ水溶液の温度
は、リパーゼの失活を生じない範囲、例えば０〜６０
℃、好ましくは５〜４０℃がよい。又、リパーゼ水溶液
のｐＨは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、ｐ
Ｈ３〜９が好ましい。

【００１３】次いでリパーゼの耐久性を向上させるため
に、多官能性試薬で酵素と該担体を共有結合させる処理
をする。多官能性試薬としては、グリオキザール，グル
タルアルデヒド，マロンアルデヒド，スクシニルアルデ
ヒド，ビススルフォスクシニミジルスベラート，ジメチ
ルスベリミテート，エチレングリコールビススルフォス
クシニミジルスクシネート，ジシクロヘキシルカルボジ
イミド，ヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げら
れ、例えば、リパーゼ分子１モル当り１．２〜２倍モル
用いればよい。かくして湿潤固定化リパーゼを得る。

【００１４】これらの多官能性試薬による処理は、リパ
ーゼの吸着に先立って架橋再生粒状キトサン担体にあら
かじめ反応させてもよい。得られた湿潤固定化リパーゼ
を有機溶剤中に浸漬し、含有している水分を有機溶剤で
充分に置換除去する。

【００１５】この際、用いられる有機溶剤としてはアセ
トン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、
ジオキサン等の極性溶媒が使用されるが、酵素の失活を
招かない点からアセトンが好適である。次いで湿潤固定
化リパーゼ担体を、常温で固体の界面活性剤を溶解した
上述の有機溶剤と同じ有機溶剤中に浸漬し振とうする。

【００１６】この際、用いられる界面活性剤としては、
酸性、中性、塩基性の界面活性剤が挙げられるが、リパ
ーゼの失活を招かない弱酸性、中性、弱塩基性の界面活
性剤が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、１−Ｓ−オクチル−β−Ｄ−チ
オグルコピラノサイド、オクチル−β−グルコシド等が
挙げられる。

【００１７】用いられる界面活性剤が液状の場合は、湿
潤固定化リパーゼ担体を減圧乾燥する際に、該担体の収
縮が著しく、その収縮を防ぐために、常温で固体の界面
活性剤を上述の有機溶剤に溶解させて用いることが好ま
しく、１−Ｓ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノサ
イド、オクチル−β−グルコシドが好適である。

【００１８】有機溶剤中の界面活性剤濃度は、０．１〜
５重量％、好ましくは０．２〜５重量％である。０．１
重量％未満では効果が低く、５重量％を越えると有機溶
剤中に界面活性剤を溶解させることが困難である。界面
活性剤を含む有機溶剤の量は、湿潤固定化リパーゼ担体
の１重量部に対し１〜２０重量部、好ましくは２〜１０
重量部が好適で、１重量部未満では液量が少ないため振
とうが難しく、２０重量部以上にしても目立った効果の
向上が認められない。

【００１９】湿潤固定化リパーゼ担体を界面活性剤を含
む有機溶剤に浸漬振とうする時間は１５分〜２時間、好
ましくは３０分〜２時間行われる。１０分未満では界面
活性剤が該担体内部まで充分拡散せず、２時間を越える
と、界面活性剤の該担体内部への拡散に効果がないばか
りかリパーゼの失活が著しくなり好ましくない。処理の
温度は５〜４０℃で、好ましくは５〜３０℃である。５
℃未満では界面活性剤の該担体内部への拡散が悪く、４
０℃を越えるとリパーゼの熱失活が顕著となる。

【００２０】次いで該担体に付着している余剰の界面活
性剤と余剰の有機溶剤を硝子濾過器等を用いて除去し、
減圧乾燥することにより乾燥固定化リパーゼ担体を得
る。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明
するが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。
尚、実施例で測定した、リパーゼの固定化率測定方法、
遊離リパーゼのエステル転移発現活性測定方法、乾燥固
定化リパーゼ担体のエステル転移発現活性測定方法およ
び活性発現率の測定方法は以下に示した方法で行った。

【００２２】１．リパーゼの固定化率測定方法 オリーブ油（関東化学（株）製）２０ｇをアデカトー
ルＳＯ−１２０（商品名，旭電化工業（株）製）２０
ｇ、純水６０mlと混ぜ、エマルジョン基質とする。 該基質２５mlに純水１０mlを加え３７℃で１０分間予
備加熱する。 固定化操作に使用する酵素水溶液０．１mlを基質に加
え３７℃で５分間反応させる。 アセトンを５０％含むエタノールを８０ml加え、攪拌
し酵素反応を停止する。 ５０ｍＭのＮａＯＨで酵素反応により遊離した脂肪酸
を滴定し、滴定量を求める。 ブランクとして上記と同様の操作において、の操作
で、酵素水溶液のかわりに純水を０．１ml加え、滴定量
を求める。 固定化操作前のリパーゼ水溶液のエマルジョン脂質分
解発現活性値Ａ（ｕ／ml水溶液）を次式より求める。

【数１】 固定化操作後の濾液のエマルジョン脂質分解発現活性
値Ｂ（ｕ／ml水溶液）を上記と同様に測定する。 固定化率Ｃはとで求めたＡとＢより次式で求め
る。

【数２】

【００２３】２．遊離リパーゼのエステル転移発現活性
測定方法 ２．５％のα−Ｄ、Ｌ−フェニルエチルアルコールと
２％の酢酸ビニルモノマーを含むヘキサン溶液を調製
し、純水を適宜加え、所定濃度の水分を含んだ基質溶液
とする。 加水分解発現活性で５ｕ相当量の重量の乾燥固定化リ
パーゼ担体を秤量し、該基質溶液２mlに加え２５℃で３
時間攪拌し、エステル転移反応を行う。 反応終了後、瀘過により固定化リパーゼ担体を素早く
除き反応液を−５０℃に冷却し、反応を停止する。 光学分割カラム，キラルセルＯＢ（商品名，ダイセル
化学工業（株）製）を用い高速液体クロマトグラフィー
にて反応液の組成を測定し、α−Ｌ−フェニルエチルア
ルコールの減少量（μｍｏｌ）を求める。 遊離リパーゼのエステル転移発現活性値は２５℃にて
１分間に１μｍｏｌのα−Ｌ−フェニルエチルアルコー
ルをアシル化するとき１ｕとし、次式より求める。

【数３】

【００２４】３．乾燥固定化リパーゼ担体のエステル転
移発現活性測定方法 脂質分解発現活性で１０ｕ相当量の重量の乾燥固定化
リパーゼ担体を秤量し、遊離リパーゼのエステル転移発
現活性測定方法で述べた基質溶液と同一の水分を含む基
質溶液２mlに加え、２５℃で３時間攪拌し、エステル転
移反応を行う。 反応終了後、瀘過により固定化リパーゼ担体を素早く
除き反応を停止する。 光学分割カラム，キラルセルＯＢ（商品名，ダイセル
化学工業（株）製）を用い高速液体クロマトグラフィー
にて反応液の組成を測定し、α−Ｌ−フェニルエチルア
ルコールの減少量（μｍｏｌ）を求める。 乾燥固定化リパーゼ担体のエステル転移発現活性値は
２５℃にて１分間に１μｍｏｌのα−Ｌ−フェニルエチ
ルアルコールをアシル化するとき１ｕとし、次式より求
める。

【数４】

【００２５】４．活性発現率の測定方法 前記測定方法２．および３．で示した方法により求めた
遊離リパーゼのエステル転移活性値Ｆ（ｕ／ｍｇ）と固
定化リパーゼ担体のエステル転移活性値Ｇ（ｕ／ｍｇ）
とから次式によってエステル転移発現活性の発現率
（％）を算出した。

【数５】

【００２６】《実施例１》脱アセチル化度８０％、平均
分子量６０，０００のキトサン１，２００ｇを３．５％
酢酸水溶液１８，８００ｇに溶解した。該水溶液を、７
％水酸化ナトリウム，２０％エタノール，７３％水より
なる凝固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質に凝固
再生し、中性になるまで充分水洗し、平均粒径０．１mm
の再生粒状多孔質キトサン担体１０，０００ml（湿潤）
を得た。

【００２７】この再生粒状多孔質キトサン担体それぞれ
５００mlに水５００mlと５．３６ｇのエチレングリコー
ルジグリシジルエーテル（エポキシ当量８７．１３）を
加えて６０℃で１時間反応させ、反応終了後、水洗し、
該再生粒状多孔質キトサン担体５００mlを得た。

【００２８】該再生粒状多孔質キトサン担体が含む水を
ジメチルアセトアミドで充分に除去した。該再生粒状多
孔質キトサン担体５００mlにジメチルアセトアミド５０
０ml、７．６２０ｇの塩化ステアロイルと２．５３０ｇ
のトリエチルアミンを加えた。

【００２９】これを２５℃で攪拌し１８時間反応させ
た。反応残液を除去したのち、ジメチルアセトアミドで
洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で除去し湿
潤状態の架橋再生粒状多孔質キトサン担体を得た。

【００３０】この湿潤状態の担体を湿重で１０ｇ採取
し、細菌由来のリパーゼＡＰ（旭化成工業（株）製）１
０mg／mlの水溶液１０ml，１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を５ml，純水を２３５ml混合して酵素液とし
て、架橋再生粒状多孔質キトサン担体を入れ、３７℃で
１時間攪拌しリパーゼを吸着させ、濾別してよく水洗し
た。

【００３１】１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を５m
l，純水を２４２．５ml，１％グルタルアルデヒド水溶
液を２．５ml混合した固定液を準備し、この液中にリパ
ーゼを吸着させた担体を入れ、３７℃で１時間攪拌し、
該担体を濾別し、充分に水洗し１０ｇの湿潤固定化リパ
ーゼ担体を得た。

【００３２】次いでアセトンで該担体に含まれる水を置
換除去した。界面活性剤としてオクチル−β−グルコシ
ドを使用し、その濃度（重量％）が０．０５％，０．１
％，０．５％，１％，５％，７％になるようにアセトン
に溶解した溶液を各々１０ｇ準備し、各々に上述の方法
で得られた１ｇの該担体を各々浸漬し２５℃で１時間振
とうした。余剰の界面活性剤を含む有機溶剤を硝子濾過
器で除去後、２５℃で１２時間減圧乾燥し乾燥固定化リ
パーゼ担体（試料Ｎｏ．ａ〜ｆ）を各々０．２９ｇ得
た。比較例として界面活性剤のアセトン溶液で処理せず
湿潤固定化リパーゼを単に減圧乾燥させた担体を試料Ｎ
ｏ．ｇとした。試料Ｎｏ．ａ〜ｇについて、エステル転
移発現活性である発現活性、活性発現率を測定し、その
結果を表１に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】表１の結果から明らかな如く、本発明の方
法で得た試料Ｎｏ．ａ〜ｆの乾燥固定化リパーゼ担体は
界面活性剤を含む有機溶剤で処理したもので、未処理の
試料Ｎｏ．ｇに比較して一段と優れたエステル転移発現
活性を示し、界面活性剤濃度が０．１〜５重量％が好適
で、その濃度を７重量％としても効果は５重量％が限界
で変っていない。

【００３５】《実施例２》実施例１と同様にして１０ｇ
の湿潤固定化リパーゼ担体を得た。次いでアセトンで該
担体に含まれている水を置換除去した。界面活性剤とし
て１−Ｓ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノサイド
を用い、１重量％の濃度になるようアセトンに溶解した
溶液、０．５ｇ，１ｇ，２ｇ，２０ｇ，５０ｇを用意
し、各々に得られた湿潤固定化リパーゼ担体１ｇを浸
漬、２５℃で１時間振とうし、余剰の界面活性剤を含む
有機溶剤を硝子濾過器で除去後、２５℃で１２時間減圧
乾燥し、乾燥重量０．２９ｇの乾燥固定化リパーゼ担
体、試料Ｎｏ．ｈ〜ｌを得た。これらのエステル転移発
現活性である発現活性と活性発現率を１５０ｐｐｍの水
分を含む基質溶液中で測定し、その結果を表２に示し
た。

【００３６】

【表２】

【００３７】表２より明らかな如く、界面活性剤を実施
例１で用いたオクチル−β−グルコシドに代えて１−Ｓ
−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノサイドに代えて
も乾燥固定化リパーゼ担体は優れた性能を発揮し、湿潤
固定化リパーゼ担体１重量部に対し、１〜５０重量部の
界面活性剤を含む有機溶液中で処理すると好ましい性能
を示し、２０重量部以上ではその結果が向上することが
ないので１〜２０重量部が好適であることが明らかであ
る。

【００３８】《実施例３》実施例１と同様にして１０ｇ
の湿潤固定化リパーゼ担体を得た。次いでアセトンで該
担体に含まれている水を置換除去した。界面活性剤とし
てオクチル−β−グルコシドを１重量％濃度になるよう
アセトンに溶解した溶液２０ｇを用意し、湿潤固定化リ
パーゼ担体１０ｇを該溶液に浸漬、２５℃で１時間振と
うし、余剰の界面活性剤を含む有機溶剤を硝子濾過器で
除去後、２５℃で１２時間減圧乾燥し、乾燥固定化リパ
ーゼ担体２．９ｇを得た。得られた乾燥固定化リパーゼ
担体１０mgずつを基質溶液の水分濃度が１５０ｐｐｍ，
２８０ｐｐｍ，６２０ｐｐｍ，１１８０ｐｐｍである基
質溶液中に加え、エステル転移発現活性である発現活性
と活性発現率を測定し、その結果を表３に示した。比較
として、界面活性剤を含む有機溶剤処理をしないで得た
乾燥固定化リパーゼ担体についても水分濃度が同値であ
る基質溶液中で同様に発現活性と活性発現率を測定し、
表３に示した。

【００３９】

【表３】

【００４０】表３の結果より明らかな如く、基質溶液中
の水分が極微量しか含まれていない場合も、界面活性剤
をアセトン溶液中に溶解した溶液中で処理した乾燥固定
化リパーゼ担体は、優れたエステル転移発現活性と活性
発現率を示している。

【００４１】

【発明の効果】再生粒状多孔質キトサン担体を脂肪族ポ
リアルコールのグリシジルエーテルで処理し、次いで高
級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水物で処理した
架橋再生粒状多孔質キトサン担体にリパーゼを吸着さ
せ、多官能試薬処理した湿潤固定化リパーゼ担体を得、
このものを界面活性剤を含む有機溶剤中で振とう、減圧
乾燥して得た乾燥固定化リパーゼ担体は、界面活性剤で
処理しているために基質を含む有機溶剤中の水分濃度に
よらず優れた触媒性能を有し、高い効率でエステル転移
反応に供することができるという効果を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−237769（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−134090（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−87974（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−16420（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 11/10 C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 再生粒状多孔質キトサン担体を脂肪族ポ
   リアルコールのグリシジルエーテルで処理し、次いで有
   機溶剤中で高級脂肪酸の酸ハロゲン化物もしくは酸無水
   物で処理し架橋再生粒状多孔質キトサン担体とし、これ
   にリパーゼを吸着させ、多官能性試薬で処理し湿潤固定
   化リパーゼ担体を得、湿潤固定化リパーゼ担体１重量部
   に対し１〜２０重量部の濃度０．１〜５重量％の常温で
   固体の界面活性剤を含む有機溶剤中で振とう後、減圧乾
   燥することを特徴とする乾燥固定化リパーゼ担体の製造
   方法。