CN104031903B - 改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：1)、制备柔性载体：包括将聚丙烯腈树脂微球利用四乙烯五胺进行改性，得改性后的聚丙烯腈柔性载体；2)、载体的活化：包括将改性后的聚丙烯腈柔性载体先用磷酸缓冲液浸泡，然后利用戊二醛进行交联反应；得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体；3)、制备固定化木瓜蛋白酶：包括将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体与木瓜蛋白酶进行固定化反应，最终得固定化木瓜蛋白酶。本发明的方法克服了现有技术所合成的载体在酶固定化过程中，由于刚性碰撞造成的酶活力损失，同时又可最大限度地保留游离酶的均相催化活性，从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。

Description

改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及一种固定化酶的制备方法，具体涉及一种利用改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，属于酶固定化技术领域。

背景技术

木瓜蛋白酶作为生物催化剂的重要成员之一，在食品、日化、医药等领域有广泛的应用。尽管木瓜蛋白酶具有优良的催化性能，但直接使用游离酶作为生物催化时，不仅回收率低，操作稳定性差，且无法实现重复利用，这就造成了酶的浪费，增加了成本，也使应用受到了一定的限制。酶的固定化技术则能够较好的解决上述问题。固定化木瓜蛋白酶的核心在于合理选择和设计性能优良的固定化载体和简单有效的固定化方法。然而在利用各类载体对木瓜蛋白酶进行固定化的过程中，人们逐渐发现传统的酶固定化方法虽然有很多的优点，但都有各自的不足。如包埋法中载体对大分子底物和产物扩散的限制；交联法中酶的不可再生；物理吸附法和离子结合法中酶易于从载体上脱落等。而由共价结合法制备的固定化酶与载体结合稳定，不易脱落，可以长期使用，因此克服了上述固定化方法中的一些不足，但该法的主要不足就在于固定化时常采用较激烈的条件，以牢固的共价键形式将酶固定在载体上，因而使酶活损失较大。为此人们期望通过对共价结合法进行改进。

现有的酶固定化方法主要有如下几种：

1.曲伟光等人利用聚合接枝法，合成了一种具有亲水性的环氧聚合物柔性载体：PS-acyl-P(AM-CO-GMA)，并成功用于柔性共价固定化脂肪酶。结果表明，所得固定化酶的热稳定性、操作稳定性和对有机溶剂的耐受性均有提高。但该载体不仅合成步骤繁琐且稳定性较差。

2.魏荣卿等人采用壳聚糖为载体，选用双醛淀粉作为改性功能基，柔性固定化木瓜蛋白酶，结果表明，所得固定化酶活回收率明显提高了。但由于双醛淀粉具有氧化度不均一、水溶性较差的缺点，不仅反应速度慢，而且严重影响酶的固定化的效果，进而影响酶的固定化性质。

3.选用聚苯乙烯系大孔树脂作为酶固定化载体，通过接枝改性的方法来改善载体的亲水性，用来固定化酶，但这类材料在合成过程中使用了氯甲醚，改性原理属于加成反应，在改性过程中有氯化氢生成，因此原子利用率不高，对环境也不友好。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种利用柔性载体制备固定化木瓜蛋白酶的方法，采用本发明的方法能解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)、制备柔性载体，依次进行以下步骤：

①、聚丙烯腈树脂改性：

将聚丙烯腈树脂微球加入至反应溶剂中浸泡20～28h，从而使聚丙烯腈树脂微球充分溶胀；然后加入作为亲水性柔性基团的四乙烯五胺(TEPA)，作为催化剂的NaOH，所述聚丙烯腈树脂微球：四乙烯五胺(TEPA)：NaOH的重量比为1：11～12：0.1～0.2；在氮气保护下于70℃～90℃、以150～200r/min的转速搅拌反应9～11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球；

②、改性后的聚丙烯腈树脂微球用反应溶剂浸泡洗涤至洗涤液为无色，再依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤(数次)，然后用去离子水洗涤，接着依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗，40～60℃下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)；

2)、载体的活化：

取1g改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)，用8～12ml(较佳为10mL)的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液浸泡20～28h，从而使改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)充分溶胀；然后过滤分离，得浸泡后PAN-TEPA；

在浸泡后PAN-TEPA中加入体积浓度为2％～6％的戊二醛8～12ml(较佳为10mL)，于20～30℃(较佳为25℃)交联反应7～9h时后，过滤，所得滤饼依次用去离子水、pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液洗涤后，于40～60℃下真空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体；

3)、制备固定化木瓜蛋白酶：

将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体浸泡在8～12ml(较佳为10mL)的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液的锥形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体的质量比为：0.06～0.10:1，于25～35℃(固定化温度)恒温振荡2～4h后，过滤分离；

所得滤饼用pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液进行反复冲洗(8～10次)后，于36～38℃(较佳为37℃)的真空干燥器中干燥4.5～5.5h(较佳为5h)后，得固定化木瓜蛋白酶。于冰箱中保存(4℃)即可。

作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的改进：

所述步骤1)中的反应溶剂为乙二醇(ED)。

作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的进一出改进：

所述步骤①：加入四乙烯五胺(TEPA)和NaOH后，接通氮气，在氮气保护下先以150～200rpm的搅拌速度在20～30℃的常温下搅拌1.5～2.5h；然后继续在氮气保护下于70℃～90℃、以150～200r/min的转速搅拌反应9～11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球。

作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的进一出改进：所述pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液具体为0.1mol/L的pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)。

作为本发明的改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的进一出改进：所述步骤①每1g聚丙烯腈树脂微球(PAN)配用250～350mL的反应溶剂。

本发明的制备柔性载体的过程中，载体以大孔交联聚丙烯腈微球(即，聚丙烯腈系共聚体、聚丙烯腈树脂微球)为母体，通过化学改性的方式将亲水性四乙烯五胺引入母体中，制得一种聚丙烯腈柔性载体。本发明所用的柔性链为四乙烯五胺属多胺类化合物。

在本发明中：

聚丙烯腈树脂微球选用D－160型大孔吸附树脂，交联度7％DVB，含氮量22.18％，功能基含量：15.83CN mmol/g；例如可购自中蓝晨光化工研究院。

步骤(1)的聚丙烯腈树脂改性中的“依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗”为常规操作方式，即为：将前一步骤的所得物先进行碱洗(放入浓度为1mol/L的NaOH溶液中浸泡1～3小时)；然后水洗至洗涤液为中性；再进行酸洗(将水洗后的所得物放入浓度为1mol/L的HCl溶液中浸泡1～3小时)；然后水洗至洗涤液为中性。

本发明所采用的测定方法具体如下：

样品中酶含量的测定：取适量样品待测液，在278nm处用紫外可见分光光度计测其吸光度，通过标准曲线，确定待测液中酶蛋白的浓度。根据下式计算酶的固载量Q_e：

式中，Q_e：酶固定量(mg/g)；C₀：固定前溶液中酶含量(mg/mL)；C_e：固定后溶液中酶含量(mg/mL)；C_r：PBS洗涤液中酶含量(mg/mL)；V₀：固定化所用酶溶液体积(mL)；V_r：所用PBS洗涤液体积(mL)；M_d：用于固定化酶树脂载体的质量(g，干重)。

酶活力测定方法：

游离酶和固定化酶的测定采用酪蛋白作为酶催化底物。

游离酶活力测定：将一定量的游离酶加入到含有4mL的2％的酪蛋白溶液和1mL0.1mol/L PBS缓冲液(pH＝7.0，5mmol/L的L-Cys和1mmol/L EDTA)试管中，在37℃水浴中反应30min，然后立即加入5mL10％的三氯乙酸(TCA)终止反应，然后将反应物混合均匀后于水浴中静置10min过滤，滤液在275nm处测定吸光值。空白对照组则在加入酶之前，先加5mL10％TCA，其余步骤相同。

固定化酶活力测定：将等当量的固定化酶加入到含有4mL的2％的酪蛋白溶液和1mL0.1mol/L PBS缓冲液(pH＝7.0，5mmol/L的L-Cys和1mmol/L EDTA)试管中，其余步骤同游离酶测定相同。

式中：A：样品液的吸光值；A₀：对照液的吸光值；V：反应液的总体积mL；

t：反应时间min；K：由标准曲线得到，数值上等于吸光值OD₂₇₅为1时所相当的酪氨酸的微克数。

酶活力单位定义为在测定条件下(温度37℃，pH7.2)，每分钟催化酪蛋白水解生成l ug酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。

固定化酶的活力回收率是指固定化酶总活力与固定化过程加入溶液酶总活力之比，以百分数表示。

固定化酶或游离酶的相对活力(％)：指在同组试验中以活力最高的为100，与其余的固定化酶或溶液酶的活力之比，通常以百分数表示。

固定化酶或游离酶的剩余酶活力(％)：指在同组实验中以未处理前的固定化酶或溶液酶的活力为100，与处理以后(包括热、酸、碱、试剂、固定化、冷藏等)所显示的活力之比，以百分数表示。

综上所述，本发明采用酶的柔性固定化模型，合成了一种新型柔性载体，用于固定化木瓜蛋白酶的制备，减少了酶在固定化过程中因刚性碰撞造成的酶活力损失，同时又可最大限度地保留游离酶的均相催化活性，从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。本发明选用具有比表面积大、机械强度高、稳定性好、价格低、易制备、易分离的大孔交联聚丙烯腈树脂微球作为固定化酶改性载体，相比其他载体更具有独特的优越性。而且聚丙烯腈分子表面含有大量活泼的氰基(C≡N)，容易进行化学改性，生成各种不同的功能基团，从而得到不同的功能性载体材料。在本发明中，我们选用具有足够长度的且是亲水的四乙烯五胺作为功能分子链(“柔性链”)，经过化学改性引入到大孔树脂聚丙烯腈母体上，从而制得了一种新型柔性载体(PAN-TEPA)，在载体表面构建柔性功能基修饰层，可为固定化酶提供有效的结合位点和一个简单、温和的固定化过程。

本发明的优点与效果是：

本发明选用具有比表面积大、稳定性高、机械强度高、表面含大量活泼氰基(C≡N)的大孔交联聚丙烯腈树脂微球(PAN)为研究对象，制备了一种改性聚丙烯腈作为木瓜蛋白酶的共价结合固定化载体。亲水柔性链的成功引入使其在酶的固定化过程中可以有效维持酶蛋白的正常构象，减少酶失活的可能，从而达到了酶的“柔性国定化”目的，该载体活化过程及酶固定化过程如图1所示。

本发明相对于现有技术，有以下优点：

1、本发明以聚丙烯腈树脂微球(PAN)为母体，通过加成反应制备新型聚丙烯腈柔性载体，较好地体现了绿色化学的特征：原料的原子利用率高(原料中的原子尽可能多地转化到产品中，转化率达到了61.2％)；不向或少向环境中排放有毒有害的副产物，具有明显的经济效益和环境效益。

2、本发明以亲水性四乙烯五胺为柔性链，利用化学接枝法将聚丙烯腈树脂微球进行改性，使其具有机械强度高、热稳定性好等特点，且通过亲水柔性链的成功引入使其在酶的固定化过程中可以有效维持酶蛋白的正常构象，减少酶的失活。所得的固定化酶活力回收率高达78.9％，活力为4.745U/mg，是采用未改性聚丙烯腈树脂微球的固定化水平的23.5倍。

3、本发明方法制得固定化木瓜蛋白酶性能优异：与游离酶性能相比，固定化酶的热稳定性、酸碱稳定性、贮藏稳定性和对有机溶剂的耐受性都明显高于游离酶。固定化酶还具有较好的重复使用稳定性，具有实际应用价值。

4、所得的改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)比表面27.80m²/g，孔径25.1nm。

与传统的固定化方法相比，本发明的方法制备工艺简单、操作简便、反应条件温和、原料易得、成本低，不需要特殊设备，常规工艺就可以进行。

综上所述，本发明的方法克服了现有技术所合成的载体在酶固定化过程中，由于刚性碰撞造成的酶活力损失，同时又可最大限度地保留游离酶的均相催化活性，从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为木瓜蛋白酶在PAN-TEPA载体上的固定化过程；

图2为温度对固定化酶和游离酶相对活力的影响对比图；

图3固定化木瓜蛋白酶的重复使用性能对比图；

图4固定化酶和游离酶的存储稳定性对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步来发明，但本发明的保护范围并不限于此。

备注：以下实施例中所用木瓜蛋白酶购于阿拉丁试剂(上海)有限公司：酶活力≥3units/mg，以下水洗均为用去离子水进行洗涤，磷酸缓冲液均为0.1mol/L的pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)。聚丙烯腈树脂微球(PAN)选用D－160型大孔吸附树脂。

实施例1、一种改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，依次进行以下步骤：

1)、制备柔性载体，依次进行以下步骤：

①、聚丙烯腈树脂改性：

准确称取1.00g聚丙烯腈树脂微球(PAN)于500mL三颈瓶中，再加入300mL的反应溶剂(乙二醇---ED)，常温(20～30℃)下浸泡溶胀24h后，加入11.89g的四乙烯五胺(TEPA)、及少许催化剂---NaOH(0.12g)，并接通氮气，以200rpm的搅拌速度在常温下搅拌2h后，迅速升至80℃，磁力搅拌(200rpm)反应10h，过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球。

②、将改性后的聚丙烯腈树脂微球用50ml的反应溶剂(乙二醇—ED)浸泡3小时后，再用反应溶剂(乙二醇---ED)洗涤3-4次，直至洗涤液为无色；然后用去离子水、乙醇、乙醚依次洗涤(先用去离子水洗，离子水的用量为50ml/次，洗3次；然后用无水乙醇，无水乙醇的用量为50ml/次、洗3次；接着用乙醚洗，乙醚的用量为50ml/次，洗3次)，然后用去离子水洗涤(50ml/次，洗3次)。再用50ml浓度为1mol/L的NaOH水溶液浸泡2小时，水洗至中性；再用50ml浓度为1mol/L的HCl溶液浸泡1小时，水洗至中性；最后在50℃下真空干燥至恒重；得改性后的聚丙烯腈柔性载体(即PAN-TEPA)约1.25g。

2)、载体的活化：

称取1g上述步骤①所得的聚丙烯腈柔性载体(即PAN-TEPA)于烧杯中，用10mL的0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)浸泡24h，从而使改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)充分溶胀；然后过滤分离，得浸泡后PAN-TEPA；

在浸泡后PAN-TEPA中加入浓度为4％(体积浓度)的戊二醛10mL，于25℃交联反应8h时后，过滤，所得滤饼用去离子水、0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)洗涤后，于40～60℃下真空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体(载体活化过程见图1所示)。

3)、称取上述步骤2)所得的戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体1g浸泡在10mL的0.1mol/LpH7的磷酸缓冲液(PBS)的锥形瓶中，然后加入0.08g的木瓜蛋白酶，在固定化温度为35℃，转速为100rpm下，恒温振荡固定3h后，过滤分离；

所得滤饼再用0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)进行反复冲洗8～10次后，37℃条件下放入真空干燥器干燥5h后，得固定化木瓜蛋白酶(酶固定化过程见图1所示)，于冰箱中保存(4℃)。测得酶活力回收率达到了78.9％。(测定参照本发明所述的酶活力测定方法)。

实验、固定化木瓜蛋白酶的酶学性能测试：

试验1：

对应取适量10mg的固定化酶和游离酶(即，本发明所得的固定化木瓜蛋白酶和常规的木瓜蛋白酶)，分别在不同的酶催化反应温度(30℃～80℃)范围内，按照酶活力测定方法测定相应的酶活。

由图2可以看出，游离酶的最适温度为50℃，且曲线走向趋势较为陡峭，说明游离酶的催化反应受温度影响较大，而经固定化后，最适温度提高了10℃，且在50℃～80℃范围内都保持了较高的酶活，最适温度范围变宽，可能因为木瓜蛋白酶经载体固定化后得到了一种更加稳定的结构，使得变性速度受环境温度的影响减小。酶固定化后最适反应温度的上升，是由于酶分子与载体之间存在的多点连接，稳定了酶的构象，防止了酶因受热发生肽链折叠伸展变形，导致酶活性的下降。酶最适温度的提高，不仅提高了酶催化效率，还使酶催化反应能够在较高温度的环境下进行，在加工和应用中具有重要意义。

试验2：

对应取适量10mg的固定化酶和游离酶，分别加入浓度为10％和90％(V/V)的乙腈、乙醇和DMF有机试剂混合液5ml中，常温下放置处理1h，然后按照酶活力测定方法，在37℃下测定相应的酶活。

备注说明：上述有机试剂混合液是用0.1mol/L pH7的磷酸缓冲液(PBS)缓冲液进行配制的。

表1有机试剂对固定化酶和游离酶的影响

从表1中的数据很明显可以看出，游离酶经不同浓度的3种有机溶剂处理后，酶活力均有较大的损失，表现出了较差的稳定性。而且浓度越高酶活力损失越严重。而木瓜蛋白酶经固定化后，无论是在高浓度和低浓度的有机溶剂下进行处理后，均表现了较高的剩余酶活，稳定性明显高于游离酶。有机试剂影响酶的活性和稳定性主要是因为：一方面，有机试剂可以直接和酶作用，破坏酶的空间构象，从而影响酶的活性中心和稳定性；另一方面，有机试剂可通过与产物或底物的直接作用而影响酶的活性。而酶经载体固定后，载体对酶具有一定的保护作用，使得有机溶剂与酶无法直接接触，而且酶与载体结合后，使得酶的空间结构更加稳定，不易被破坏，稳定性得到了提高。

试验3：

分别取适量10mg的固定化酶，加入2.00mL2％(质量％)酪蛋白溶液，37℃反应30min，过滤分离固定化酶，用PBS缓冲液洗涤。在相同条件下重复以上步骤并测定相应的酶活，得重复反应8次的固定化酶。

图3表示了固定化酶的循环使用次数和相对活力之间的关系。由图3可知固定化酶在经过5次的重复使用后，活性可保留80％以上，使用8次以后，活性保留仍然在60％以上。可能是因为一些酶分子靠吸附作用与载体结合得不够紧密，加之部分酶在使用时脱落，并且在回收过程中，酶也有不同程度的损失，所以导致了酶的部分失活。相对于游离酶不能重复使用而言，固定化酶能够进行多次重复使用，明显提高了酶的使用效率，降低成本。良好的重复使用性能，不仅可以有效地降低成本，也使连续催化反应工艺设计成为可能，具有实际应用价值。

试验4：

分别将固定化酶和游离酶在4℃、pH7.0的PBS缓冲液中保存若干天，然后按照酶活力测定方法，于不同的时间间隔内测定相应的酶活。

从图4可以看出，固定于载体上的木瓜蛋白酶与游离酶相比表现出了较高的存储稳定性，在相同保存条件下(4℃)放置7d，游离酶随着保存时间的延长，酶活力下降很快，保存效果不好，其剩余活力仅剩下17％，而两种固定化酶在在缓冲液中保存7d后，其剩余活力均在80％以上，表现出了较好的贮藏稳定性。

对比例1、将实施例1步骤①中的催化剂由NaOH分别改为金属钠、氢化钠，其余同实施例1中的步骤①。

所得的改性聚丙烯腈树脂称为树脂A、树脂B，本发明的PAN-TEPA称为树脂C，并测定其聚丙烯腈树脂转化率分别为13.1％、34.8％和61.2％，可见催化剂种类对树脂转化率具有重要的影响，加之金属钠作为催化剂必须在严格无水条件下进行，反应条件难以控制，本实验经过大量探索，最后选定催化剂种类为NaOH。

对比例2、将实施例1步骤①中作为柔性链的四乙烯五胺改为乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺，其余同实施例1的步骤①。

所得的改性聚丙烯腈树脂称为PAN-ETDA、PAN-DETA、PAN-TETA。按照上述实施例1所述制备固定化木瓜蛋白酶，其与本发明的聚丙烯腈树脂柔性载体PAN-TEPA(实施例1)制备所得的固定化木瓜蛋白酶的对比数据如下表2：

表2、不同柔性链合成的聚丙烯腈柔性载体对固定化酶效果的影响

由此可知，在相同条件下，不同柔性链合成的聚丙烯腈柔性载体对木瓜蛋白酶的固定化效果不一样，其中本发明合成的聚丙烯腈柔性载体PAN-TEPA对木瓜蛋白酶具有较好的固定化效果，具有载酶量高、固定化酶活力高和酶活回收率高等特点。

对比例3、

将实施例1步骤2)中中戊二醛的浓度4％(V/V)改为2％、6％、8％其余同实施例1。从而探讨戊二醛浓度对木瓜蛋白酶固定化的影响。

表3、戊二醛浓度对固定化酶效果的影响

戊二醛浓度

载酶量

固定化酶活力

酶活回收率

2％	40.1mg/g	3.156(U/mg)	48.9％
				4％	56.7mg/g	4.745(U/mg)	78.9％
6％	35.4mg/g	2.961(U/mg)	39.5％
				8％	26.7mg/g	2.119(U/mg)	33.6％

由表3可知不同的戊二醛浓度对固定化酶效果的影响具有显著差异。由于戊二醛除了能与载体反应外，它还是一种交联剂，能与酶分子发生交联反应，同时也是蛋白质的变性剂，所以一定浓度的戊二醛可以提高酶的固定化效率，但当戊二醛浓度与树脂交联接近饱和时，过高的戊二醛浓度反而会对固定化木瓜蛋白酶的活力具有抑制作用。因此本发明选用的最佳戊二醛活化浓度为4％。

对比例4、

将实施例1步骤③中蛋白酶加入量0.08g改为0.02g、0.04g、0.10g、0.12g，余同实施例1。从而探讨不同的给酶量对木瓜蛋白酶固定化的影响。

表4、不同给酶量对固定化酶效果的影响

每克载体给酶量	载酶量	固定化酶活力	酶活回收率
				0.02g	22.7mg/g	1.973(U/mg)	29.9％
0.04g	31.1mg/g	2.775(U/mg)	55.8％
				0.08g(本发明)	56.7mg/g	4.745(U/mg)	78.9％
0.10g	62.7mg/g	5.125(U/mg)	65.4％
				0.12g	66.7mg/g	5.378(U/mg)	59.9％

从表4可以看出给酶量对酶固定化过程的影响。实验结果可知给酶量在0.08～0.10g/1.0g范围内，固定化酶均具有较高的酶活力。主要是因为载体表面活性基团数量是有限的，当在反应体系中的给酶量达到一定值时，载体蛋白结合位点已达饱和，即使再增加酶量，酶蛋白也不能过多的结合，反而由于集聚过多的酶分子，而产生空间重叠，从而使底物与产物因无法扩散而降低其结合能力。因此每g载体最佳给酶量为0.08g。

对比例5、

将实施例1步骤3)中固定化温度35℃改为15℃、25℃、45℃、55℃，余同实施例1。从而探讨不同固定化温度对木瓜蛋白酶固定化的影响。

表5、不同固定化温度对固定化酶效果的影响

温度	载酶量	固定化酶活力	酶活回收率
				15℃	29.1mg/g	3.156(U/mg)	42.3％

25℃	48.8mg/g	3.678(U/mg)	55.8％
				35℃(本发明)	56.7mg/g	4.745(U/mg)	78.9％
45℃	61.2mg/g	4.812(U/mg)	49.1％
				55℃	67.7mg/g	4.945(U/mg)	48.2％

温度对载体固定化木瓜蛋白酶效果的影响如表5所示。由于温度的升高，加快了反应速度，酶蛋白固载量增加，表现为固定化酶总酶活力的升高，但由于固定化时间较长，过高的固定化温度则会导致酶失活。根据实验结果，本发明选择35℃条件下来制备固定化酶，既能使固定化反应可以进行，又能保证游离酶不会快速失活，从而获得具有高活性的固定化酶。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、制备柔性载体，依次进行以下步骤：

①、聚丙烯腈树脂改性：

按照每1g聚丙烯腈树脂微球配用250～350mL的反应溶剂的比例，将聚丙烯腈树脂微球加入至反应溶剂中浸泡20～28h，从而使聚丙烯腈树脂微球充分溶胀；然后加入作为亲水性柔性基团的四乙烯五胺，NaOH作为催化剂，接通氮气，在氮气保护下先以150～200rpm的搅拌速度在20～30℃的常温下搅拌1.5～2.5h；然后继续在氮气保护下于70℃～90℃、以150～200r/min的转速搅拌反应9～11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球；所述聚丙烯腈树脂微球：四乙烯五胺：NaOH的重量比为1：11.89：0.12，

②、改性后的聚丙烯腈树脂微球用反应溶剂浸泡洗涤至洗涤液为无色，再依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤，然后用去离子水洗涤，接着依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗，40～60℃下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性载体；

所述反应溶剂为乙二醇；

改性后的聚丙烯腈柔性载体为

2)、载体的活化：

取1g改性后的聚丙烯腈柔性载体，用8～12ml的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液浸泡20～28h，从而使改性后的聚丙烯腈柔性载体充分溶胀；然后过滤分离，得浸泡后PAN-TEPA；

在浸泡后PAN-TEPA中加入体积浓度为4％的戊二醛8～12ml，于25℃交联反应7～9h时后，过滤，所得滤饼依次用去离子水、pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液洗涤后，于40～60℃下真空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体；

3)、制备固定化木瓜蛋白酶：

将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体浸泡在8～12ml的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液的锥形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体的质量比为：0.08～0.10:1，于25～35℃恒温振荡2～4h后，过滤分离；

所得滤饼用pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液进行反复冲洗后，于36～38℃的真空干燥器中干燥4.5～5.5h后，得固定化木瓜蛋白酶；

所述pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液为0.1mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲液。