CN107418950A - 多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用 - Google Patents

多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用，属于无机材料和分析技术领域；本发明首先通过Fe3O4@PAA微球和6‑arm‑PEG‑NH2制备了含有六臂聚乙二醇氨基（6‑arm‑PEG‑NH2）的磁性聚合物微球，并固定化辣根过氧化物酶，并将该固定化酶用于降解污染物苯酚；该微球合成过程设计合理，饱和磁化强度为33.38 emu g‑1，具有超顺磁性能；其表面具有丰富的氨基官能团能很好的用于酶的固定化；并且，本发明制备的固定化酶对对苯酚的降解速率明显高于游离酶和载体材料。

Description

多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于无机材料和分析技术领域，涉及一种多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用。
背景技术
酚类化合物被广泛应用于塑料、染料、药品、农药和纸张的生产过程中，是一类主要的环境污染物，也是人类致癌物。因此，建立有效的方法用于除去废水中酚类化合物十分重要。目前，从废水中除去酚类污染物的方法主要包括活性炭吸附，微生物降解，化学氧化，电晕放电以及酶解法。使用过氧化物酶酶解法由Klibanov和他的同事们于1993年首次提出，并不断的改进优化。在过氧化物酶的存在下，酚类物质通过加入过氧化氢氧化形成相应的自由基；自由基迅速自发反应形成不溶性聚合物，然后可以很容易地从废水中沉淀出来。相对于其他方法，酶解法在降解废水中酚类物质具有较大优势：能处理难以降解的有机化合物；对废水浓度范围的要求较为宽泛；pH、温度和盐度对反应时的影响不大；不会因生物物质的聚集而减慢处理速度；过程容易控制等。
应用于含酚废水处理的生物酶有过氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶等。辣根过氧化物酶（HRP）性质稳定、价格低廉，能在较宽的温度、pH值、污染物浓度和盐度范围内保持其催化活性，且对有机底物的专一性要求不高，是迄今为止研究最多的过氧化物酶。
用不溶性载体固定化酶能提高酶的热稳定性或重复使用效果，促进酶的回收和再利用。因此，固定化酶被广泛应用于生物催化和生物传感器领域。常用的固定酶的方法分为物理吸附法和化学结合法。物理吸附法吸附不牢固从而会导致酶泄露或丢失，引起产物的二次污染或者导致催化活性降低。化学结合法相对结合更牢固，在酶分子和载体之间形成共价键，从而把酶固定在固体材料上，具有很强的操作性和稳定性。
氨基六臂聚乙二醇（6-arm-PEG-NH2）是一种用来修饰蛋白质多肽的聚乙二醇衍生物。它含有丰富的氨基，能通过戊二醛交联剂与蛋白质结合实现酶的固定化，增加固定化酶稳定性和固载量；同时也能与带有羧基的材料（如聚丙烯酸）和小分子发生反应，形成稳定的酰胺键，增加材料的溶解性和稳定性，是一种应用前景非常可观的酶的固定化材料。目前利用含有六臂聚乙二醇氨基（6-arm-PEG-NH2）的磁性聚合物微球固定化辣根过氧化物酶还尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服目前游离的辣根过氧化物酶固定化量较低，合成的固定化酶活性较差等一些不足之处，从而合成一种多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供一种新型的多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2，所述微球粒径约为220 nm，呈现完美的核-壳-壳结构。
本发明还提供一种新型的多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶，所述的酶固定化辣根过氧化物酶由所述的多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2固定化制备而成，所述固定化辣根过氧化物酶的最适温度为55℃，最适pH为7.0。
本发明还提供一种新型多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法，具体步骤如下：
S1. 首先制备多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2
（1）Fe3O4微球的合成:
采用改进的水热法合成Fe3O4微球。将一定量六水合氯化铁溶于乙二醇，加入乙酸（NH4AC），柠檬酸三钠，一定温度下搅拌1小时至溶液成均匀体系，转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中于一定温度下反应16小时。取出后冷却至室温，磁分离产物，用乙醇洗涤至上清没有颜色，置于50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
其中，所述六水合氯化铁加入量为0.9-1.8 g；
所述 NH4AC加入量为2.890-4.818 g；加入的柠檬酸三钠为0.3-0.5 g；加入的乙二醇为 60-80 mL;
所述油浴中搅拌反应的温度为80-120 ℃；
所述在不锈钢高压反应釜中反应的温度为180-220 ℃。
（2）聚丙烯酸修饰的Fe3O4（Fe3O4@PAA）微球的合成:
首先，在Fe3O4微球表面利用硅烷偶联剂MPS修饰双键：将0.3 g Fe3O4微球分散于40 mL乙醇和10 mL水中，再加入一定量的氨水溶液，机械搅拌并在体系内加入一定量的MPS，70℃反应24小时，磁分离产物，用乙醇洗涤几遍去除未反应的MPS。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重，得到表面接枝双键的Fe3O4微球。
其次，通过蒸馏沉淀聚合法合成表面含有羧基的Fe3O4@PAA微球：取50 mg于单口烧瓶，加入40 mL乙腈超声分散3分钟，加入单体AA，交联剂MBA以及引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶30分钟内从室温加热到沸腾，约一个小时蒸馏得到20 mL乙腈。停止反应后，得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤，而后放在真空干燥箱内干燥至恒重。
其中，所述氨水为0.5-3 mL，MPS加入量为0.3-0.7 mL；
所述单体AA含量为0.1-0.2 mL，交联剂MBA为 100-200 mg；引发剂AIBN 5-20 mg。
（3）Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2多臂磁性复合微球的合成:
Fe3O4@PAA微球分散于一定量的水中混匀，加入一定量的6-arm-PEG-NH2的水溶液超声溶解，先加入一定量EDC室温下搅拌混匀，再加入EDC搅拌混匀，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性，放入烘箱干燥至恒重。
其中，所述Fe3O4@PAA微球和6-arm-PEG-NH2 水溶液的用量比例为：200 mg ：10-30mL；6-arm-PEG-NH2的水溶液浓度为5 mg mL-1。
所述超声时间为 0.5-3 小时；
所述第一次加入的EDC量为 30-50 mg，搅拌时间为2小时；第二次加入EDC的量为12小时，搅拌时间为12小时。
S2. 固定化辣根过氧化物酶的制备：
（1）溶液配制：
磷酸缓冲溶液的配制：用0.2 M Na2HPO4溶液调节0.2 M 100 mL NaH2PO4 至pH为7.0。
4-AAP溶液：取810 mg苯酚溶于40 mL水中，加入25 mg 4-氨基安替吡啉（4-AAP），用二次蒸馏水定容于50 mL容量瓶。
过氧化氢溶液：取1 mL过氧化氢加入100 mL容量瓶，用去离子水定容。取1 mL上述溶液于50 mL容量瓶，用缓冲溶液定容。
（2）辣根过氧化物酶固定化过程：
取载体材料Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2，加入戊二醛溶液中进行活化；磁铁回收载体材料，配置成浓度为4-10mg/L的悬浮液；将辣根过氧化物酶溶液与活化过的载体材料悬浮液混合，在20-45℃下孵育30-240min，用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的辣根过氧化物酶。采用考马斯亮蓝法利用紫外/可见分光光度计检测吸附液中剩余辣根过氧化物酶浓度，计算固载量。
所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.05-0.3mol/L，优选0.1 mol/L；所述活化的条件为50℃下活化6小时。
其中所述的载体材料悬浮液的浓度为7mg/L；所述孵育为在35℃下孵育180min。
辣根过氧化物酶的固载量（Q）可用以下公式进行计算：
（3.1）
式中，M 1 表示加入酶液中蛋白含量（mg），M 2 表示剩余上清中蛋白含量（mg），m 表示载体材料的质量（g）。
本发明另一目的是将上述合成的新型多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶用于对污染物苯酚的降解。
与现有技术相比较，本发明具有如下优点:
(1) 本发明首次合成了多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2，对其进行形貌和性质的表征；该微球合成过程设计合理，饱和磁化强度为33.38 emu g-1，具有超顺磁性能。其表面具有丰富的氨基官能团可用于酶的固定化。
(2) 将Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2微球作为载体材料应用于辣根过氧化物酶固定化，优化固定化过程的条件，当戊二醛浓度0.1 mol L-1、载体材料用量为7 mg L-1、固定化时间180分钟、固定化温度35℃时，固定化辣根过氧化物酶的固载量平均值为139.82 mg g-1，远远高于现有技术的记载。
(3) 本发明探讨了固定化辣根过氧化物酶的酶学性能，如最适催化温度，最适pH值，温度稳定性，贮存稳定性，及操作稳定性，与同等条件下的游离酶做了相应的对比，得出结论：通过固定化，辣根过氧化物酶在温度稳定性，贮藏能力以及对较差pH和温度的适应能力都有了一定程度的提升。其中，在贮存60天后，固定化辣根过氧化物酶的相对酶活高达71.05%，体现其较好的贮藏能力；催化反应8次后，相对酶活为61.06%，显示其较好的重复利用能力。
(4) 将固定化辣根过氧化物酶应用到苯酚废水降解试验中，优化降解过程的条件。当苯酚浓度100 mg L-1、过氧化氢与苯酚摩尔比值为1、固定化酶用量0.25 mg L-1、温度30℃时，固定化酶对苯酚降解率最高，为94.4%，远高于一般文献报道的50%—70%。在此基础上，对含有苯酚的废水溶液进行降解，对比载体材料和游离辣根过氧化物酶，固定化酶的降解速率明显高于游离酶和载体材料。
附图说明
图1为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的红外光谱图；
图2为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的XRD图；
图3为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的透射电子显微镜图；
图4为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的磁滞回线图；
图5为戊二醛浓度对辣根过氧化物酶固载量的影响结果图；
图6为载体材料用量对辣根过氧化物酶固载量的影响结果图；
图7为温度对辣根过氧化物酶固载量的影响结果图；
图8为时间对辣根过氧化物酶固载量的影响结果图；
图9为催化过程pH值对游离酶和固定化酶活性的影响结果图；
图10为催化过程温度对游离酶和固定化酶活性的影响结果图；
图11为游离辣根过氧化物酶和固定化辣根过氧化物酶的温度稳定性考察结果图；
图12为游离辣根过氧化物酶和固定化辣根过氧化物酶的贮藏稳定性考察结果图；
图13为固定化辣根过氧化物酶的操作稳定性考察结果图；
图14为各种反应参数对苯酚降解过程的影响，图中（a）苯酚浓度，（b）H2O2/苯酚摩尔比，（c）固定化辣根过氧化物酶浓度和（d）温度。
图15为固定化酶对于苯酚降解率的影响结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：磁性复合微球的制备
（1）Fe3O4微球的合成
采用改进的水热法合成Fe3O4微球。将0.9 g六水合氯化铁溶于60 mL乙二醇，加入2.890 g乙酸铵，0.300 g柠檬酸三钠，80℃下搅拌1小时至溶液成均匀体系，转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中于180℃反应16小时。取出后冷却至室温，磁分离产物，用乙醇洗涤至上清没有颜色，置于50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4@PAA微球的合成
首先，在Fe3O4微球表面利用硅烷偶联剂MPS修饰双键。将0.3 g Fe3O4微球分散于40 mL乙醇和10 mL水中，再加入0.5 mL氨水溶液，机械搅拌并在体系内加入0.3 mL MPS，70℃反应24小时，磁分离产物，用乙醇洗涤几遍去除未反应的MPS。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重，得到表面接枝双键的Fe3O4微球。其次，通过蒸馏沉淀聚合法合成表面含有羧基的Fe3O4@PAA微球。取50 mg于单口烧瓶，加入40 mL乙腈超声分散3分钟，加入0.1 mL单体AA，200 mg交联剂MBA，5 mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶30分钟内从室温加热到沸腾，约一个小时蒸馏得到20 mL乙腈。停止反应后，得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤，而后放在真空干燥箱内干燥至恒重。
（3）Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2多臂磁性复合微球的合成
200 mg Fe3O4@PAA微球分散于200 mL水中，加入10 mL浓度为5 mg mL-1的6-arm-PEG-NH2超声0.5小时，加入30 mg EDC室温下搅拌2小时，再加入52 mg EDC搅拌12小时，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性，放入烘箱干燥至恒重。
实施例2：磁性复合微球的制备
（1）Fe3O4微球的合成
采用改进的水热法合成Fe3O4微球。将1.800 g六水合氯化铁溶于80 mL乙二醇，加入4.818 g乙酸铵，0.500 g柠檬酸三钠，120℃下搅拌1小时至溶液成均匀体系，转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中于220℃反应16小时。取出后冷却至室温，磁分离产物，用乙醇洗涤至上清没有颜色，置于50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4@PAA微球的合成
首先，在Fe3O4微球表面利用硅烷偶联剂MPS修饰双键。将0.3 g Fe3O4微球分散于40 mL乙醇和10 mL水中，再加入3 mL氨水溶液，机械搅拌并在体系内加入0.7 mL MPS，70℃反应24小时，磁分离产物，用乙醇洗涤几遍去除未反应的MPS。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重，得到表面接枝双键的Fe3O4微球。其次，通过蒸馏沉淀聚合法合成表面含有羧基的Fe3O4@PAA微球。取50 mg于单口烧瓶，加入40 mL乙腈超声分散3分钟，加入0.2 mL单体AA，100 mg交联剂MBA，20 mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶30分钟内从室温加热到沸腾，约一个小时蒸馏得到20 mL乙腈。停止反应后，得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤，而后放在真空干燥箱内干燥至恒重。
（3）Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2多臂磁性复合微球的合成
200 mg Fe3O4@PAA微球分散于200 mL水中，加入30 mL浓度为5 mg mL-1的6-arm-PEG-NH2超声3小时，加入50 mg EDC室温下搅拌2小时，再加入52 mg EDC搅拌12小时，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性，放入烘箱干燥至恒重。
实施例3：磁性复合微球的制备
（1）Fe3O4微球的合成
采用改进的水热法合成Fe3O4微球。将1.350 g六水合氯化铁溶于70 mL乙二醇，加入3.854 g乙酸铵，0.400 g柠檬酸三钠，100℃下搅拌1小时至溶液成均匀体系，转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中于200℃反应16小时。取出后冷却至室温，磁分离产物，用乙醇洗涤至上清没有颜色，置于50℃真空干燥箱内干燥至恒重。
（2）Fe3O4@PAA微球的合成
首先，在Fe3O4微球表面利用硅烷偶联剂MPS修饰双键。将0.3 g Fe3O4微球分散于40 mL乙醇和10 mL水中，再加入1.5 mL氨水溶液，机械搅拌并在体系内加入0.5 mL MPS，70℃反应24小时，磁分离产物，用乙醇洗涤几遍去除未反应的MPS。在50℃真空干燥箱内干燥至恒重，得到表面接枝双键的Fe3O4微球。其次，通过蒸馏沉淀聚合法合成表面含有羧基的Fe3O4@PAA微球。取50 mg于单口烧瓶，加入40 mL乙腈超声分散3分钟，加入150 mL单体AA，150 mg交联剂MBA，6 mg引发剂AIBN，油浴加热烧瓶，安装分馏柱，冷凝管，接收器。将反应烧瓶30分钟内从室温加热到沸腾，约一个小时蒸馏得到20 mL乙腈。停止反应后，得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤，而后放在真空干燥箱内干燥至恒重。
（3）Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2多臂磁性复合微球的合成
200 mg Fe3O4@PAA微球分散于200 mL水中，加入20 mL浓度为5 mg mL-1的6-arm-PEG-NH2超声1小时，加入40 mg EDC室温下搅拌2小时，再加入52 mg EDC搅拌12小时，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性，放入烘箱干燥至恒重。
图1为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的红外光谱图；由图1中可以看出，596 cm-1和3432 cm-1分别是Fe-O 峰和Fe3O4微球表面的-OH峰。1631 cm-1是Fe3O4微球表面羧基峰。1720 cm-1处宽峰为羧基中的羰基振动吸收峰，来自于单体AA。1658cm-1和1394 cm-1处的吸收峰分别是酰胺基的羰基振动吸收峰和C-N振动吸收峰，来自交联剂MBA。1531 cm-1、3300 cm-1处的宽峰可能是由N-H振动引起的。由此可以证明AA和MBA通过蒸馏沉淀聚合法成功包覆在Fe3O4微球表面。1114 cm-1处的吸收峰则可能来自6-arm-PEG -NH2中的C-O-C键振动峰，对比图（b）和（c）可以看出，6-arm-PEG-NH2成功接枝在Fe3O4@PAA微球表面。
图2为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的XRD图；XRD谱图（图2）中的六个显著峰值30.1, 35.5, 43.1, 53.4, 57.0, 62.6分别对应着JCSD数据卡（74-748）上四氧化三铁的晶型值（220）（311）（400）（422）（511）（440）。可以看出Fe3O4@PAA微球和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2多臂复合微球中的四氧化三铁晶型没有明显变化，保持了较大的完整性。
图3为Fe3O4（a）、Fe3O4@PAA（b）、Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的透射电子显微镜图；从图3可以看出，Fe3O4微球的直径大小约为150 nm，且表面相对粗糙，粒径比较均匀，分散性也很好。Fe3O4@PAA 微球和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2微球粒径逐渐变大分别约为180nm和220 nm。包裹后的磁性复合微球粒径在逐渐增大，最后呈现完美的核-壳-壳结构。
图4为Fe3O4（a），Fe3O4@PAA（b）和Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2（c）的磁滞回线图；从图4可以发现，Fe3O4 微球的饱和磁化强度（Ms）为56.77 emu g-1，表面形成聚丙烯酸壳层后，饱和磁化强度变为45.04 emu g-1，多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2的最终饱和磁化强度为33.38 emu g-1。从图中可以看出，三种微球在常温下没有明显的剩磁和矫顽力，具有超顺磁性能，且它们的饱和磁化强度值足以使他们从溶液中快速有效地分离。
实施例4：固定化辣根过氧化物酶的制备
（1）溶液配制
磷酸缓冲溶液的配制：用0.2 M Na2HPO4溶液调节0.2 M 100 mL NaH2PO4 至pH为7.0。
4-AAP溶液：取810 mg苯酚溶于40 mL水中，加入25 mg 4-氨基安替吡啉（4-AAP），用二次蒸馏水定容于50 mL容量瓶。
过氧化氢溶液：取1 mL过氧化氢加入100 mL容量瓶，用去离子水定容。取1 mL上述溶液于50 mL容量瓶，用缓冲溶液定容。
（2）辣根过氧化物酶固定化过程
取载体材料Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2，加入戊二醛溶液中进行活化；磁铁回收载体材料，配置成浓度为4-10mg/L的悬浮液；将辣根过氧化物酶溶液与活化过的载体材料悬浮液混合，在20-45℃下孵育30-240min，用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的辣根过氧化物酶。采用考马斯亮蓝法利用紫外/可见分光光度计检测吸附液中剩余辣根过氧化物酶浓度，计算固载量。
所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.05-0.3mol/L，优选0.1 mol/L；所述活化的条件为50℃下活化6小时。
其中所述的载体材料悬浮液的浓度为7mg/L；所述孵育为在35℃下孵育180min。
辣根过氧化物酶的固载量（Q）可用以下公式进行计算：
式中，M 1 表示加入酶液中蛋白含量（mg），M 2 表示剩余上清中蛋白含量（mg），m 表示载体材料的质量（g）。
实施例5：辣根过氧化物酶固定化过程条件优化
（1）戊二醛浓度对固定化的影响
分别用0~0.30 mol L-1戊二醛溶液活化载体材料多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2，再取一定量辣根过氧化物酶与该载体材料溶液混合，加入一定量缓冲溶液，控制混合后溶液总体积为1 mL。在30℃恒温振荡箱内孵育4个小时，用磁铁分离载体材料，测量上清溶液中蛋白含量的变化，计算辣根过氧化物酶的固载量。得到戊二醛浓度对固定化过程的影响如图5。
由图5可知，不添加戊二醛时，多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG- NH2作为载体材料，对辣根过氧化物酶的固载量为4.96 mg g-1，载体材料和酶之间具有很微弱的吸附作用，必须通过添加交联剂来增强二者之间的结合力。当添加戊二醛浓度从0.05 mol L-1升高至0.10 mol L-1时，辣根过氧化物酶的固载量从41.05 mg g-1增长到94.08 mg g-1，之后随着戊二醛浓度的升高，固载量略有下降。可能是由于随着戊二醛浓度的升高，加剧了载体材料之间自交联的现象，使酶分子没有更多的结合在载体材料上，造成固载量的略微下降。其次，戊二醛浓度过高会导致酶变性失活，所以优选使用0.10 mol L-1的戊二醛溶液活化载体材料。
（2）载体材料用量对固定化的影响
用0.10mol L-1戊二醛活化载体材料Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2，将活化过的载体材料配置成溶液（4~10 mg L-1）分别与一定量的辣根过氧化物酶混合，加入适量缓冲溶液，控制溶液总体积为1 mL。在30℃温度下孵育4小时，然后用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测，得到载体材料用量对辣根过氧化物酶的固载量的影响。
图6所示是载体材料用量不同对固定化辣根过氧化物酶固载量的影响。随着载体材料量相对增加，固定化辣根过氧化物酶固载量逐渐升高，当载体材料量为7 mg L-1时，固定化辣根过氧化物酶固载量达到最大值121.93 mg g-1，进一步增加载体材料量，固定化辣根过氧化物酶的固载量降低。这可能是因为当载体材料量为7 mg L-1时，辣根过氧化物酶几乎最大化的参与了固定，即便再增加载体材料，可供固定的游离辣根过氧化物酶也所剩无几，所以固定化辣根过氧化物酶的固载量随着载体材料量的增加而减少。为了使单位载体材料的固载量达到最大，优选所用的载体材料量为7 mg L-1。
（3）温度对固定化的影响
为了测定环境温度对辣根过氧化物酶固载量的影响，本发明配置了一系列相同的辣根过氧化物酶溶液与活化后载体材料（7 mg L-1）的混合溶液，加入一定体积的缓冲溶液，控制总体积为1 mL。分别放置在20、25、30、35、40、45℃恒温振荡箱内孵化4小时，然后测定固定化辣根过氧化物酶固载量，得到温度对固定化过程的影响，如图7。
由图7可以看出，环境温度对该载体材料固定化酶的固载量虽有影响但影响很微弱。随着固定化环境温度的变化，固载量范围为120.09 mg g-1到135.99 mg g-1。当温度达到35℃时，固载量达到最高值，当温度超过35℃后继续升高，固载量稍有下降。当然，当温度升高后，辣根过氧化物酶的酶活也会因为受热而有所损失，由此可以得出最优固定化环境温度为35℃。
（4）时间对固定化的影响
固定化时间也是影响固定化过程的重要因素，配置了一系列相同的辣根过氧化物酶溶液与活化后载体材料（7 mg L-1）的混合溶液，加入一定体积的缓冲溶液，控制总体积为1mL。分别放置在35℃恒温振荡箱内孵化4小时，每半个小时取出一组取上清液测试残留辣根过氧化物酶的含量，计算固定化辣根过氧化物酶固载量，然后绘制曲线如图8。
从图8中可以看出，随着时间的推移，辣根过氧化物酶的固载量也逐步升高，180分钟内增长到136.09 mg g-1。超过这个时间后，固载量虽有增加，但是不太明显了。由此可以看出，固定化反应在180分钟时几乎达到饱和。因此，在后面的研究中，固定化酶过程的时间控制为180分钟。
综上所述，当戊二醛溶液浓度为0.1 mol L-1，载体材料的用量为7 mg L-1；加入一定量缓冲溶液，控制总体积为1 mL，放置在温度为35℃下孵育180分钟，配置七组固定化辣根过氧化物酶的固载量平均值为139.82 mg g-1（RSD=0. 87%）。由于载体材料表面接枝6-arm-PEG-NH2，相比其他文献，大大增加了辣根过氧化物酶固载量。
实施例6：固定化辣根过氧化物酶的酶学性能
（1）辣根过氧化物酶最佳催化pH值
用pH值分别为5.5~8.5的缓冲溶液配制一系列固定化酶分散液、游离酶溶液和过氧化氢溶液。采用Worthington法将1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mL过氧化氢溶液移入比色皿中，调温至25℃。加0.1 mL一定浓度的相应pH的酶溶液后开始计时，测量不同pH环境下的酶活变化。以每组测量的最高酶活为基准得到各个pH值下的相对酶活，如图9。
由图中可以看出，固定化辣根过氧化物酶和游离辣根过氧化物酶在pH值为7.0时的催化能力都达到最高，随着pH值变化，固定化辣根过氧化物酶的相对酶活的降低要略慢于游离辣根过氧化物酶，可见经过固定后的辣根过氧化物酶对环境中pH的耐受性略有提高。当pH值大于或小于7.0时，相对酶活有所降低，因此，固定化前后，辣根过氧化物酶的最佳催化pH值为7.0。
（2）最佳催化温度
为了测试辣根过氧化物酶固定化前后的最佳催化温度，将1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mL过氧化氢溶液移入比色皿中，放入可以设置温度的样品池中。加0.1 mL水浴保温的的酶溶液，混合计时，测量催化温度在25℃~70℃时的酶活。以测量的最高酶活为基准得到各个温度下的相对酶活。结果如图10所示。
从图10中可以看出，催化反应温度从25℃升高到55℃时，固定化辣根过氧化物酶和游离辣根过氧化物酶的相对酶活均升高，且在温度55℃时达到最大值。这个阶段的变化可能是因为随着温度的升高，分子动能增大，辣根过氧化物酶与底物苯酚的接触更快速频繁，催化反应进行的更剧烈。随着温度的继续上升，酶活开始有所下降，这可能是因为，温度过高后，组成辣根过氧化物酶的多肽在高温下变形，部分发生黏连，也有可能遮挡酶分子的催化活性位点，导致酶活性下降。从图中也可以看出，温度对固定化辣根过氧化物酶活性的影响小于游离辣根过氧化物酶，体现了固定化辣根过氧化物酶的优势。
（3）温度稳定性
为了考察固定化辣根过氧化物酶对温度的耐受性，我们做了一组实验，将6组相同的游离辣根过氧化物酶和6组固定化辣根过氧化物酶分别放置在温度为30、40、50、60、70、80℃的环境下2个小时后检测其酶活，以每种酶的酶活最高值为基准计算相对酶活，得到图11。
由图可知，辣根过氧化物酶在温度越高的环境下，失活越严重。一般而言，温度升高，会导致酶活性分子变性。但是可以明显看出，经过固定的辣根过氧化物酶的温度稳定性有了显著的提高。但温度为50℃时，游离辣根过氧化物酶和固定化辣根过氧化物酶的相对酶活分别为88.04%和93.72%。当环境温度为80℃时，游离辣根过氧化物酶的酶活为71.04%左右，而固定化辣根过氧化物酶的酶活远远高于辣根过氧化物酶为85.78%左右，显著高于游离酶。
（4）贮藏稳定性
将一系列固定化辣根过氧化物酶和游离辣根过氧化物酶分别放置在4℃冰箱内恒温保存，每隔几天取出来，在最适温度、pH条件下测试其酶活。得到辣根过氧化物酶固定化前后的贮藏稳定性，如图12。
由图12可得，30天过后，固定化辣根过氧化物酶相对酶活为88.39%，而游离辣根过氧化物酶的相对酶活降低至52.04%。60天后，固定化辣根过氧化物酶的相对酶活为71.05%，而游离辣根过氧化物酶的酶活仅为25.06%。随着时间的推移，辣根过氧化物酶的酶活损失越来越大，游离辣根过氧化物酶的酶活损失比较严重。研究表明，通过固定化，辣根过氧化物酶的贮存稳定性有了很大的提高。
（5）操作稳定性
为了研究固定化辣根过氧化物酶的操作稳定性，将1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mL pH值为7.0的过氧化氢溶液移入比色皿中，放入设置温度为55℃样品池中。加0.1 mL提前在55℃保温的pH值为7.0的固定化辣根过氧化物酶溶液，混合计时，测量初始酶活。用磁铁分离固定化辣根过氧化物酶，用缓冲溶液冲洗两遍，加入pH值为7.0的缓冲溶液0.1 mL再次与1.4mL 4-AAP溶液和1.5 mL pH值为7.0的过氧化氢溶液混合，测量循环使用酶活，并以初始酶活为基准计算相对酶活，得到图13。
由图可知，固定化辣根过氧化物酶催化反应8次后，相对酶活为61.06%，猜测酶活降低的主要原因可能是每次操作后用缓冲溶液冲洗，导致一些固定化不牢固的酶相应减少，由于反复的催化反应，长时间在55℃环境下反应，辣根过氧化物酶也有一部分变性失活，会造成一些酶活的损失。但是较游离酶有较高的操作稳定性。
实施例7：固定化辣根过氧化物酶降解苯酚实验
（1）催化降解苯酚的反应参数
本实施例考察了对苯酚降解过程有主要影响的反应参数，包括：苯酚浓度、过氧化氢浓度、固定化酶用量、温度等。结果见图15。
苯酚浓度：取浓度分别为25 mg L-1~300 mg L-1的苯酚溶液，加入一定量固定化辣根过氧化物酶，反应助剂（PEG）以及适量缓冲溶液，控制反应总体积为5 mL，从加入定量H2O2开始计时，恒温振荡一定时间。由图14（a）可以看出，当苯酚浓度较低时，苯酚降解率随着苯酚浓度的升高而急速升高。当苯酚浓度为100 mg L-1时降解率达到最大值45.3%。继续增加苯酚浓度，降解率缓慢逐渐减小。这是由于催化反应最初随着底物浓度的增加而进行的速度加快，当底物浓度增加到一定值，产物的增加会抑制催化反应的继续进行，导致底物降解率的缓慢降低。所以，优选降解苯酚的浓度为100 mg L-1。
H2O2用量：取浓度100 mg L-1的苯酚溶液9组，加入一定量固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG）以及缓冲溶液，控制反应总体积为5 mL。从加入H2O2开始计时，H2O2与苯酚的摩尔比分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，恒温振荡一定时间。由图14（b）中可以看出，当H2O2与苯酚比值小于1时，随着H2O2浓度的增加，苯酚降解率呈线性增加，当比值为1时，苯酚降解率达到最大值68.45%。随后降解率随着H2O2含量的增加而缓慢减少。造成这种趋势的原因可能是，过多的过氧化氢会使得辣根过氧化物酶活性中心的铁离子过度氧化而不能传递电子，从而无法进行催化反应。
固定化酶用量：取浓度100 mg L-1的苯酚溶液，加入一定量固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG），用缓冲溶液定容反应总体积为5 mL。从加入H2O2开始计时，恒温振荡一定时间。由图14（c）可知，苯酚降解率随着固定化辣根过氧化物酶用量的增加而增加，且增加速度先快，之后逐渐变缓慢。由于固定化辣根过氧化物酶在在降解苯酚的过程中是催化剂，随着固定化酶的增加，苯酚和过氧化氢也相对减少，但固定化酶量的增加也会使产物急速增多，部分产物会包裹酶活性中心，导致辣根过氧化物酶无法参与催化反应。综上所述，固定化辣根过氧化物酶优选0.25 mg L-1。
降解温度：取一定量浓度100 mg L-1的苯酚溶液中加入一定量固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG），加入缓冲溶液使反应总体积为5 mL。从加入H2O2开始计时，放入设置不同温度恒温振荡箱内，反应结束后取出来测量上清苯酚含量。从图14（d）中可以看出，苯酚降解率对温度的依赖并不强。随着温度的升高，降解率稍有变化。综合能耗，操作过程等因素，优选反应温度为30℃。
（2）降解苯酚
取三个反应试管加入浓度100 mg L-1的苯酚溶液和反应助剂（PEG），分别在三只试管内加入等量固定化辣根过氧化物酶、游离辣根过氧化物酶和载体材料多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2溶液，控制反应总体积为5 mL。从加入H2O2开始计时，放入50℃恒温振荡箱内反应60分钟，每隔一段时间取出来上清测量苯酚含量。
由图15可以看出，同样的条件下，载体材料、游离辣根过氧化物酶、固定化辣根过氧化物酶对苯酚都有一定的降解效应。载体材料对苯酚具有一定的降解性能但是很微弱（约10%），可能是材料对苯酚有一定的非特异性吸附作用。在同等条件下，固定化辣根过氧化物酶的催化速率显著高于游离辣根过氧化物酶。固定化酶对苯酚的降解率在10分钟内即达到94.4%，催化速率显著高于同等条件下的游离辣根过氧化物酶（46.4%）和载体材料（9.6%）。经过固定化的辣根过氧化物酶具有非常显著的催化效应，苯酚降解率在30分钟内即达到95%。

Claims (10)

1.一种新型的多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，所述固定化辣根过氧化物酶由多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2固定化制备而成，其中所述的多臂磁性复合微球为核-壳-壳结构。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体操作如下：
首先取载体材料Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2，加入戊二醛溶液中进行活化；再用磁铁回收载体材料，配置成浓度为4-10mg/L的悬浮液；将辣根过氧化物酶溶液与活化过的载体材料悬浮液混合，在20-45℃下孵育30-240min，用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测；用缓冲溶液冲洗材料以去除未固定的辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.05-0.3mol/L，优选0.1 mol/L；所述活化的条件为50℃下活化6小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中所述的载体材料悬浮液的浓度为7mg/L；所述孵育为在35℃下孵育180min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2的制备方法如下：
（1）合成Fe3O4微球；
（2）合成聚丙烯酸修饰的Fe3O4微球；
（3）合成多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2：
将步骤（2）制备的聚丙烯酸修饰的Fe3O4微球分散于一定量的水中混匀，加入一定量的6-arm-PEG-NH2的水溶液超声溶解，先加入一定量EDC室温下搅拌混匀，再加入EDC搅拌混匀，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性，放入烘箱干燥至恒重。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的聚丙烯酸修饰的Fe3O4微球和6-arm-PEG-NH2 水溶液的用量比例为：200 mg ：10-30 mL；其中6-arm-PEG-NH2的水溶液浓度为5 mg mL-1。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的超声时间为 0.5-3 小时。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的第一次加入的EDC量为 30-50mg，搅拌时间为2小时；第二次加入EDC的量为12小时，搅拌时间为12小时。
9.一种新型的多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶，其特征在于，所述的固定化辣根过氧化物酶由所述的多臂磁性复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG -NH2固定制备而成，所述固定化辣根过氧化物酶的最适温度为25-70℃，优选55℃，最适pH为5.5-8.5，优选7.0。
10.权利要求9所述的一种新型多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶用于对污染物苯酚的降解。
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