CN108841815A - 一种微生物固定材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物固定材料的制备方法，属于微生物技术领域。本发明以海洋微紫青霉、简青霉为原料，添加葡萄糖等营养物质，在外加剪切力下相互缠绕形成菌丝球体，得到固定基体物，提高了固定微生物的生物活性，同时微生物附载于固定基体物中，使得微生物不易解体，延长了微生物的使用时间；以六水合氯化铁和氯化亚铁为原料，加入氢氧化钠，硅烷偶联剂、氨基六臂聚己二醇，形成稳定的酰胺键，提高了固定材料稳定性能，同时基于磁性物质可以回收利用，可以重复附载微生物，使用寿命延长。本发明解决了针对目前载体生物吸附性差、容易解体的问题。

Description

一种微生物固定材料的制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微生物固定材料的制备方法。

背景技术

近年来研究者们针对农业环境污染物的性质特征，对养殖污水的处理方法和工艺都进行了较系统的研究，分别利用了化学方法和生物方法对氮、磷、重金属离子及有机物分子进行吸附、分离降解，单一的处理方式一定程度上实现了减量化和资源化的目标，但很难达到完全无害化和国家排放标准。在研究过程中，活性炭通常被用作污水污染物的吸附剂，它对于污水的色度和浊度都能有所改观，同时含有大孔、中孔及微孔结构，故对于小分子和重金属离子也会发生吸附作用，亦可被压制成柱状小颗粒作为生物净水剂的载体用于畜禽类养殖厌氧沼液的净化处理，且单一菌株固定于碳载体形成的菌碳净水剂，其污水净化效果往往不如复合菌株形成的菌碳净化效果理想。现有技术公开了一种畜禽养殖厌氧污水净化剂，由复合微生物菌株与活性炭载体组成，所述活性炭载体为煤质柱状活性炭，是以2~10目的煤质活性炭经过定型制成的实心圆柱状活性炭。所用的煤质活性炭以及市售的碳材料（活性炭AC、碳纳米管CNT、石墨GC等）均有着诸多优点，如孔隙度高、比表面大、稳定性好、无毒无污染-环境友好等；但其表面官能团较少，不含亲水性基团（-COOH、-OH），故净化剂在水中分散性较差，阻碍了与污水中污染物的充分接触，而且与含氢键及孤电子对的氨氮物质很难发生静电相互作用，不能完全发挥碳基载体对污染物的吸附作用，因此对碳材料的表面亲、疏水性的调控是显得非常必要。固定微生物技术是通过采用化学或物理的手段将游离细胞或微生物定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。它是从20世纪60年代开始迅速发展的一项环保技术。20世纪70年代后期，随着环境污染的日益严重，研究高效微生物处理污染系统的要求日益迫切。在此背景下固定微生物技术得以迅速发展，并且在废水生物处理中的应用研究也与日俱增。固定化的微生物，由于高度密集而产生的强抵抗能力或载体覆盖物的阻挡作用，削弱了有毒有害物对微生物的冲击作用，使反应器工艺运行的安全性得到大大提高。与传统的微生物处理技术相比，该技术具有高生物量、污泥产量少、选择固定优势菌种、抗毒性强、对水质变化稳定性好等优点。当前固定微生物通常采用的载体主要分为单一无机载体（活性炭、沸石、多孔陶瓷等）和有机载体（多糖凝胶、蛋白类、空心纤维等），采用吸附、共价、包埋、交联等方法将微生物固定在载体上。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对目前载体生物吸附性差、容易解体的问题，提供一种微生物固定材料的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：

一种微生物固定材料的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

（1）取海洋微紫青霉按质量比2~4：1~3：10~20加入简青霉、无菌水混合，振荡10~12h，得混合液，按质量份数计，取8~12份葡萄糖、1~4份酒石酸铵、2~5份磷酸二氢钾、0.3~0.7份五水合硫酸镁、2~5份酵母提取物混合，灭菌，得基体培养基，取混合液按4~6%的接种量接种至基体培养基中培养，离心，取沉淀冷冻干燥，得冷冻干燥物，备用；

（2）取六水合氯化铁按质量比5~8：2~3：20~25加入氯化亚铁、去离子水搅拌混合，得混合物，取混合物按质量比2~4：10~13加入氢氧化钠溶液搅拌混合，过滤，取滤渣经去离子水洗涤，干燥，得干燥物；

（3）取干燥物按质量比1~4：100~120加入质量分数为80%的乙醇混合，加入氨水，于45~55℃搅拌混合，再加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷搅拌混合，磁铁吸引，得磁性基体物，取磁性基体物按质量比1~3：90~120加入乙腈，超声，得超声物；

（4）按质量份数计，取20~25份超声物、70~80份γ-氨基丁酸、40~50份戊二醛、1~4份偶氮二异丁腈，于70~80℃搅拌混合，减压蒸馏，冷却至室温，磁铁吸引，取磁性物经水、无水乙醇依次洗涤，得洗涤物；

（5）取洗涤物按质量比1：100~150加入水搅拌混合，再加入氨基六臂聚己二醇、步骤（1）备用的冷冻干燥物，超声分散，得超声分散液，取超声分散液按质量比4~7：1~3加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐搅拌混合，磁性分离，取固定磁性材料经去离子水洗涤，干燥，即得微生物固定材料。

所述步骤（1）中培养条件为：于25~30℃、150r/min培养5~7天。

所述步骤（2）中混合物的搅拌条件为：于55~65℃搅拌混合20~30min。

所述步骤（3）中氨水的加入量为：干燥物质量的30~40%；γ-氨丙基三乙氧基硅烷的加入量为氨水质量的30~40%。

所述步骤（3）中磁性基体物的搅拌条件为：升温至65~70℃搅拌混合18~24h。

所述步骤（5）中氨基六臂聚己二醇、步骤（1）备用的冷冻干燥物的加入量分别为：洗涤物质量的2~5%和洗涤物质量的2~3倍。

所述步骤（5）中加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐后的搅拌条件为：于25~30℃搅拌混合10~12h。

本发明与其他方法相比，有益技术效果是：

（1）本发明以海洋微紫青霉、简青霉为原料，添加葡萄糖等营养物质，在生长繁殖过程中，会产生大量的菌丝，孢子萌发长出菌丝粘连形成菌核，菌丝不断延长，在外加剪切力下相互缠绕形成菌丝球体，得到固定基体物，而其内部结构疏松，具有大量孔隙，其利于需要固定的微生物的吸附和传质，可以为其他菌体的附着生长提供大量的空间和营养物质，由于菌丝球是具有生物活性的物质，具有较好的生物相容性其代谢过程中产生的多糖等营养物质可以供给给固定的微生物作为营养物质，提高了固定微生物的生物活性，同时微生物附载于固定基体物中，使得微生物不易解体，延长了微生物的使用时间；

（2）本发明以六水合氯化铁和氯化亚铁为原料，加入氢氧化钠，使得生成的磁性物质沉淀，再加入硅烷偶联剂修饰磁性物质表面的双键，加入氨基六臂聚己二醇，用来修饰蛋白质多肽，它含有丰富的氨基，能通过戊二醛交联剂与微生物蛋白质结合可以实现微生物的固定化，提高了吸附性，增加固定化微生物稳定性和固载量，同时能与带有羧基的γ-氨基丁酸小分子发生反应，形成稳定的酰胺键，使得磁性物质表面的氨基大量增加，氨基带正电荷，而固定基体物由于为微生物载体，带负电荷，形成静电吸附，可以吸附大量的固定基体物，将固定基体物稳定的吸附于固定磁性材料表面，提高了固定材料稳定性能，同时基于磁性物质可以回收利用，可以重复附载微生物，使用寿命延长。

具体实施方式

菌种：海洋微紫青霉、简青霉于1~4℃斜面保藏。

一种微生物固定材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）取海洋微紫青霉按质量比2~4：1~3：10~20加入简青霉、无菌水混合，于150r/min振荡10~12h，得混合液，按质量份数计，取8~12份葡萄糖、1~4份酒石酸铵、2~5份磷酸二氢钾、0.3~0.7份五水合硫酸镁、2~5份酵母提取物混合，121℃灭菌20min，得基体培养基，取混合液按4~6%的接种量接种至基体培养基中，于25~30℃、150r/min培养5~7天，离心，取沉淀冷冻干燥，得冷冻干燥物，备用；

（2）取六水合氯化铁按质量比5~8：2~3：20~25加入氯化亚铁、去离子水，于55~65℃搅拌混合20~30min，得混合物，取混合物按质量比2~4：10~13加入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌混合1~2h，过滤，取滤渣经去离子水洗涤，干燥，得干燥物；

（3）取干燥物按质量比1~4：100~120加入质量分数为80%的乙醇混合，加入干燥物质量30~40%的氨水，于45~55℃搅拌混合30~40min，再加入氨水质量30~40%的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，升温至65~70℃搅拌混合18~24h，磁铁吸引，得磁性基体物，取磁性基体物按质量比1~3：90~120加入乙腈，超声3~5min，得超声物；

（4）按质量份数计，取20~25份超声物、70~80份γ-氨基丁酸、40~50份戊二醛、1~4份偶氮二异丁腈，于70~80℃搅拌混合1~2h，减压蒸馏，冷却至室温，磁铁吸引，取磁性物经水、无水乙醇依次洗涤，得洗涤物；

（5）取洗涤物按质量比1：100~150加入水，搅拌混合20~30min，再加入洗涤物质量2~5%的氨基六臂聚己二醇和洗涤物质量2~3倍的步骤（1）备用的冷冻干燥物，超声分散1~2h，得超声分散液，取超声分散液按质量比4~7：1~3加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐，于25~30℃搅拌混合10~12h，磁性分离，取固定磁性材料经去离子水洗涤，干燥，即得微生物固定材料。

微生物固定材料的使用方法：取菌种、菌粉接种至相应的活化培养基中，得菌种活化液，取菌种活化液按质量比2~5：1~3浸泡至微生物固定材料中，静置3~5h，取出浸泡后微生物固定材料，冷冻干燥，即可。

菌种：海洋微紫青霉、简青霉于1℃斜面保藏。

一种微生物固定材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）取海洋微紫青霉按质量比2：1：10加入简青霉、无菌水混合，于150r/min振荡10h，得混合液，按质量份数计，取8份葡萄糖、1份酒石酸铵、2份磷酸二氢钾、0.3份五水合硫酸镁、2份酵母提取物混合，121℃灭菌20min，得基体培养基，取混合液按4%的接种量接种至基体培养基中，于25℃、150r/min培养5天，离心，取沉淀冷冻干燥，得冷冻干燥物，备用；

（2）取六水合氯化铁按质量比5：2：20加入氯化亚铁、去离子水，于55℃搅拌混合20min，得混合物，取混合物按质量比2：10加入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌混合1h，过滤，取滤渣经去离子水洗涤，干燥，得干燥物；

（3）取干燥物按质量比1：100加入质量分数为80%的乙醇混合，加入干燥物质量30%的氨水，于45℃搅拌混合30min，再加入氨水质量30%的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，升温至65℃搅拌混合18h，磁铁吸引，得磁性基体物，取磁性基体物按质量比1：90加入乙腈，超声3min，得超声物；

（4）按质量份数计，取20份超声物、70份γ-氨基丁酸、40份戊二醛、1份偶氮二异丁腈，于70℃搅拌混合1h，减压蒸馏，冷却至室温，磁铁吸引，取磁性物经水、无水乙醇依次洗涤，得洗涤物；

（5）取洗涤物按质量比1：100加入水，搅拌混合20min，再加入洗涤物质量2%的氨基六臂聚己二醇和洗涤物质量2倍的步骤（1）备用的冷冻干燥物，超声分散1h，得超声分散液，取超声分散液按质量比4：1加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐，于25℃搅拌混合10h，磁性分离，取固定磁性材料经去离子水洗涤，干燥，即得微生物固定材料。

微生物固定材料的使用方法：取菌种、菌粉接种至相应的活化培养基中，得菌种活化液，取菌种活化液按质量比2：1浸泡至微生物固定材料中，静置3h，取出浸泡后微生物固定材料，冷冻干燥，即可。

菌种：海洋微紫青霉、简青霉于3℃斜面保藏。

一种微生物固定材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）取海洋微紫青霉按质量比3：2：15加入简青霉、无菌水混合，于150r/min振荡11h，得混合液，按质量份数计，取10份葡萄糖、3份酒石酸铵、4份磷酸二氢钾、0.5份五水合硫酸镁、4份酵母提取物混合，121℃灭菌20min，得基体培养基，取混合液按5%的接种量接种至基体培养基中，于28℃、150r/min培养6天，离心，取沉淀冷冻干燥，得冷冻干燥物，备用；

（2）取六水合氯化铁按质量比7：2.5：23加入氯化亚铁、去离子水，于60℃搅拌混合25min，得混合物，取混合物按质量比3：12加入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌混合1.5h，过滤，取滤渣经去离子水洗涤，干燥，得干燥物；

（3）取干燥物按质量比3：110加入质量分数为80%的乙醇混合，加入干燥物质量35%的氨水，于50℃搅拌混合35min，再加入氨水质量35%的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，升温至68℃搅拌混合21h，磁铁吸引，得磁性基体物，取磁性基体物按质量比2：105加入乙腈，超声4min，得超声物；

（4）按质量份数计，取23份超声物、75份γ-氨基丁酸、45份戊二醛、3份偶氮二异丁腈，于75℃搅拌混合1.5h，减压蒸馏，冷却至室温，磁铁吸引，取磁性物经水、无水乙醇依次洗涤，得洗涤物；

（5）取洗涤物按质量比1：130加入水，搅拌混合25min，再加入洗涤物质量4%的氨基六臂聚己二醇和洗涤物质量2.5倍的步骤（1）备用的冷冻干燥物，超声分散1.5h，得超声分散液，取超声分散液按质量比6：2加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐，于28℃搅拌混合11h，磁性分离，取固定磁性材料经去离子水洗涤，干燥，即得微生物固定材料。

微生物固定材料的使用方法：取菌种、菌粉接种至相应的活化培养基中，得菌种活化液，取菌种活化液按质量比4：2浸泡至微生物固定材料中，静置4h，取出浸泡后微生物固定材料，冷冻干燥，即可。

菌种：海洋微紫青霉、简青霉于4℃斜面保藏。

一种微生物固定材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）取海洋微紫青霉按质量比4：3：20加入简青霉、无菌水混合，于150r/min振荡12h，得混合液，按质量份数计，取12份葡萄糖、4份酒石酸铵、5份磷酸二氢钾、0.7份五水合硫酸镁、5份酵母提取物混合，121℃灭菌20min，得基体培养基，取混合液按6%的接种量接种至基体培养基中，于30℃、150r/min培养7天，离心，取沉淀冷冻干燥，得冷冻干燥物，备用；

（2）取六水合氯化铁按质量比8：3：25加入氯化亚铁、去离子水，于65℃搅拌混合30min，得混合物，取混合物按质量比4：13加入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌混合2h，过滤，取滤渣经去离子水洗涤，干燥，得干燥物；

（3）取干燥物按质量比4：120加入质量分数为80%的乙醇混合，加入干燥物质量40%的氨水，于55℃搅拌混合40min，再加入氨水质量40%的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，升温至70℃搅拌混合24h，磁铁吸引，得磁性基体物，取磁性基体物按质量比3：120加入乙腈，超声5min，得超声物；

（4）按质量份数计，取25份超声物、80份γ-氨基丁酸、50份戊二醛、4份偶氮二异丁腈，于80℃搅拌混合2h，减压蒸馏，冷却至室温，磁铁吸引，取磁性物经水、无水乙醇依次洗涤，得洗涤物；

（5）取洗涤物按质量比1：150加入水，搅拌混合30min，再加入洗涤物质量5%的氨基六臂聚己二醇和洗涤物质量3倍的步骤（1）备用的冷冻干燥物，超声分散2h，得超声分散液，取超声分散液按质量比7：3加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐，于30℃搅拌混合12h，磁性分离，取固定磁性材料经去离子水洗涤，干燥，即得微生物固定材料。

微生物固定材料的使用方法：取菌种、菌粉接种至相应的活化培养基中，得菌种活化液，取菌种活化液按质量比5：3浸泡至微生物固定材料中，静置5h，取出浸泡后微生物固定材料，冷冻干燥，即可。

对比例：市场上某公司生产的微生物固定材料。

将实施例1、2、3和对比例制备的不同微生物载体投放至养殖厌氧污水，对其吸附效果进行比较。分别称取 500g各种形状的微生物载体，投入到50L的种猪养殖污水中，以未处理的养殖厌氧污水为对照，3、5d后分别测定其CODcr、BOD5、氨氮、总磷等技术指标，计算固定载体对养殖厌氧污水中各指标的吸附率。其测试结果记录如表1：

表1：

测试项目	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1
					COD吸附率/%	7.8	7.5	7.6	2.1
BOD吸附率/%	6.5	6.8	6.7	1.1
					氨氮吸附率/%	5.2	5.1	5.2	2.2
总磷吸附率/%	2.1	1.8	2.0	0
					载体浸水状态	不易溶解	不易溶解	不易溶解	长时间浸泡易被腐蚀解体

综上所述，本发明制备的微生物固定材料对载体生物吸附性加强，载体本身不易被腐蚀解体，有效时间长，值得大力提倡。

Claims (7)

1.一种微生物固定材料的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

（1）取海洋微紫青霉按质量比2~4：1~3：10~20加入简青霉、无菌水混合，振荡10~12h，得混合液，按质量份数计，取8~12份葡萄糖、1~4份酒石酸铵、2~5份磷酸二氢钾、0.3~0.7份五水合硫酸镁、2~5份酵母提取物混合，灭菌，得基体培养基，取混合液按4~6%的接种量接种至基体培养基中培养，离心，取沉淀冷冻干燥，得冷冻干燥物，备用；

（2）取六水合氯化铁按质量比5~8：2~3：20~25加入氯化亚铁、去离子水搅拌混合，得混合物，取混合物按质量比2~4：10~13加入氢氧化钠溶液搅拌混合，过滤，取滤渣经去离子水洗涤，干燥，得干燥物；

（3）取干燥物按质量比1~4：100~120加入质量分数为80%的乙醇混合，加入氨水，于45~55℃搅拌混合，再加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷搅拌混合，磁铁吸引，得磁性基体物，取磁性基体物按质量比1~3：90~120加入乙腈，超声，得超声物；

（4）按质量份数计，取20~25份超声物、70~80份γ-氨基丁酸、40~50份戊二醛、1~4份偶氮二异丁腈，于70~80℃搅拌混合，减压蒸馏，冷却至室温，磁铁吸引，取磁性物经水、无水乙醇依次洗涤，得洗涤物；

（5）取洗涤物按质量比1：100~150加入水搅拌混合，再加入氨基六臂聚己二醇、步骤（1）备用的冷冻干燥物，超声分散，得超声分散液，取超声分散液按质量比4~7：1~3加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐搅拌混合，磁性分离，取固定磁性材料经去离子水洗涤，干燥，即得微生物固定材料。

2.根据权利要求1所述的微生物固定材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中培养条件为：于25~30℃、150r/min培养5~7天。

3.根据权利要求1所述的微生物固定材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中混合物的搅拌条件为：于55~65℃搅拌混合20~30min。

4.根据权利要求1所述的微生物固定材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中氨水的加入量为：干燥物质量的30~40%；γ-氨丙基三乙氧基硅烷的加入量为氨水质量的30~40%。

5.根据权利要求1所述的微生物固定材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中磁性基体物的搅拌条件为：升温至65~70℃搅拌混合18~24h。

6.根据权利要求1所述的微生物固定材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中氨基六臂聚己二醇、步骤（1）备用的冷冻干燥物的加入量分别为：洗涤物质量的2~5%和洗涤物质量的2~3倍。

7.根据权利要求1所述的微生物固定材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中加入己基[3-（二甲氨基）丙基]碳二亚胺盐酸盐后的搅拌条件为：于25~30℃搅拌混合10~12h。