CN113862191A - 一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，本发明涉及水处理技术领域，取四环素废水处理过程中产生的污泥，制成泥水混合液，振荡培养后依次接种到富集培养基和选择培养基上，进行菌株的分离与纯化，得到四环素降解菌；利用废弃生物质材料制备生物炭，并进行改性，得到改性生物炭；将四环素降解菌吸附固定到改性生物炭上，得到改性生物炭固定化四环素降解菌。针对现有水中四环素去除方法的不足，利用改性生物炭固定化四环素降解菌，结合生物炭吸附与四环素降解菌的生物降解作用，在提高水中四环素去除效果的同时，降低四环素处理成本并实现废弃生物质的资源化利用。
Description
技术领域
本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法。
背景技术
四环素因其光谱抗菌性和价格低廉，被广泛用于畜禽养殖和临床医学中，相较于其它抗生素，四环素的生产量和使用量居全球第二，在中国则居第一。但人畜服用的四环素大多(约75％)不能被完全吸收，最终会以活性形式随尿液或粪便排出体外，一部分进入污水处理厂，一部分未经处理直接进入水环境中。而普通污水处理厂对四环素的去除率小于50％，大多数都随排水进入了自然界水体中。进入水环境中的四环素一方面可以通过食物链富集，最终进入人体，干扰人类各种生理功能；一方面会提高环境中微生物的抗药性，进而产生超级病菌。因此有效去除水环境中残留的四环素以降低其潜在的环境风险引起了很多学者的关注。
目前最常用的水中四环素的去除方法为吸附法以及生物降解法。吸附法无二次污染但存在吸附材料再生的问题；生物法利用微生物降解污染物，具备专一性强、易控制、成本较低、无二次污染等优点，是目前最为经济有效的方法，但微生物在水溶液中难以分离和回收，通过微生物固定技术将微生物固定在载体材料能有效解决这一问题，专利CN108998439A将微生物固定在凝胶球中去除水中四环素，但是凝胶载体不可避免会产生一部分传质阻力，影响基质的传输效率。
生物炭是废弃生物质原料在限氧条件下热解而成的一种富碳产物，具有比表面积大、孔隙结构致密等优点，而且其来源广泛多为废弃物、制作成本低、绿色环保无污染，成为近年来热门的微生物载体材料。而将生物炭进行适当的改性后还能进一步增大其比表面积，不仅可以有效地固定微生物，给微生物提供良好的氧气和营养物质传输环境，还可以发挥自身的吸附性能，大大提高污染物的去除效率。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供了一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，针对现有水中四环素去除方法的不足，利用改性生物炭固定化四环素降解菌，结合生物炭吸附与四环素降解菌的生物降解作用，在提高水中四环素去除效果的同时，降低四环素处理成本并实现废弃生物质的资源化利用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：它的操作步骤如下：
步骤1：取四环素废水处理过程中产生的污泥，制成泥水混合液，振荡培养后依次接种到富集培养基和选择培养基上，进行菌株的分离与纯化，得到四环素降解菌；
步骤2：利用废弃生物质材料制备生物炭，并进行改性，得到改性生物炭；
步骤3：将步骤1得到的四环素降解菌吸附固定到步骤2得到的改性生物炭上，得到改性生物炭固定化四环素降解菌。
优选地，步骤1中所述的泥水混合液为5g的污泥样品与45mL的无菌水混合而成，振荡培养条件为30℃、150r/min下摇床振荡培养24h，接种量为5％。
优选地，步骤2所述的废弃生物质材料为造纸厂废弃木片、园林修剪的枝条等废弃木材的一种，改性方法为碱改性。
优选地，所述富集培养基配方为：葡萄糖1.0g、蛋白胨10g、NaCl0.5g、K2HPO40.1g、MgSO4·7H2O0.05g、四环素初始量为200mg，此后按100mg的梯度逐渐增加至600mg，蒸馏水定容至1000mL，pH为7.2，121℃下灭菌20min。
优选地，所述选择培养基配方为：四环素600mg、(NH4)2SO41g、NaCl0.5g、KH2PO40.5g、K2HPO41.5g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl2·2H2O0.1g、FeCl30.02g，蒸馏水定容至1000mL，121℃下灭菌20min。
优选地，所述改性生物炭通过以下方法制备得到：
步骤2.1：将用于制备生物炭的原材料用去离子水清洗表面后自然晾干，完全晾干后，利用粉碎机进行破碎，粉碎后过100目筛备用；
步骤2.2：利用高温限氧慢速热解法，取适量原材料放在坩埚中压实盖严，在马沸炉中以5℃/min的速度升温至700℃，保持恒温碳化6h，待冷却至室温后取出；
步骤2.3：用去离子水清洗生物炭至中性，于60℃烘箱中干燥24h后，过100目筛备用；
步骤2.4：步骤2.3得到的生物炭用2mol/L的NaOH溶液浸渍24h后取出后用去离子水洗涤，直到洗涤水pH值不变，然后在60℃下烘干至恒重，得到碱改性生物炭。
优选地，所述改性生物炭固定化四环素降解菌通过以下方法制备得到：
步骤3.1：挑取纯化的菌株，接种于LB液体培养基中，在30℃、150r/min的摇床内培养至OD600＝1；
步骤3.2：将培养基进行离心，收集菌体，用无菌水将菌体洗涤2次，最后悬于无菌水中；
步骤3.3：在无菌水中加入改性生物炭，在30℃、150r/min的条件下摇床吸附，24h后进行过滤；
步骤3.4：用无菌水淋洗过滤后的改性生物炭，得到改性生物炭固定化菌株。
优选地，所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g，pH为7.2，蒸馏水定容至1000mL，121℃下灭菌20min。
优选地，所述改性生物炭与无菌水的比例为：每100mL无菌水中加入1g改性生物炭。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、将四环素降解菌固定在改性生物炭上，不仅能有效地固定菌株，解决其在水溶液中难以分离和回收的问题，还可以利用菌株降解吸附剂上的四环素，增加吸附剂的寿命，从而同时发挥吸附与生物降解作用，大大提高水中四环素的去除效率。
2、制备的碱改性生物炭具有较大的比表面积和较多的表面活性位点，给微生物提供良好的氧气和营养物质传输环境，且原材料来自于生活生产中的废弃物，廉价易得，实现了废弃物的资源化利用。
3、制得的改性生物炭固定化四环素降解菌具有成本低、效率高、无二次污染等优点，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
本具体实施方式采用如下技术方案：
步骤1、菌株分离与纯化(活性污泥样本取自江苏某制药厂四环素生产废水处理车间)
步骤1.1、培养基配方：
富集培养基：葡萄糖1g，蛋白胨10g，NaCl0.5g，K2HPO40.g，Mg SO4·7H2O 0.05g，四环素初始量为200mg(此后按100mg的梯度逐渐增加至600mg)，蒸馏水定容至1000mL，pH7.2，121℃下灭菌20min。
选择培养基：四环素600mg，(NH4)2SO41g，NaCl0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O 0.1g，FeCl30.02g，蒸馏水定容至1000mL，121℃下灭菌20min。
步骤1.2、分离与纯化步骤：
取5g污泥样品，45mL无菌水制成泥水混合液，在30℃、150r/min条件下摇床振荡培养24h，静置后取上清液按5％的接种量加入到富集培养基中，在37℃、150r/min、四环素初始浓度为200mg/L的条件下恒温震荡培养，培养基浑浊时取5ml移种到新的富集培养基中，并以100mg/L的梯度逐渐增加四环素的浓度至600mg/L，在相同的条件下持续振荡培养。之后以选择培养基代替富集培养基，以四环素作为唯一的碳源筛选驯化菌种，在相同条件下培养48h，最终得到菌体培养液。将菌体培养液进行稀释涂布，37℃下培养48h，根据菌落形态挑选不同的菌株在同样的培养基平板上重复划线多次，进行分离纯化，直至获得单菌落。经形态、生理生化特征等分析，初步判定该菌株为地衣芽孢杆菌，且其对培养基中四环素的48h降解率达到63.4％。
步骤2、生物炭制备与改性(制备生物炭的原材料为江苏某造纸厂废弃的木片)
步骤2.1、用去离子水清洗表面后自然晾干，完全晾干后，利用粉碎机进行破碎，粉碎后过100目筛备用。利用高温限氧慢速热解法制备，取适量原材料放在坩埚中压实盖严，在马沸炉中以5℃/min的速度升温至700℃，保持恒温碳化6h，待冷却至室温后取出，用去离子水清洗至中性，于60℃烘箱中干燥24h后过100目筛，装于自封袋中备用。
步骤2.2、在室温下，取5g制备好的生物炭放入锥形瓶中，加入200mL浓度为2mol/L的KOH溶液，浸渍24h后取出，用去离子水洗涤，直到洗涤水pH值不变，然后在60℃下烘干至恒重，得到碱改性生物炭。
步骤3、生物炭固定化菌株
挑取之前纯化的菌株，接种于200mL的LB液体培养基中，在30℃、150r/min的摇床内培养至OD600＝1，然后将培养基进行离心收集菌体，用无菌水将菌体洗涤2次，最后悬于100mL的无菌水中，并加入1g改性的生物炭，在30℃、150r/min的条件下摇床吸附，24h后进行过滤过滤，并用无菌水淋洗2次生物炭，得到生物炭固定化菌剂。其中LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，pH为7.2，蒸馏水定容至1000mL，121℃下灭菌20min。
步骤4、固定化菌株对水中四环素的降解效果
配备浓度为20mg/L的四环素模拟废水20mL，分别将0.2g生物炭、改性生物炭和改性生物炭固定化四环素降解菌加入到模拟的四环素废水中，定期采集水样，测定四环素浓度，结果发现两种生物炭对四环素的吸附在8h达到平衡，改性生物炭固定化菌剂对四环素的生物降解作用约在10h左右达到平衡，其中生物炭的去除率最低为52.1％，改性生物炭为73.6％，而改性生物炭四环素降解菌对四环素的去除率达到90.8％，可见本具体实施方式的改性生物炭四环素降解菌对水中四环素具有较高的去除率。
采用上述结构后，本具体实施方式的有益效果如下：
1、将四环素降解菌固定在改性生物炭上，不仅能有效地固定菌株，解决其在水溶液中难以分离和回收的问题，还可以利用菌株降解吸附剂上的四环素，增加吸附剂的寿命，从而同时发挥吸附与生物降解作用，大大提高水中四环素的去除效率。
2、制备的碱改性生物炭具有较大的比表面积和较多的表面活性位点，给微生物提供良好的氧气和营养物质传输环境，且原材料来自于生活生产中的废弃物，廉价易得，实现了废弃物的资源化利用。
3、制得的改性生物炭固定化四环素降解菌具有成本低、效率高、无二次污染等优点，有显著的经济和社会效益。
对于本领域的技术人员来说，其可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改、部分技术特征的等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：它的操作步骤如下：
步骤(1)：取四环素废水处理过程中产生的污泥，制成泥水混合液，振荡培养后依次接种到富集培养基和选择培养基上，进行菌株的分离与纯化，得到四环素降解菌；
步骤(2)：利用废弃生物质材料制备生物炭，并进行改性，得到改性生物炭；
步骤(3)：将步骤(1)得到的四环素降解菌吸附固定到步骤(2)得到的改性生物炭上，得到改性生物炭固定化四环素降解菌。
2.根据权利要求1所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的泥水混合液为5g的污泥样品与45mL的无菌水混合而成，振荡培养条件为30℃、150r/min下摇床振荡培养24h，接种量为5％。
3.根据权利要求1所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：步骤(2)所述的废弃生物质材料为造纸厂废弃木片、园林修剪的枝条等废弃木材的一种，改性方法为碱改性。
4.根据权利要求1所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：所述富集培养基配方为：葡萄糖1.0g、蛋白胨10g、NaCl0.5g、K2HPO40.1g、MgSO4·7H2O0.05g、四环素初始量为200mg，此后按100mg的梯度逐渐增加至600mg，蒸馏水定容至1000mL，pH为7.2，121℃下灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：所述选择培养基配方为：四环素600mg、(NH4)2SO41g、NaCl0.5g、KH2PO40.5g、K2HPO41.5g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl2·2H2O0.1g、FeCl30.02g，蒸馏水定容至1000mL，121℃下灭菌20min。
6.根据权利要求1所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：所述改性生物炭通过以下方法制备得到：
步骤(2.1)：将用于制备生物炭的原材料用去离子水清洗表面后自然晾干，完全晾干后，利用粉碎机进行破碎，粉碎后过100目筛备用；
步骤(2.2)：利用高温限氧慢速热解法，取适量原材料放在坩埚中压实盖严，在马沸炉中以5℃/min的速度升温至700℃，保持恒温碳化6h，待冷却至室温后取出；
步骤(2.3)：用去离子水清洗生物炭至中性，于60℃烘箱中干燥24h后，过100目筛备用；
步骤(2.4)：步骤(2.3)得到的生物炭用2mol/L的NaOH溶液浸渍24h后取出后用去离子水洗涤，直到洗涤水pH值不变，然后在60℃下烘干至恒重，得到碱改性生物炭。
7.根据权利要求1所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：所述改性生物炭固定化四环素降解菌通过以下方法制备得到：
步骤(3.1)：挑取纯化的菌株，接种于LB液体培养基中，在30℃、150r/min的摇床内培养至OD600＝1；
步骤(3.2)：将培养基进行离心，收集菌体，用无菌水将菌体洗涤2次，最后悬于无菌水中；
步骤(3.3)：在无菌水中加入改性生物炭，在30℃、150r/min的条件下摇床吸附，24h后进行过滤；
步骤(3.4)：用无菌水淋洗过滤后的改性生物炭，得到改性生物炭固定化菌株。
8.根据权利要求7所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g，pH为7.2，蒸馏水定容至1000mL，121℃下灭菌20min。
9.根据权利要求7所述的一种利用改性生物炭固定化四环素降解菌去除水中四环素的方法，其特征在于：所述改性生物炭与无菌水的比例为：每100mL无菌水中加入1g改性生物炭。
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