CN111004737A - 一种微生物群体感应信号淬灭菌及其在病害防控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物群体感应信号淬灭菌及其在病害防控中的应用。本发明筛选得到微生物群体感应信号淬灭菌QL‑9a，属于假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans，已于2019年9月4日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60761。淬灭菌QL‑9a可以以DSF及AHLs为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，能够耐受浓度高达5mM的DSF及AHLs，并在24h内将2mM的DSF及AHLs降解完全，具有DSF及AHLs高降解活性，降解效率高、效果显著、降解性能稳定。该菌可应用于依赖DSF及/或AHLs信号介导致病的病原菌的生物防治中，可以减少化学农药的应用，减轻环境压力，具有巨大的应用价值及广阔的应用前景。

Description

一种微生物群体感应信号淬灭菌及其在病害防控中的应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一株微生物群体感应淬灭菌及其在病害防控中的应用，尤其是在防治DSF及AHLs介导致病的病害中的应用。

背景技术

微生物病害一直都是农业生产无法避免却是必须解决的重要问题，比如水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、野油菜黑腐病等，在农业生产上造成严重的财产损失，初期人们通过施加更多和浓度更高的农药来治理植物病害，但是农药长期并重复喷施一段时间之后，致病微生物就产生了耐药性，历史上有很长一段时间人们对微生物耐药性束手无策，直到发现了群体微生物感应信号系统(Quorum Sensing)，发现微生物之间存在着一种特殊的“通讯系统”，这是微生物之间交流的重要方式，广泛发生在真核生物和原核生物之间跨界信号交流。主要依赖于监测环境中信号的密度来感知细菌的密度，建立真核生物与原核生物之间交流的通道，从而调控彼此表达致病因子，造成细菌性病害。近几年，研究解析群体感应信号系统的调控机理成为微生物领域研究热点。

群体感应淬灭即是通过干扰QS跨界信号交流来达到调控致病因子表达的方式，目前的研究总结，可以通过三个靶点来进行防治植物病害：(1)从源头破坏：影响信号分子的表达产生；(2)从路径破坏：使QS信号分子无法识别细胞密度，不能正常表达；(3)从终点破坏：阻断信号分子与受体蛋白结合，无法表达致病因子。这种方法是目前解决植物细菌性病害的新策略，更重要的是，群体感应淬灭是通过干扰QS来间接阻断表达的途径，而不是直接杀死致病细菌，很大程度上可以解决致病微生物耐药性的问题。

第一个被发现鉴定出来的群体感应信号是N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone，AHL)，又称为自诱导因子，是在革兰氏阴性细菌中发现的，革兰氏阴性菌是一种经革兰氏染色反应红色的细菌，这种细菌广泛存在于食品加工环节中，引起食品腐坏变质。AHL不仅仅存在于革兰氏阴性细菌，许多衍生物AHLs已经在很多致病细菌中有广泛发现，存在多细胞生物行为。QS能调控细胞生长、生物被膜和致病因子的形成，影响植物的免疫反应和生长发育，还参与调解多种生理过程，建立跨界信号交流。另一种具有代表性的被鉴定出来的群体感应信号是DSF(Diffusible Signal Factor)，也称扩散性信号因子，首次在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)中发现，后来的研究发现，在很多致病细胞中也广泛存在，比如伯克氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌等，和AHLs的致病机理差不多，主要是通过影响生物被膜的形成和毒素的产生致病。本发明目的为筛选、分离并鉴定高效群体感应信号分子淬灭菌，进行植物病害的生防效果研究，为细菌病害生物防治提供丰富的微生物资源，解决农药及抗生素滥用带来的环境污染及食品安全问题。

如本发明人团队前期研究显示(201711248767.6)硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)具有较好的微生物群体感应信号分子的作用，群体淬灭方向、抑制软腐病病害、防治依赖微生物群体感应信号介导致病的病原菌危害方面具有巨大推广应用的潜力。更多、更优秀的微生物降解菌库的充实建设，对依赖微生物群体感应信号介导致病的病原菌危害的防治意义重大。

发明内容

本发明的目的提供一种新的、降解效果更好的微生物群体感应信号分子DSF/AHLs淬灭菌，即淬灭菌QL-9a，及其在生物防治中解决作物病害的应用。该菌株属于假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans。淬灭菌QL-9a能够耐受浓度高达5mM的DSF及AHLs，并在24h内将2mM的DSF及AHLs降解完全，具有DSF及AHLs高降解活性，降解效率高、效果显著、降解性能稳定，在防治DSF/AHLs介导的致病菌方面具有巨大的应用潜力，为今后开发新型高效且无害的生物药物提供新思路。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans具有非常高效的降解微生物群体感应信号分子的作用，并筛选得到一种微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a，属于假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans，已于2019年9月4日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60761，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

该淬灭菌QL-9a来源于广东省广州市华南农业大学实验田水稻根围土壤。改淬灭菌QL-9a为革兰氏阴性菌，菌落扁平，颜色呈淡绿色，表面光滑不透明，边缘模糊。

该假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans淬灭菌QL-9a具有非常高效的降解微生物群体感应信号分子的作用，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans在降解群体感应信号分子AHLs、DSF和/或DSF类似物，或在制备降解AHLs、DSF和/或DSF类似物的产品中的应用。

假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans在防治AHLs、DSF和/或DSF类似物介导致病的病害，或在制备依赖AHLs、DSF和/或DSF类似物致病的致病菌的防治制剂方面的应用。

根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述假单胞菌Pseudomonasmultiresinivorans为所述淬灭菌QL-9a。

优选地，所述DSF类似物为包括顺-2-十二碳烯酸、(2Z，3Z)-11-甲基-2,5-二烯-12-烷酸、顺-11-甲基-2-十二碳烯酸、顺-2-葵烯酸、12-甲基-十四烷酸在内的DSF家族群体感应信号分子。

优选地，所述AHLs包括N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代辛酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代癸酰)-L-高丝氨酸内酯、异戊酰基-高丝氨酸内酯、羧化酰基-高丝氨酸内酯(carboxyl-AHLs)、芳基-高丝氨酸内酯或香豆酰基-高丝氨酸内酯。

一种防治依赖DSF或AHLs致病的致病菌病害的方法，用假单胞菌Pseudomonasmultiresinivorans的菌液处理植物。

一种可降解群体感应信号分子DSF和/或AHLs的降解菌剂，含有假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans或其菌液。

一种依赖DSF和/或AHLs致病的病原菌的生防制剂，含有假单胞菌Pseudomonasmultiresinivorans或其菌液。

在所述方法、所述降解菌剂或所述生防制剂中，优选地，所述假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans为上述淬灭菌QL-9a。

为了达到更好的降解微生物群体感应信号分子的作用，优选地需要控制以下条件：

淬灭菌QL-9a的培养条件为：将其接种于培养基中，温度为30℃，初始pH为7.2，接种量为1-3％，摇床转速为200rpm。

所述培养基(MSM)的配方为，KH₂PO₄，4.5g；(NH₄)₂SO₄，2.0g；FeSO₄，0.005g；K₂HPO₄，10.5g；SO₄·7H₂O，0.2g；CaCl₂，0.01g；MnCl₂，0.002g，补足蒸馏水至1000mL。

降解过程的工作条件为：温度25-38℃、pH 5.5-8.5(优选温度30℃、优选pH 7.2)。

降解过程中，需振荡降解体系，振荡转速为100-300rpm(优选200rpm)时，能满足淬灭菌QL-9a对溶氧的需求，提高淬灭菌QL-9a对DSF/AHLs的降解效率。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的、降解效果更好的微生物群体感应信号分子DSF/AHLs淬灭菌QL-9a，该菌株属于假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans。淬灭菌QL-9a能利用DSF作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，并对高浓度的DSF具有稳定且高效的降解活性。淬灭菌QL-9a能够耐受浓度高达5mM的DSF/AHLs，并在24h内可以将2mM的DSF/AHLs降解完全。该菌在防治DSF/AHLs介导致病的致病菌方面具有较高的应用价值的和巨大的发展潜力。该菌株的应用可以减少化学农药的使用，减轻环境压力，同时为植物病害生物防治提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明的菌株QL-9a在营养琼脂培养基上的菌落形态图。

图2为本发明的菌株QL-9a的系统进化树分析图。

图3为本发明的菌株QL-9a以DSF为唯一碳源时的生长曲线和降解曲

线图。

图4为本发明的菌株QL-9a对AHLs的降解活性测定图。(CK为未添加淬灭菌的空白对照)。

图5为本发明的菌株QL-9a单独接种及与野油菜黄单胞菌共同接种于白萝卜肉质根切片48h后白萝卜肉质根切片的发病情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a的分离、鉴定

1、菌株的分离、纯化

(1)菌种来源

菌源为采集自广东省广州市华南农业大学实验田水稻根围的土壤，土壤呈黄褐色。

(2)菌株的分离纯化

按上述的配方配制MSM培养基，分装至250mL三角瓶中，每个瓶中分装50mL的MSM培养基，高压灭菌锅灭菌(121℃,20min)，待其冷却后在超净工作台内加入DSF母液，使培养基中DSF的最终浓度为50μM，同时在培养基中加入土样5g。在摇床(30℃,200rpm)培养7天后，按10％的接种量转接到第二批DSF浓度为100μM的MSM培养基中。相同条件培养7天后，再按10％的接种量转接到DSF浓度为200μM的MSM培养基中，继续培养7天。以此类推，不断增加培养基中DSF的浓度。

之后采用稀释、平板涂布划线的方法进行菌株的分离纯化。取1mL终MSM培养基发酵液用无菌水将其稀释为浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的发酵液，然后分别吸取100μL各个浓度梯度的发酵液均匀涂布于LB固体平板上，30℃培养箱内培养。接着挑取平板中呈不同菌落形态的单菌落，在LB固体平板上反复划线培养纯化，直至分离出单菌落。将单菌落接种至LB液体培养基进行培养(30℃,200rpm)得到菌液。将菌液与甘油以一定比例混合后，放入-80℃保存。

(3)菌株的筛选

利用以5mM的DSF作为唯一碳源的MSM基础培养基对从土样中分离得到的菌株进行筛选。将分离纯化后的菌株进行活化后，挑取单菌落接种至DSF浓度为5mM的50mL MSM基础培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养48h后进行DSF的提取并利用HPLC测定DSF残余量，降解率(％)＝(1-A₁/A₀)×100，A₁为菌株处理后DSF残留浓度，A₀为对照处理后的DSF残留浓度。DSF降解率最高的菌株命名为QL-9a。

DSF的提取方法：每个样品取5mL至15mL离心管中，4000g离心5min，取上清液转移到50mL分液漏斗中，向分液漏斗中加入5mL乙酸乙酯，摇匀，剧烈震荡3min，静置，分层，弃去下层溶液至15mL离心管中，上层液经漏斗过滤到50mL圆底烧瓶中，漏斗铺上滤纸并装有5g无水硫酸钠。下层溶液按上述方法再萃取1次。滤液并入圆底烧瓶，50℃恒温浓缩蒸干，用色谱甲醇分3次洗涤圆底烧瓶，定容至2mL，经0.45μM有机滤膜过滤至进样瓶，使用HPLC法测定其残余量。HPLC测定DSF残余量条件：C₁₈反向色谱柱，流速为1mL/min，柱温为35℃，流动相为甲醇：水＝80：20(ν：ν)，检测波长为210nm，进样量20μL。

2、菌株的鉴定

(1)微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a的菌落形态特征

如图1，微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a菌落扁平，颜色呈淡绿色，表面光滑不透明，边缘模糊。好氧，在LB液体培养基中呈扩散性混浊。淬灭菌QL-9a氧化酶试验、接触酶试验、D-葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐利用阳性，V-P测定、明胶液化试验、甲基红试验、吲哚试验、D-果糖发酵实验、硫化氢试验阴性。

(2)微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a的16S rRNA鉴定

对微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a的16S rRNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行Blast比对(系统进化树分析图如图2)。

综合鉴定结果显示，淬灭菌QL-9a属于假单胞菌Pseudomonasmultiresinivorans，并已于2019年9月4日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60761，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2淬灭菌QL-9a生长和降解DSF关系曲线的测定

挑取菌株QL-9a单菌落接种于LB培养基中预培养至对数期，所得菌液在4000rpm的条件下离心5min后，弃去上清液，菌体用0.9％的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再以1-3％的接种量接种至50mL MSM基础培养基中，并添加DSF母液，使其最终浓度为5mM，在30℃，200rpm条件下培养，定时取样。采集不同时间点的样品，进行分光光度计测定OD₆₀₀值表示菌株QL-9a的生长情况，HPLC测定DSF的残留量表示菌株QL-9a对DSF的降解情况。

以DSF为唯一碳源时菌株QL-9a的生长与DSF降解关系图如图3所示。如图所示：DSF的降解与菌株生长呈正相关，在DSF的存在下，菌株生长没有滞留期，迅速进入生长对数期(6～12h)，此时DSF降解最快，菌株培养至24h，DSF降解完全。对照中24h内DSF的自然降解率不到2％。结果表明，淬灭菌QL-9a对DSF有显著且快速的降解作用，在防治DSF介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。

实施例3淬灭菌QL-9a对AHLs的降解活性测定

本实施例利用报告菌株CF11(Agrobacterium tumefaciens)检测淬灭菌QL-9a对AHLs信号分子的降解效果。

用LB固体培养基平板活化淬灭菌QL-9a，将平板置于30℃培养箱，培养24h。挑取单菌落接种至液体LB培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养得到菌液。取1个OD₆₀₀值的菌体与以AHLs作为唯一碳源的1mL MSM培养基均匀混合后，转移至2mL离心管中，得到待培养液，使MSM培养基中AHLs的浓度为10μmol/L。以30℃，200rpm的条件培养24h。24h后，取5μL反应混合物点至琼脂条顶端，然后在下方依次点报告菌株菌液，报告菌株按照实施例1所述的方法培养。之后，将已经点好反应混合物和报告菌株的琼脂条放置于30℃培养箱，进行避光处理，培养24h后观察实验结果。其中，琼脂条为含有40μg/mL X-gal的MM板切条所得。CK为不含淬灭菌QL-9a的空白对照。

实验结果如图4所示，CK实验组的琼脂条大约1/2变蓝，说明样品中含有AHLs；淬灭菌QL-9a实验组的琼脂条未变蓝，说明样品中不含AHLs，即AHLs已经被淬灭菌QL-9a完全降解。结果表明：菌株XN-42具有降解AHLs的活性。

实施例4淬灭菌QL-9a对白萝卜黑腐病的生防效果研究

1、淬灭菌QL-9a对白萝卜黑腐病的生防效果研究

将白萝卜肉质根用蒸馏水清洗干净，待外表干燥后进行切片。肉质根横切获取厚约0.2～0.3cm的圆片，分别放入培养皿(内置已用无菌水浸润的棉花)中。将菌株QL-9a与依赖DSF致病的致病菌黄单胞菌XC1分别划线于LB固体培养基平板，30℃过夜培养。分别挑取单菌落，接种至LB液体培养基培养过夜，将菌株QL-9a菌液与XC1菌液离心(4000rpm,10min)，弃上清，再用无菌水冲洗并重悬。将菌株QL-9a重悬液与菌株XC1重悬液混匀得到混合菌液。混合菌液、XC1、QL-9a菌液均OD₆₀₀＝0.2。分别设置QL-9a+无菌水、QL-9a+XC1、无菌水、XC1+无菌水四组实验。每个实验组取量100μL，滴在白萝卜肉质根切片上，用涂布棒将其涂抹涂匀。然后将已进行接种的白萝卜肉质根切片放入28℃恒温箱内培养。定期观察并记录发病情况。

2、菌株QL-9a对白萝卜黑腐病的生防效果如图5所示，结果表明：菌株QL-9a与野油菜黄单胞菌XC1共同接种较单独接种XC1时对白萝卜肉质根切片引起的黑腐病病害程度减轻。由实验结果可知，菌株QL-9a对野油菜黄单胞菌XC1引起的白萝卜黑腐病具有生防效果。

综上结果显示，本发明的淬灭菌QL-9a能利用DSF/AHLs作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，并对高浓度的DSF/AHLs具有稳定且高效的降解活性。淬灭菌QL-9a能够耐受浓度高达5mM的DSF/AHLs，并在24h内可以将2mM的DSF/AHLs降解完全。本发明中得到的假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans QL-9a与野油菜黄单胞菌XC1共同接种于白萝卜时，较单独接种XC1时对白萝卜引起的黑腐病病害程度减轻，说明该菌株可应用于依赖DSF/AHLs信号分子的致病菌生物防治中，可以减少化学农药的使用，减轻环境压力，具有广阔的应用前景和发展潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微生物群体感应信号淬灭菌QL-9a，其特征在于，属于假单胞菌Pseudomonasmultiresinivorans，已于2019年9月4日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60761，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans在降解群体感应信号分子AHLs、DSF和/或DSF类似物，或在制备降解AHLs、DSF和/或DSF类似物的产品中的应用。

3.假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans在防治AHLs、DSF和/或DSF类似物介导致病的病害，或在制备依赖AHLs、DSF和/或DSF类似物致病的致病菌的防治制剂方面的应用。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述假单胞菌Pseudomonasmultiresinivorans为权利要求1所述淬灭菌QL-9a。

5.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述DSF类似物为包括顺-2-十二碳烯酸、(2Z，3Z)-11-甲基-2,5-二烯-12-烷酸、顺-11-甲基-2-十二碳烯酸、顺-2-葵烯酸、12-甲基-十四烷酸在内的DSF家族群体感应信号分子。

6.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述AHLs包括N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代辛酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代癸酰)-L-高丝氨酸内酯、异戊酰基-高丝氨酸内酯、羧化酰基-高丝氨酸内酯(carboxyl-AHLs)、芳基-高丝氨酸内酯或香豆酰基-高丝氨酸内酯。

7.一种防治依赖DSF或AHLs致病的致病菌病害的方法，其特征在于，用假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans的菌液处理植物。

8.一种可降解群体感应信号分子DSF和/或AHLs的降解菌剂，其特征在于，含有假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans或其菌液。

9.一种依赖DSF和/或AHLs致病的病原菌的生防制剂，其特征在于，含有假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans或其菌液。

10.根据权利要求7所述方法、权利要求8所述降解菌剂或权利要求9所述生防制剂，其特征在于，所述假单胞菌Pseudomonas multiresinivorans为权利要求1所述淬灭菌QL-9a。

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