CN107446915B - 磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用 - Google Patents

磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用，属于无机材料和分析技术领域；本发明首先通过磁性氧化石墨烯GO‑Fe3O4和6‑arm‑PEG‑NH2制备了含有六臂聚乙二醇氨基（6‑arm‑PEG‑NH2）的磁性聚合物微球，并固定化辣根过氧化物酶，并将该固定化酶用于降解污染物苯酚；该材料合成过程设计合理，该载体材料耦合了氧化石墨烯的类酶催化活性以及多臂聚合物6‑arm‑PEG‑NH2表面高密度氨基官能团于一体，有效的提高固定化酶的活性和重复利用能力；并且，本发明制备的固定化酶对对苯酚的降解速率明显高于游离酶和载体材料。

Description

磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于无机材料和分析技术领域，涉及一种磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用。
背景技术
辣根过氧化物酶（HRP）是一种很有前途的生物催化剂，据报道，它可用于溶液中酚类化合物和芳香胺的去除以及纺织废水的脱色。在过氧化氢存在下HRP催化酚类的氧化生成苯氧基。生成的自由基形成不溶性聚合物，可以通过简单的过滤或倾析进行分离。这种方法的显着缺点之一是由于聚合会导致酶失活，使参与反应的辣根过氧化物酶的催化寿命相对较短。为了解决这个问题，陈等人（Cheng J, Ming Y S, Zuo P. Horseradishperoxidase immobilized on aluminium-pillared inter-layered clay for thecatalytic oxidation of phenolic wastewater. [J]. Water Research, 2006, 40(2):283-290.）通过将辣根过氧化物酶固定化，在较宽的pH值范围内（4.5到9.3），苯酚去除效果也很好，并可以将产物沉淀或转化为其他产品。Entezari等人（Entezari M H, Pétrier C.A combination of ultrasound and oxidative enzyme:sono-biodegradation ofsubstituted phenols. [J]. 2003, 10(4-5):241-246.）通过超声辐照增强苯酚酶促氧化反应效应，且超声强化酶促氧化相结合的方法比单独的超声降解或酶处理苯酚及其卤代化合物更有效。目前已见报道的关于增强酶促效应的类酶催化剂物质有表面分子印迹纳米TiO2，Fe3O4磁性纳米粒子等。
有人报道氧化石墨烯（GO）具有过氧化物酶类酶活性，在过氧化氢的存在下，可以催化过氧化物酶底物3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺的氧化。GO是厚度只有一个原子大小的二维纳米材料。丰富的表面基团和比较大的比表面积，独特的双面结构，表面易于功能化，可以作为载荷生物大分子的有效载体。由于其表面高导电性，GO固定化酶的电化学应用方面已有报道。此外，由于GO具有较高的比表面积，使其可以在非均相反应中具有巨大的潜在应用前景。同时，Fe3O4磁性纳米粒子（Fe3O4 MNP）也可激活过氧化氢，导致苯酚等有机污染物在H2O2存在下氧化降解，同样具有过氧化物类酶活性。
由于GO具有较大的比表面积和丰富的官能团，是固定化酶的理想的材料，因此设计一个新型催化体系，通过在GO上接枝6臂聚合物（6-arm- PEG-NH2）形成酰胺。通过戊二醛将辣根过氧化物酶与6-arm-PEG-NH2结合实现酶的固定化。亲水性PEG和剩余的亲水基团可以帮助酶保留更多的必需的水分子，防止聚合沉淀导致的失活，保持其活性构象。同时在GO上附载四氧化三铁粒子，通过施加适当的磁场有助于回收该固定化酶。更重要的是，GO和四氧化三铁粒子都具有过氧化物类酶效应，可以成倍增强降解苯酚效果。
发明内容
本发明的目的在于克服游离辣根过氧化物酶存在的缺陷，从而合成一种磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供一种新型的磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，所述材料呈现近乎透明的薄膜状，具有超顺磁性利于回收；其表面有丰富的氨基。
本发明提供一种新型的磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶，所述的固定化酶由所述的磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2固定化制备而成，所述固定化辣根过氧化物酶的最适温度为55℃，最适pH为7.0。
本发明还提供一种新型磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶的制备方法，具体步骤如下：
S1. 磁性复合材料的制备：
（1）合成表面羧基化的氧化石墨烯GO-COOH：
氧化石墨烯（GO）采用Hummers法合成：首先，将石墨粉，硝酸钠加入到23mL 12 molL-1 浓硫酸溶液中冰浴搅拌15分钟。缓慢加入一定量的高锰酸钾后转移至40℃水浴中搅拌90分钟。向反应体系中加入一定量去离子水稀释继续搅拌10分钟。加入过氧化氢，体系成为金黄色溶液，静置一天，倒出上清，抽滤得到沉淀物，沉淀用5%盐酸反复洗涤至用BaCl2检测上清无沉淀，之后用去离子水洗涤，离心分离，直到上清液的pH值为7，停止洗涤。倒出沉淀放置在比色皿中，放在真空干燥箱中干燥至恒重。其次，取1.0 g上述产物，加入一定量的NaOH，加入200 mL水，超声2小时。加入一定量的氯乙酸超声2小时，离心水洗至中性，倒出放入烘箱干燥至恒重，得到表面含有丰富羧基的氧化石墨烯GO-COOH。
其中，所述石墨粉为0.3-0.7 g；硝酸钠为 0.3-0.7 g；高锰酸钾为2-6 g；
所述去离子水为25-75 mL；过氧化氢为4-8 mL;
所述NaoH为0.2-0.6 g；氯乙酸为0.3-0.7 g。
（2）合成磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4：
用共沉淀法在GO-COOH表面合成Fe3O4。将 GO-COOH分散在150 mL水中，加入0.466g六水合三氯化铁和0.48g七水合硫酸亚铁，超声分散10分钟，增加温度至60℃，加入一定量3.5 mol L-1 氨水溶液反应60分钟，用磁铁分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重，得到磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4。
其中，所述GO-COOH为0.1-0.3 g；所述氨水为10-30 mL。
（3）合成磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2：
将上述产物磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4加入水中溶解，再加入一定体积浓度的6-arm-PEG-NH2水溶液超声分散，先加入EDC室温下搅拌一定时间，再加入EDC搅拌后，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性；放入烘箱干燥至恒重。
其中，所述磁性氧化石墨烯与6-arm-PEG-NH2水溶液用量比为200 mg：10-30 mL；所述6-arm-PEG-NH2水溶液的浓度为5 mg mL-1；
所述超声时间为1小时；
所述第一次加入EDC的量为40mg，搅拌时间为0.5-4 h；第二次加入EDC的量为52mg，搅拌12小时。
S2. 固定化辣根过氧化物酶的制备
（1）溶液配制
磷酸缓冲溶液的配制：用0.2 M Na2HPO4溶液调节0.2 M 100 mL NaH2PO4 至pH为7.0。
4-AAP溶液：取810 mg苯酚溶于40 mL水中，加入25 mg 4-氨基安替吡啉（4-AAP），用二次蒸馏水定容于50 mL容量瓶。
过氧化氢溶液：取1 mL过氧化氢加入100 mL容量瓶，用去离子水定容。取1 mL上述溶液于50 mL容量瓶，用缓冲溶液定容。
（2） 辣根过氧化物酶固定化过程：
取载体材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，加入戊二醛溶液中进行活化；磁铁回收载体材料，配置成浓度为4-10mg/L的悬浮液；将辣根过氧化物酶溶液与活化过的载体材料悬浮液混合，在20-50℃下孵育30-240min，用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的辣根过氧化物酶。采用考马斯亮蓝法利用紫外/可见分光光度计检测吸附液中剩余辣根过氧化物酶浓度，计算固载量。
所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.05-0.25mol/L，优选0.1 mol/L；所述活化的条件为50℃下活化6小时。
其中所述的载体材料悬浮液的浓度为6mg/L；所述孵育为在35℃下孵育120min。
本发明另一目的是将上述合成的磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶用于对污染物苯酚的降解。
与现有技术相比较，本发明具有如下优点:
（1）本发明首次合成了磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，并用于辣根过氧化物酶的固定化。该载体材料耦合了氧化石墨烯的类酶催化活性以及多臂聚合物6-arm-PEG-NH2表面高密度氨基官能团于一体，有效的提高固定化酶的活性和重复利用能力。
（2）本发明合成的磁性氧化石墨烯复合材料通过透射电镜，红外，XRD，磁滞回线，XPS等数据对其形貌结构进行表征。合成的材料结果符合实验最初的设计过程，所得材料呈现近乎透明的薄膜状，具有超顺磁性利于回收，饱和磁化强度为30.80 emu g-1。其表面有丰富的氨基使其成为很好的酶的固定化载体材料。
（3） 本发明所合成的磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2在用于固定化辣根过氧化物酶时，发现当戊二醛浓度0.10 mol L-1，固定化时间120分钟、固定化温度35℃和载体材料用量6 mg L-1时，固定化效果最好。7次试验得到平均酶固载量约为186.34mg g-1。
（3）测定了固定化辣根过氧化物酶的性能。固定化辣根过氧化物酶的最适催化温度55℃，最适催化pH值为7.0。贮存60天后，固定化辣根过氧化物酶的相对酶活为71.05%，远远高于游离酶。8次催化反应后，剩余相对酶活为68.14%。相比游离酶，固定化辣根过氧化物酶对催化环境的条件耐受性略有增强。温度稳定性，贮存稳定性和操作稳定性都有所提升。
（4）利用固定化辣根过氧化物酶进行了苯酚降解实验，首先对降解过程的条件进行优化：在苯酚浓度100 mg L-1、过氧化氢与苯酚摩尔比值1.0、固定化酶用量0.20 mg L-1、反应温度20℃时，固定化辣根过氧化物酶催化降解苯酚的效果最好。在催化苯酚降解过程中，辣根过氧化物酶固定化后降解速率有了很大的提升。其次，由于氧化石墨烯材料的类酶催化性能，固定化辣根过氧化物酶的催化效果远远高于游离酶和载体材料催化的效果。固定化辣根过氧化物酶在降解苯酚过程中，既有酶催化，又有载体材料类酶催化效果，且两种效果协同作用，降解苯酚效果更为明显。
附图说明
附图1为GO-COOH（a），GO-Fe3O4（b）和GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2（c）的透射电子显微镜图；
图2为GO-COOH（a），GO-Fe3O4（b）和GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2（c）
的XRD图；
图3为GO-COOH（a），GO-Fe3O4（b）和GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2（c）
的红外光谱图；
图4为GO-Fe3O4（a）和GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2（b）的磁滞回线图；
图5为戊二醛浓度对辣根过氧化物酶固载量的影响图；
图6为载体材料用量对辣根过氧化物酶固载量的影响图；
图7为温度对辣根过氧化物酶固载量的影响图；
图8为时间对辣根过氧化物酶固载量的影响图；
图9为游离酶和固定化酶的最佳催化pH值考察结果图；
图10为游离酶和固定化酶的最佳催化温度考察结果图；
图11为游离辣根过氧化物酶和固定化辣根过氧化物酶的温度稳定性考察结果图；
图12为游离辣根过氧化物酶和固定化辣根过氧化物酶的贮藏稳定性考察结果图；
图13为固定化辣根过氧化物酶的操作稳定性考察结果图；
图14为各种反应参数对苯酚降解过程的影响结果，图中（a）苯酚浓度，（b）H2O2/苯酚摩尔比，（c）固定化辣根过氧化物酶浓度和（d）温度。
图15为固定化酶对于苯酚降解率的影响结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：新型磁性氧化石墨烯复合材料的制备
（1）合成表面羧基化的氧化石墨烯GO-COOH
氧化石墨烯（GO）采用Hummers法合成。首先，取0.3 g石墨粉，0.7 g硝酸钠于23 mL12 mol L-1 浓硫酸溶液冰浴搅拌15分钟。缓慢加入2.0 g高锰酸钾后转移至40℃水浴中搅拌90分钟。向反应体系中加入去离子水25 mL稀释继续搅拌10分钟。加4 mL过氧化氢，体系成为金黄色溶液，静置24小时，倒出上清，抽滤得到沉淀物，沉淀用5%盐酸反复洗涤至用BaCl2检测上清无沉淀，之后用去离子水洗涤，离心分离，直到上清液的pH值为7，停止洗涤。倒出沉淀放置在比色皿中，放在真空干燥箱中干燥至恒重。其次，取1.0 g上述产物，加入0.2 g NaOH，加入200 mL水，超声2小时。加入0.3 g氯乙酸超声2小时，离心水洗至中性，倒出放入烘箱干燥至恒重，得到表面含有丰富羧基的氧化石墨烯GO-COOH。
（2）合成磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4
用共沉淀法在GO-COOH表面合成Fe3O4。将0.1 g GO-COOH分散在100~150 mL水中，加入0.466 g六水合三氯化铁和0.48 g七水合硫酸亚铁，超声分散10分钟，增加温度至60℃，加入20 ml 3.5 mol L-1 氨水溶液反应60分钟，用磁铁分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重，得到磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4。
（3）合成磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2
200 mg上述产物GO-Fe3O4加入200 mL水，加入10 ml浓度为5 mg mL-1的6-arm-PEG-NH2超声1小时，加入40 mg EDC室温下搅拌0.5小时，再加入52 mg EDC搅拌12小时，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重。
实施例2：新型磁性氧化石墨烯复合材料的制备
（1）合成表面羧基化的氧化石墨烯GO-COOH
氧化石墨烯（GO）采用Hummers法合成。首先，取0.7 g石墨粉，0.3 g硝酸钠于23 ml12 mol L-1 浓硫酸溶液冰浴搅拌15分钟。缓慢加入6.0 g高锰酸钾后转移至40℃水浴中搅拌90分钟。向反应体系中加入去离子水75 ml稀释继续搅拌10分钟。加8 ml过氧化氢，体系成为金黄色溶液，静置24小时，倒出上清，抽滤得到沉淀物，沉淀用5%盐酸反复洗涤至用BaCl2检测上清无沉淀，之后用去离子水洗涤，离心分离，直到上清液的pH值为7，停止洗涤。倒出沉淀放置在比色皿中，放在真空干燥箱中干燥至恒重。其次，取1.0 g上述产物，加入0.6 g NaOH，加入200 ml水，超声2小时。加入0.7 g氯乙酸超声2小时，离心水洗至中性，倒出放入烘箱干燥至恒重，得到表面含有丰富羧基的氧化石墨烯GO-COOH。
（2）合成磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4
用共沉淀法在GO-COOH表面合成Fe3O4。将0.3 g GO-COOH分散在100~150 ml水中，加入0.466 g六水合三氯化铁和0.48 g七水合硫酸亚铁，超声分散10分钟，增加温度至60℃，加入30 ml 3.5 mol L-1 氨水溶液反应60分钟，用磁铁分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重，得到磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4。
（3）合成磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2
200 mg上述产物GO-Fe3O4加入200 ml水，加入30 ml浓度为5 mg ml-1的6-arm-PEG-NH2超声1小时，加入40 mg EDC室温下搅拌4小时，再加入52 mg EDC搅拌12小时，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重。
实施例3：新型磁性氧化石墨烯复合材料的制备
（1）合成表面羧基化的氧化石墨烯GO-COOH
氧化石墨烯（GO）采用Hummers法合成。首先，取0.5 g石墨粉，0.5 g硝酸钠于23 ml12 mol L-1 浓硫酸溶液冰浴搅拌15分钟。缓慢加入4.0 g高锰酸钾后转移至40℃水浴中搅拌90分钟。向反应体系中加入去离子水50 ml稀释继续搅拌10分钟。加6 ml过氧化氢，体系成为金黄色溶液，静置24小时，倒出上清，抽滤得到沉淀物，沉淀用5%盐酸反复洗涤至用BaCl2检测上清无沉淀，之后用去离子水洗涤，离心分离，直到上清液的pH值为7，停止洗涤。倒出沉淀放置在比色皿中，放在真空干燥箱中干燥至恒重。其次，取1.0 g上述产物，加入0.4 g NaOH，加入200 ml水，超声2小时。加入0.5~0.6 g氯乙酸超声2小时，离心水洗至中性，倒出放入烘箱干燥至恒重，得到表面含有丰富羧基的氧化石墨烯GO-COOH。
（2）合成磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4
用共沉淀法[149]在GO-COOH表面合成Fe3O4。将0.2g GO-COOH分散在100~150 ml水中，加入0.466 g六水合三氯化铁和0.48 g七水合硫酸亚铁，超声分散10分钟，增加温度至60℃，加入20 ml 3.5 mol L-1 氨水溶液反应60分钟，用磁铁分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重，得到磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4。
（3）合成磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2
200 mg上述产物GO-Fe3O4加入200 ml水，加入20 ml浓度为5 mg ml-1的6-arm-PEG-NH2超声1小时，加入40 mg EDC室温下搅拌2小时，再加入52 mg EDC搅拌12小时，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性。放入烘箱干燥至恒重。
从图1中发现GO-COOH表面很光滑，厚度很小，呈现近乎透明的薄膜状。附载Fe3O4后的GO-Fe3O4的图1（b）可以看出，四氧化三铁在氧化石墨烯表面的分散是比较均匀的。接枝聚合物后（图1 c），GO-Fe3O4-6- arm-PEG-NH2表面总体颜色相比GO-Fe3O4颜色较深，而且还有很多颜色更深的聚集物，说明6-arm-PEG-NH2成功的接枝到了磁性氧化石墨烯的表面。
从图2中可以看出10度左右的峰值是氧化石墨烯的晶型值，图2（b），（c）中可以看出六个峰值30.1，35.5，43.1，53.4，57.0，62.6分别对应着JCSD数据卡（74-748）上Fe3O4的晶型值（220） （311） （400） （422） （511） （440）。这说明接枝6-arm-PEG-NH2聚合物层后的Fe3O4晶型没有明显变化且保持了较大的完整性。
图3中1732cm-1处红外吸收峰是表面羧基C=O振动引起的，1623 cm-1为GO骨架振动峰，3415 cm-1、1404 cm-1为分别O-H伸缩、弯曲振动峰。COOH变为-COO-时，C=O峰由1732 cm-1变为1575 cm-1。573 cm-1为来自于四氧化三铁的Fe-O键吸收峰。1083 cm-1、1579 cm-1、2879cm-1、分别为6-arm-PEG-NH2中C-O键、C=O键和C-H键的振动吸收峰值。以上表征证明本发明成功合成材料。
图4中GO-Fe3O4的饱和磁化强度（Ms）为39.61 emu g-1，GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2的最终饱和磁化强度为30.80 emu g-1。可以看出，样品GO-Fe3O4和GO-Fe3O4-6 -arm-PEG-NH2在常温下没有明显的剩磁和矫顽力，具有超顺磁性能。饱和磁化强度值较大，足以使他们从溶液中快速有效地分离出来，实现的材料的重复利用。
实施例4：固定化辣根过氧化物酶的制备
（1）溶液配制
磷酸缓冲溶液的配制：用0.2 M Na2HPO4溶液调节0.2 M 100 mL NaH2PO4 至pH为7.0。
4-AAP溶液：取810 mg苯酚溶于40 mL水中，加入25 mg 4-氨基安替吡啉（4-AAP），用二次蒸馏水定容于50 mL容量瓶。
过氧化氢溶液：取1 mL过氧化氢加入100 mL容量瓶，用去离子水定容。取1 mL上述溶液于50 mL容量瓶，用缓冲溶液定容。
（2）辣根过氧化物酶固定化过程
取载体材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，加入戊二醛溶液中进行活化；磁铁回收载体材料，配置成浓度为4-10mg/L的悬浮液；将辣根过氧化物酶溶液与活化过的载体材料悬浮液混合，在20-50℃下孵育30-240min，用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未固定的辣根过氧化物酶。采用考马斯亮蓝法利用紫外/可见分光光度计检测吸附液中剩余辣根过氧化物酶浓度，计算固载量。
所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.05-0.25mol/L，优选0.1 mol/L；所述活化的条件为50℃下活化6小时。
其中所述的载体材料悬浮液的浓度为6mg/L；所述孵育为在35℃下孵育120min。
辣根过氧化物酶的固载量（Q）可用以下公式进行计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式中，M 1 表示加入酶液中蛋白含量（mg），M 2 表示剩余上清中蛋白含量（mg），m 表示载体材料的质量（g）。
实施例5：固定化辣根过氧化物酶制备过程条件优化
（1）戊二醛浓度对固载量的影响
分别用0~0.30 mol L-1戊二醛溶液活化载体材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，将一定量辣根过氧化物酶与该活化过的载体材料的悬浮液混合，加入一定量的缓冲溶液，保证溶液体积同为1 mL。放在30℃恒温振荡箱内培养4个小时，用磁铁分离固定化酶，测量固定化前后上清溶液中辣根过氧化物酶的变化，得到戊二醛浓度对固载量的影响。
图5中可以看出，不添加戊二醛时，辣根过氧化物酶的固载量为13.15 mg g-1，说明载体材料和酶有很微弱的物理吸附作用。为了使固定化效果更牢固，可以通过添加交联剂来增强二者之间的结合力。当添加戊二醛浓度从0.05 mol L-1升高至0.10 mol L-1时，辣根过氧化物酶的固载量从95.17 mg g-1增长到143.13 mg g-1，之后随着戊二醛浓度的升高，固载量几乎无变化。戊二醛浓度的升高，加剧了酶分子之间自交联的现象，使酶分子没有更多的结合在GO-Fe3O4-6-arm -PEG-NH2上，造成固载量的微微下降。所以活化载体材料所采用的戊二醛最佳浓度优选为0.10 mol L-1。
（2）载体材料用量对固载量的影响
用戊二醛活化载体材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，用缓冲溶液配置成不同浓度（4~10 mg L-1）的载体材料悬浮液。然后分别与一定量的辣根过氧化物酶混合，加入缓冲溶液，保证体积相同为1 mL。在30℃温度下孵育4小时，用磁铁分离固定化酶，测试固定化前后辣根过氧化物酶的含量，得到载体材料用量对辣根过氧化物酶的固载量的影响。
图6中所示是载体材料用量不同对固定化辣根过氧化物酶固载量的影响。随着载体材料用量相对增加，固定化辣根过氧化物酶固载量逐渐升高，当载体材料量为6 mg L-1时，固定化辣根过氧化物酶固载量达到187.13 mg g-1，之后再增加载体材料量，固定化辣根过氧化物酶的固载量逐渐下降。这个能是因为当载体材料量为6 mg L-1时，辣根过氧化物酶几乎最大化的参与了固定，即便再增加载体材料，溶液中能参与固定的游离辣根过氧化物酶也逐渐减少，所以固定化辣根过氧化物酶固载量随着载体材料的增加而减少。为了有效的利用载体材料，使单位质量的载体材料的固载量最大，优选参与固定化实验的载体材料量为6 mg L-1。
（3）温度对固载量的影响
为了测定环境温度对辣根过氧化物酶固定化过程的影响，将固定化载体材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，辣根过氧化物酶混合后加入一定量的缓冲溶液使溶液总体积为1mL，然后分别放置在20、25、30、35、40、45℃恒温振荡箱内孵化4小时，用磁铁分离载体材料，测定固定化前后溶液中辣根过氧化物酶含量，得到温度对固载量的影响，如图7。
由图可以看出，随着固定化环境温度的升高，固载量相应增加。当温度到达35℃时固载量达到最高值189.99 mg g-1，当温度超过35℃后继续升高，固载量稍有下降，由此可以得出最优固定化环境温度为35℃。
（4）时间对固载量的影响
按照上面的章节中的最优条件，配置一系列相同的辣根过氧化物酶溶液和活化后载体材料的缓冲溶液，控制总体积为1 mL。孵育时间为4小时，每30分钟取出一组用磁铁分离载体材料，然后取上清液测试残留辣根过氧化物酶的含量。得到固定化时间对辣根过氧化物酶的固载量的影响。
从图8中可以看出，随着时间的推移，辣根过氧化物酶在载体材料上的固载量也越来越高，固载量的增长速度越来越大。90分钟后，增长明显变缓慢，120分钟后达到固载量180.47 mg g-1。超过120分钟后，固载量虽有增加，但是增加不太明显。由此可以看出，固定化反应在120分钟时几乎达到饱和。因此，在后面的研究中，固定化酶反应过程中的时间控制为120分钟。
综合以上，当戊二醛溶液浓度为0.1 mol L-1，载体材料使用量为6 mg L-1，温度为30℃条件下孵育120分钟，得到7次固定化辣根过氧化物酶的固载量的平均值为186.34 mgg-1，（RSD=0.879%）由于氧化石墨烯的延展性，使固定化酶的固载量在球形的基础上进一步增大。
实施例6：固定化辣根过氧化物酶的酶学性能
（1）最佳催化pH
用pH值分别为5.5~8.5的缓冲溶液配制一系列固定化酶分散液、游离酶溶液和过氧化氢溶液。采用Worthington法将1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mL过氧化氢溶液移入比色皿中，调温至25℃。加0.1 mL一定浓度的相应pH的酶溶液，混合计时，测量不同pH环境下的酶活变化。以测量的最高酶活为基准得到各个pH值下的相对酶活，如图9。
图中可以看出，固定化辣根过氧化物酶和游离辣根过氧化物酶在pH值为7.0时的催化能力都达到最高。当pH变高或变低时，相对酶活都有所降低，但是从图中可以看出，固定化辣根过氧化物酶的相对酶活的降低相对略低于游离辣根过氧化物酶，可见经过固定后的辣根过氧化物酶对环境中pH值的耐受性稍微有提高。
（2）最佳催化温度
为了测试辣根过氧化物酶固定化前后的最佳催化温度，将1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mL pH值为7.0的过氧化氢溶液移入比色皿中，放入可以设置温度的样品池中。加0.1mL提前在相应温度保温的pH值为7.0的酶溶液，混合计时，测量不同温度环境下的酶活变化。以测量的最高酶活为基准得到各个温度下的相对酶活。如图10，本实验测量了温度在25℃~70℃条件下的酶活变化。
从图中可以看出，随着测试温度的升高，固定化辣根过氧化物酶和游离辣根过氧化物酶的相对酶活都在升高，且在温度55℃时达到最大值。这个阶段的变化可能是因为随着温度的升高，分子动能增大，辣根过氧化物酶与底物苯酚的碰撞接触更频繁，催化反应进行的更剧烈。随着温度的继续上升，相对酶活开始有所下降，这可能是因为，温度过高后，组成辣根过氧化物酶的多肽在高温下变形，部分发生黏连，也有可能遮挡酶分子的催化活性位点。从图中也可以看出，温度对固定化辣根过氧化物酶活性的影响小于游离辣根过氧化物酶，体现了固定化辣根过氧化物酶的优势。
（3）米氏常数的测定
米氏常数（Km）是酶的特征常数，Km值低，表示酶与底物亲和力强。本实验测定了底物为过氧化氢时，辣根过氧化物酶固定化前后最适反应条件下米氏常数的变化，测得固定化酶的米氏常数为0.6016 mmol L-1。固定化酶的米氏常数相比游离酶（1.4525 mmol L-1）有所减小，固定化游离酶与底物的亲和性更好。
（4）温度稳定性
为了考察固定化辣根过氧化物酶对温度的耐受性，将6组相同的游离辣根过氧化物酶和6组固定化辣根过氧化物酶分别放置在温度为30、40、50、60、70、80℃的环境下1个小时后检测其酶活，以每种酶的酶活最高值定义酶相对酶活。
由图11可知，辣根过氧化物酶在温度越高的环境下，失活越严重，证明了上节中的观点。可能由于温度的升高，组成辣根过氧化物酶的多肽变形失活所致。但是可以明显看出，经过固定的辣根过氧化物酶的温度稳定性有了显著的提高。当环境温度为80℃时，游离辣根过氧化物酶的酶活为72%左右，而固定化辣根过氧化物酶的酶活远远高于辣根过氧化物酶为85%左右。
（5）贮藏稳定性
将一系列相同条件的固定化辣根过氧化物酶和游离辣根过氧化物酶分别放置在4℃冰箱内恒温保存，每隔几天取出来，在最适温度、pH条件下测试其酶活。得到辣根过氧化物酶固定化前后的贮藏稳定性，得到图12。
有图可得，30天过后，固定化辣根过氧化物酶剩余酶活为88.39 %，游离辣根过氧化物酶的酶活剩余最初酶活的52.04 %。60天后，固定化辣根过氧化物酶的酶活剩余最初酶活的71.05 %，游离辣根过氧化物酶只剩余最初酶活的25.06 %。随着时间的推移，辣根过氧化物酶的酶活损失越来越大，游离辣根过氧化物酶的酶活损失比较严重，通过固定化，辣根过氧化物酶的贮存稳定性有了很大的提高。
（6）操作稳定性
为了测试固定化辣根过氧化物酶的操作稳定性，将1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mLpH值为7.0的过氧化氢溶液移入比色皿中，放入设置温度为55℃样品池中。加0.1 mL提前在55℃保温的pH值为7.0的固定化辣根过氧化物酶溶液，混合计时，测量酶活，即为第一次的酶活。用磁铁分离固定化辣根过氧化物酶，用缓冲溶液冲洗两遍，加入pH值为7.0的缓冲溶液0.1 ml再次与1.4 mL 4-AAP溶液和1.5 mL pH值为7.0的过氧化氢溶液混合，测量酶活，得到第二次酶活值，以此类推，得到图13。
由图可知，固定化辣根过氧化物酶的催化反应8次后，剩余相对酶活为68.14%，猜测酶活降低的主要原因可能是每次操作后用缓冲溶液冲洗，导致一些固定化不牢固的酶相应减少，由于反复的催化反应，长时间在55℃环境下贮存，辣根过氧化物酶也有一部分变形变性，会造成一些酶活的损失。总而言之，固定化辣根过氧化物酶具有较高的操作稳定性。
实施例7：固定化辣根过氧化物酶降解苯酚影响条件的优化
本实施例考察了降解过程有主要影响的反应参数，包括：苯酚浓度、过氧化氢浓度、固定化酶用量、反应时间等，如图14。
(1)苯酚浓度
取一定量浓度分别为25 mg L-1~300 mg L-1的苯酚溶液中加入一定量固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG），控制反应总体积为5 ml，从加入定量H2O2开始计时，放入恒温振荡箱内直至设定的时间结束。由图14（a）可以看出，当苯酚浓度较低时，苯酚降解率随着苯酚浓度的升高而急速升高。当苯酚浓度为100 mg L-1时降解率达到最大值41.26%。继续增加苯酚浓度，降解率缓慢逐渐减小。这是由于催化反应最初随着底物浓度的增加而进行的速度加快，当底物浓度增加到一定值，产物的增加会抑制催化反应的继续进行，导致底物降解率的缓慢降低。综合考虑，在之后的降解反应过程中，将100 mg L-1定为苯酚浓度使用浓度。
（2）H2O2用量
取一定量浓度100 mg L-1的苯酚溶液中加入一定量固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG），加入同pH缓冲溶液，控制反应总体积为5 ml。从加入H2O2开始计时，H2O2与苯酚的质量比分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，放入恒温振荡箱内直至设定的时间结束。由图14（b）中可以看出，当H2O2与苯酚比值小于1时，随着H2O2浓度的增加，苯酚降解率呈线性增加，当比值为1时，苯酚降解率达到最大值63.13%。随后降解率随着H2O2含量的增加而缓慢减少。造成这种趋势的原因可能是，过多的过氧化氢会使得辣根过氧化物酶活性中心的铁离子过度氧化而不能传递电子，从而无法进行催化反应。综合考虑，将过氧化氢与苯酚摩尔比值确定为1.0。
（3）固定化酶用量
取一定量浓度100 mg L-1的苯酚溶液中分别加入不同量的固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG），适当加入缓冲溶液，控制反应总体积为5 ml。从加入H2O2开始计时，放入恒温振荡箱内直至设定的时间结束。由图14（c）可知，苯酚降解率随着固定化辣根过氧化物酶用量的增加而增加。说明苯酚的降解率对固定化辣根过氧化物酶具有一定的依赖性。当固定化辣根过氧化物酶的量超过至0.20 mg L-1时，苯酚降解率的增加不再明显。综合上述讨论，确定固定化辣根过氧化物酶的用量为0.20 mg L-1。
（4）降解温度
取一定量浓度100 mg L-1的苯酚溶液中加入一定量固定化辣根过氧化物酶和反应助剂（PEG），添加适量缓冲溶液使反应总体积为5 ml。放入响应不同温度恒温振荡箱内，从加入H2O2开始计时，取出来上清测量苯酚浓度。从图14（d）中可以看出，温度对催化过程的影响不大。催化反应温度增加，降解率呈微微下降的趋势，综合反应能耗，确定降解反应为20℃。
实施例7：固定化辣根过氧化物酶降解苯酚效果
取一定量浓度为100 mg L-1的苯酚溶液中加入一定量反应助剂（PEG），分别加入固定化辣根过氧化物酶或者游离辣根过氧化物酶和载体材料溶液，控制反应总体积为5 ml，放入50℃恒温振荡箱内，从加入与苯酚含量比为1的H2O2溶液开始计时，反应60分钟结束，隔段时间取出来上清测量。
由图15中可以看出，同样的条件下，载体材料、游离辣根过氧化物酶、固定化辣根过氧化物酶对苯酚均有降解效应，催化降解10分钟时，固定化辣根过氧化物酶的苯酚降解率达到94.4%，而游离酶和载体材料分别为46.4%和13.6%。固定化酶的催化降解速率相对于游离酶和载体材料具有明显的提升。此外，载体材料由于其类酶催化性能，催化降解60分钟后苯酚降解率达到15.7%。但是其效果缓慢，远远不如游离辣根过氧化物酶（70.4%）和固定化辣根过氧化物酶（98.0%）。固定化辣根过氧化物酶中的载体材料和酶分子具有协同催化效应，同等条件下固定化酶的苯酚降解率显著优于固载材料和游离酶的苯酚降解率的总和。这表明，固定化辣根过氧化物酶在降解苯酚过程中，既有酶催化，又有载体材料类酶催化效果，且两种效果协同作用，效果更为明显。

Claims (10)

1.一种磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，所述方法操作如下：
首先取载体材料磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2，加入戊二醛溶液中进行活化；再用磁铁回收载体材料，配置成浓度为4-10mg/L的悬浮液；将辣根过氧化物酶溶液与活化过的载体材料悬浮液混合，在20-50℃下孵育30-240min，用磁铁分离固定化后的载体材料，保留上清溶液待测；用缓冲溶液冲洗材料以去除未固定的辣根过氧化物酶，其中所述磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2呈现近乎透明的薄膜状，具有超顺磁性利于回收；其表面有丰富的氨基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.05-0.25mol/L，所述活化的条件为50℃下活化6小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体材料与戊二醛溶液的用量比例为1mg:1mL；其中戊二醛溶液浓度为0.1 mol/L，所述活化的条件为50℃下活化6小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述的载体材料悬浮液的浓度为6mg/L；所述孵育为在35℃下孵育120min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2的制备方法如下：
（1）合成表面羧基化的氧化石墨烯GO-COOH；
（2）合成磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4；
（3）合成磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2：
将上述产物磁性氧化石墨烯GO-Fe3O4加入水中溶解，再加入6-arm-PEG-NH2水溶液超声分散，先加入EDC室温下搅拌0.5-4小时，再加入EDC搅拌后，磁性分离产物，用去离子水洗涤至中性；放入烘箱干燥至恒重。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的磁性氧化石墨烯与6-arm-PEG-NH2水溶液用量比为200 mg：10-30 mL；所述6-arm-PEG-NH2水溶液的浓度为5 mg/mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的超声时间为1小时。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一次加入EDC的量为40mg，搅拌时间为0.5-4 h；第二次加入EDC的量为52 mg，搅拌12小时。
9.一种磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶，其特征在于，所述的固定化辣根过氧化物酶由所述的由磁性氧化石墨烯复合材料GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2固定化制备而成，所述固定化辣根过氧化物酶的最适温度为55℃，最适pH为7.0。
10.权利要求9所述的一种磁性氧化石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶用于对污染物苯酚的降解。
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