CN109468354A - 一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法 - Google Patents

一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法，包括如下步骤：(1)从需钠弧菌HJPHYXJ‑1获得琼胶酶粉末；(2)固定化载体的制备；(3)固定化酶的制备；(4)系列新琼寡糖的制备。本发明采用固定化酶技术制备固定化琼胶酶并将其应用于新琼寡糖的制备，通过简单的磁分离，可实现琼胶酶的重复利用，同时也简化了后处理步骤，从而大大降低新琼寡糖的生产成本；除此之外，本发明所用的固定化载体制备简单，固定化方法简单有效，为今后实现产业化规模生产新琼寡糖提供理论和技术支持。

Description

一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法
技术领域
本发明属于新琼寡糖制备技术领域，具体涉及一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法。
背景技术
琼脂糖是一种主要来源于江蓠、石花菜、紫菜等红藻细胞壁，由α(1→3)糖苷键连结的β-D-半乳呋喃糖和β(1→4)糖苷键连结的3，6-内醚-α-L-半乳呋喃糖交替连接而成的线性中性多糖。新琼寡糖是由琼脂糖经水解所得到的由琼二糖为重复单元连接而成的聚合度为2-10的低聚糖，以D-半乳糖为还原性末端。新琼寡糖具有多种生理活性，包括降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、益生元、美白护肤等。目前，有关新琼寡糖生理活性的研究大多集中于新琼寡糖混合物，也有少量文献报道新琼四糖和新琼六糖的活性，而对于新琼二糖、八糖和十糖的活性几乎没有文献报道，这可能是因为这些单一聚合度新琼寡糖难以获得，更遑论工业化生产。不同聚合度的新琼寡糖具有不同的生理活性，因此，制备高纯度的单一聚合度新琼寡糖并研究其生理活性，对于新琼寡糖的全面开发应用具有重要的理论价值和现实意义。
近年来，有关新琼寡糖的研究和应用逐渐增多，但其制备方法是限制新琼寡糖产业化开发的瓶颈问题。目前，新琼寡糖的制备方法主要有酸解法和酶解法两种，其中酸解法降解速度快，方法简便，但存在环境不友好、反应条件剧烈和产物复杂不可控等缺点，制约了该方法的大规模应用。而酶解法具有环境友好、降解条件温和及产物纯度较高等优点，成为近年来新琼寡糖制备的主要方法。
虽然酶解法具有诸多优点，但作为酶解反应的关键催化剂-琼胶酶的活性易受酶解条件的影响且难以重复利用，同时对于产物的分离纯化也会造成一定的影响。这些不足也是导致新琼寡糖产业化开发难以迅速发展的原因之一，因此，如何提高琼胶酶的活力、稳定性以及重复利用，使之成为工业催化剂成为当前研究需要突破的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法，包括如下步骤：
(1)将需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1从斜面培养基转接至种子培养基，振荡培养得种子液，将种子液接种至液体培养基中，接种量为5.5～6.5％，发酵温度34～36℃，搅拌转速90～110rpm，发酵时间45～50h，接着将获得的发酵液离心除去菌体后所得上清液，该上清液经硫酸铵沉淀分离，再透析，冻干得琼胶酶粉末；
(2)固定化载体的制备：取氧化石墨烯(GO)加入乙醇溶液中，超声分散0.4～0.6h后，加入等摩尔的铁盐和亚铁盐，继续超声分散18～22min后，加入氨水溶液于58～62℃回流温度下反应1～2h后，通过磁分离、水洗、干燥得GO/Fe3O4复合磁性载体；上述铁盐为氯化铁或其水合物、硫酸铁或其水合物及硝酸铁或其水合物中的至少一种，上述亚铁盐为七水合硫酸亚铁或其水合物、氯化亚铁或其水合物及硝酸亚铁或其水合物中的至少一种；
(3)将步骤(2)制备的GO/Fe3O4复合磁性载体加入戊二醛水溶液进行交联反应，反应时间为2～10h，反应结束后过滤，以磷酸盐缓冲液清洗滤出物，再配制成浓度为4～6wt％的混悬液，加入步骤(1)制得的琼胶酶粉末，其中的GO/Fe3O4复合磁性载体与上述琼胶酶的质量比为24～26∶1，孵育2～5h后，经磁分离、水洗、干燥得固定化琼胶酶；
(4)系列新琼寡糖的制备：配制质量分数为0.3～0.7％的琼脂糖溶液，加入步骤(3)所得的固定化琼胶酶进行酶解，在温度35～45℃，pH8.4～8.6，转速90～110rpm条件下酶解2～10h，通过磁分离回收固定化琼胶酶后，酶解液于8000～10000rpm离心10～20min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.44～0.47μm微孔滤膜过滤后，再经聚丙酰胺凝胶分离纯化，收集不同流分，冷冻干燥，得到系列单一聚合度的新琼寡糖纯品。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中，所述乙醇溶液的体积浓度为30～60％，所述氨水溶液的浓度为3.4～3.6mol/L。
进一步优选的，所述步骤(2)中，所述氧化石墨烯、铁盐、乙醇溶液和氨水溶液的比例为1g∶1∶1.5～2.5mmol∶50～80mL∶80～120mL。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中，所述戊二醛水溶液的体积浓度为2～6％，所述交联反应的时间为2～10h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中，所述孵育的温度为4～25℃，孵育的时间为2～6h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中的聚丙酰胺凝胶的型号为Bio-GelP2。
在本发明的一个优选实施方案中，所述新琼寡糖纯品为新琼二糖至新琼十二糖纯品。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用固定化酶技术制备固定化琼胶酶并将其应用于新琼寡糖的制备，通过简单的磁分离，可实现琼胶酶的重复利用，同时也简化了后处理步骤，从而大大降低新琼寡糖的生产成本；除此之外，本发明所用的固定化载体制备简单，固定化方法简单有效，为今后实现产业化规模生产新琼寡糖提供理论和技术支持。
2、本发明利用固定化琼胶酶水解琼脂糖制备系列高纯度单一聚合度的新琼寡糖，酶解效率好、产物纯度高，经HPLC检测，所获得的新琼二糖至新琼十二糖纯品的纯度95％。本发明可实现系列高纯度新琼寡糖的高效制备，为新琼寡糖的进一步广泛深入研究和产业化开发提供了理论依据和技术支持，具有良好的应用潜力和市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例8至12中不同酶解时间的酶解产物分析图，其中，S-新琼寡糖标准品，A-酶解2h，B-酶解4h，C-酶解6h，D-酶解8h，E-酶解10h，1-新琼二糖，2-新琼四糖，3-新琼六糖，4-新琼八糖，5-新琼十糖，6-新琼十二糖。
图2为本发明实施例8至12中分离所获单一聚合度新琼寡糖的HPLC图谱，其中，A-新琼十二糖，B-新琼十糖，C-新琼八糖，D-新琼六糖，E-新琼四糖，F-新琼二糖。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中，固定化酶活力检测方法：从反应体系中取出1.0mL反应液加入1.0mL3，5～二硝基水杨酸(DNS)溶液，置于沸水浴中5min，然后用流动水迅速冷却，加蒸馏水定容至10mL，在540nm处测OD值。按每毫升发酵液每min降解产生1μg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
实施例1琼胶酶酶液的制备
将需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1(公开于专利申请201510390422.9，产琼胶酶的需钠弧菌及其应用，公开号CN105087427A，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC M2015244，保藏日期：2015年4月23日)从斜面培养基转接至种子培养基，振荡培养得种子液，将种子液接种至液体培养基中，接种量为6％，发酵温度35℃，搅拌转速100rpm，发酵时间48h，发酵液离心除去菌体后所得上清液经硫酸铵沉淀分离，再透析，最后冷冻干燥得琼胶酶粉末。
上述斜面培养基、种子培养基和液体培养基的具体配方见CN105087427A。
实施例2固定化酶的制备
(1)取1.0g氧化石墨烯(GO)加入80mL 60％的乙醇溶液中，超声分散0.5h后，加入0.676g六水合三氯化铁和0.695g七水合硫酸亚铁，继续超声20min后，加入3.5mol L～1氨水溶液100mL于60℃回流温度下反应2h后，用磁铁分离产物，用去离子水洗涤至中性，干燥得GO/Fe3O4复合磁性载体。
上述六水合三氯华铁还可替换为相同摩尔量的其他氯化铁或其水合物、硫酸铁或其水合物及硝酸铁或其水合物中的至少一种，上述七水合硫酸亚铁还可替换为相同摩尔量的其他七水合硫酸亚铁或其水合物、氯化亚铁或其水合物及硝酸亚铁或其水合物中的至少一种；
(2)将步骤(1)制备的GO/Fe3O4复合磁性载体加入体积浓度为2～6％的戊二醛水溶液中进行交联反应，反应时间为2～10h，反应结束后过滤，以磷酸盐缓冲液清洗滤出物3次，将交联后的GO/Fe3O4复合磁性载体配制成浓度为5wt％的混悬液，加入实施例1制得的琼胶酶粉末，孵育2～6h，经磁分离、水洗、干燥得固定化琼胶酶。
实施例3戊二醛浓度对固定化琼胶酶酶活的影响
琼胶酶及固定化载体制备和固定化方法参考实施例1和2，所不同的是，在固定化酶时，戊二醛水溶液的体积浓度为1％、2％、3％、4％、5％。
表1戊二醛浓度对固定化琼胶酶酶活的影响
戊二醛浓度(％) 固定化琼胶酶酶活(U)
1 222
2 277
3 325
4 311
5 292
实施例4交联时间对固定化琼胶酶酶活的影响
琼胶酶及固定化载体制备和固定化方法参考实施例1和2，所不同的是，在固定化酶时，戊二醛交联时间为2h，4h，6h，8h，10h。
表2戊二醛交联时间对固定化琼胶酶酶活的影响
戊二醛浓度(h) 固定化琼胶酶酶活(U)
2 274
4 298
6 332
8 321
10 308
实施例5琼胶酶浓度对固定化琼胶酶酶活的影响
琼胶酶及固定化载体制备和固定化方法参考实施例1和2，所不同的是，在进行酶的固定化时，琼胶酶在混悬液中的浓度为1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL。
表3酶浓度对固定化琼胶酶酶活的影响
琼胶酶浓度(mg/mL) 固定化琼胶酶酶活(U)
1 281
2 301
3 322
4 348
5 349
实施例6固定化时间对固定化琼胶酶酶活的影响
琼胶酶及固定化载体制备和固定化方法参考实施例1和2，所不同的是，在进行酶的固定化时，固定化时间为1h，2h，3h，4h，5h。
表4固定化时间对固定化琼胶酶酶活的影响
实施例7固定化酶使用次数对固定化琼胶酶酶活的影响
琼胶酶及固定化载体制备和固定化方法参考实施例1和2，所不同的是，在进行酶解时，固定化酶的循环使用次数为1次，2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，10次。
表5固定化酶使用次数对固定化琼胶酶酶活的影响
使用次数(次) 固定化琼胶酶相对酶活力(％)
1 100
2 99
3 98
4 96
5 95
6 92
7 90
8 87
9 85
10 82
实施例8固定化琼胶酶酶解琼脂糖
配制质量分数为0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1∶100加入固定化琼胶酶进行酶解，在温度45℃，pH8.5，转速100rpm条件下酶解2h，酶解结束后通过磁分离回收固定化琼胶酶，酶解液于10000rpm离心10min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.45μm微孔滤膜过滤后，经聚丙酰胺凝胶Bio-Gel P2柱纯化分离纯化，TLC检测，收集不同流分，冷冻干燥，得到新琼十二糖、新琼十糖、新琼八糖、新琼六糖、新琼四糖和新琼二糖，经HPLC检测，纯度达97％以上，结果见图1和图2。
该实施例中的固定化琼胶酶的制备方法中，戊二醛水溶液的体积浓度为3％，戊二醛交联时间为6h，琼胶酶在混悬液中的浓度为5mg/mL，固定化时间为3h，其余同实施例1和实施例2。
实施例9固定化琼胶酶酶解琼脂糖
配制质量分数为0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1∶100加入固定化琼胶酶(制备方法同时实施例8)进行酶解，在温度45℃，pH8.5，转速100rpm条件下酶解4h，酶解结束后通过磁分离回收固定化琼胶酶，酶解液于10000rpm离心10min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.45μm微孔滤膜过滤后，经聚丙酰胺凝胶Bio-Gel P2柱纯化分离纯化，TLC检测，收集不同流分，冷冻干燥，得到新琼十糖、新琼八糖、新琼六糖、新琼四糖和新琼二糖，经HPLC检测，纯度达97％以上，结果见图1和图2。
实施例10固定化琼胶酶酶解琼脂糖
配制质量分数为0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1∶100加入固定化琼胶酶(制备方法同时实施例8)进行酶解，在温度45℃，pH8.5，转速100rpm条件下酶解6h，酶解结束后通过磁分离回收固定化琼胶酶，酶解液于10000rpm离心10min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.45μm微孔滤膜过滤后，经聚丙酰胺凝胶Bio-Gel P2柱纯化分离纯化，TLC检测，收集不同流分，冷冻干燥，得到新琼八糖、新琼六糖、新琼四糖和新琼二糖，经HPLC检测，纯度达97％以上，结果见图1和图2。
实施例11固定化琼胶酶酶解琼脂糖
配制质量分数为0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1∶100加入固定化琼胶酶(制备方法同时实施例8)进行酶解，在温度45℃，pH8.5，转速100rpm条件下酶解8h，酶解结束后通过磁分离回收固定化琼胶酶，酶解液于10000rpm离心10min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.45μm微孔滤膜过滤后，经聚丙酰胺凝胶Bio-Gel P2柱纯化分离纯化，TLC检测，收集不同流分，冷冻干燥，得到新琼六糖、新琼四糖和新琼二糖，经HPLC检测，纯度达97％以上，结果见图1和图2。
实施例12固定化琼胶酶酶解琼脂糖
配制质量分数为0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1∶100加入固定化琼胶酶(制备方法同时实施例8)进行酶解，在温度45℃，pH8.5，转速100rpm条件下酶解10h，酶解结束后通过磁分离回收固定化琼胶酶，酶解液于10000rpm离心10min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.45μm微孔滤膜过滤后，经聚丙酰胺凝胶Bio-Gel P2柱纯化分离纯化，TLC检测，收集不同流分，冷冻干燥，得到新琼四糖和新琼二糖，经HPLC检测，纯度达97％以上，结果见图1和图2。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.一种利用固定化酶制备系列单一聚合度的新琼寡糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将需钠弧菌HJPHYXJ-1从斜面培养基转接至种子培养基，振荡培养得种子液，将种子液接种至液体培养基中，接种量为5.5～6.5％，发酵温度34～36℃，搅拌转速90～110rpm，发酵时间45～50h，接着将获得的发酵液离心除去菌体后所得上清液，该上清液经硫酸铵沉淀分离，再透析，冻干得琼胶酶粉末；
(2)固定化载体的制备：取氧化石墨烯加入乙醇溶液中，超声分散0.4～0.6h后，加入等摩尔的铁盐和亚铁盐，继续超声分散18～22min后，加入氨水溶液于58～62℃回流温度下反应1～2h后，通过磁分离、水洗、干燥得GO/Fe3O4复合磁性载体；上述铁盐为氯化铁或其水合物、硫酸铁或其水合物及硝酸铁或其水合物中的至少一种，上述亚铁盐为七水合硫酸亚铁或其水合物、氯化亚铁或其水合物及硝酸亚铁或其水合物中的至少一种；
(3)固定化酶的制备：将步骤(2)制备的GO/Fe3O4复合磁性载体加入戊二醛水溶液进行交联反应，反应时间为2～10h，反应结束后过滤，以磷酸盐缓冲液清洗滤出物，再配制成浓度为4～6wt％的混悬液，加入步骤(1)制得的琼胶酶粉末，其中的GO/Fe3O4复合磁性载体与上述琼胶酶的质量比为24～26∶1孵育2～5h后，经磁分离、水洗、干燥得固定化琼胶酶；
(4)系列新琼寡糖的制备：配制质量分数为0.3～0.7％的琼脂糖溶液，加入步骤(3)所得的固定化琼胶酶进行酶解，在温度35～45℃，pH8.4～8.6，转速90～110rpm条件下酶解2～10h，通过磁分离回收固定化琼胶酶后，酶解液于8000～10000rpm离心10～20min，取上清于50～60℃减压浓缩后经0.44～0.47μm微孔滤膜过滤后，再经聚丙酰胺凝胶分离纯化，收集不同流分，冷冻干燥，得到系列单一聚合度的新琼寡糖纯品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述乙醇溶液的体积浓度为30～60％，所述氨水溶液的浓度为3.4～3.6mol/L。
3.如权利要求2所述的方法，的其特征在于：所述步骤(2)中，所述氧化石墨烯、铁盐、乙醇溶液和氨水溶液的比例为1g∶1∶1.5～2.5mmol∶50～80mL∶80～120mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述戊二醛水溶液的体积浓度为2～6％，所述交联反应的时间为2～10h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述孵育的温度为4～25℃，孵育的时间为2～6h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的聚丙酰胺凝胶的型号为Bio-Gel P2。
7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述新琼寡糖纯品为新琼二糖至新琼十二糖纯品。
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