CN110038524A - 一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法 - Google Patents

一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：S1、首先采用琼脂糖凝胶作为基质，经高碘酸钠溶液醛基化反应，制备得到醛基化琼脂糖凝胶；S2、其次将壳寡糖进行纳滤，除去单糖和二糖，制备得到纯化壳寡糖，作为亲和配基，偶联在步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶上；S3、再采用硼氢化钠溶液还原步骤S2制备得到的偶联产物，制备得到稳定的亲和层析介质；S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质用蒸馏水洗涤抽干，储存在乙醇溶液中备用。本发明提供的制备方法，原料容易获得、价格低廉、艺具简单、提纯方法稳定可靠、具有很大的应用前景和良好经济、社会效益。

Description

一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法。
背景技术
壳聚糖酶是一类专一性降解壳聚糖的糖苷键水解酶。该酶反应条件温和，可以通过控制反应时间来控制水解产物，大规模生产特定分子量壳聚糖以及壳寡糖。因而在医药、食品、化工、化妆品、生物医学工程等诸多领域具有深远的应用潜力。但由于壳聚糖酶来源于微生物发酵液，发酵液中同时存在的其他生物大分子特别是蛋白酶类会严重影响壳聚糖酶类的稳定性，使其难以长期保存，所以极大的限制了壳聚糖酶在实际生产中的广泛应用。因此，快速高效地从发酵液中分离纯化壳聚糖酶，对于壳聚糖酶在实际生产中的应用具有重要意义。
亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一。
亲和配基是亲和层析介质的核心，它决定了亲和层析分离的效率。壳聚糖是壳聚糖酶的反应底物，但不属于小分子，不能作为亲和层析分离壳聚糖酶的配体。壳寡糖分子量低于2000，属于小分子，可以作为壳聚糖酶的底物，对壳聚糖酶有高的亲和力，到目前为止，尚未有报道将壳寡糖作为亲和配基，分离壳聚糖酶。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先采用琼脂糖凝胶作为基质，经高碘酸钠溶液醛基化反应，制备得到醛基化琼脂糖凝胶；
S2、其次将壳寡糖进行纳滤，除去单糖和二糖，制备得到纯化壳寡糖，作为亲和配基，偶联在步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶上；
S3、再采用硼氢化钠溶液还原步骤S2制备得到的偶联产物，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质用蒸馏水洗涤抽干，储存在乙醇溶液中备用。
其中，所述步骤S2中，将壳寡糖进行纳滤，是先将壳寡糖用蒸馏水配置成浓度为0.05-0.15g/mL的壳寡糖溶液，再用纳滤膜进行纯化，除去单糖和二糖，加入3-6倍体积的无水乙醇沉淀、冷冻干燥，制备得到纯化壳寡糖作为亲和配基。
其中，所述的琼脂糖凝胶选自琼脂糖6FF凝胶、琼脂糖4FF凝胶、琼脂糖CL-6B凝胶、琼脂糖CL-4B凝胶、琼脂糖6B凝胶、琼脂糖4B凝胶中的任意一种或任意几种的组合。
其中，所述琼脂糖凝胶与所述高碘酸钠的质量比10:1-5。
优选地，所述琼脂糖凝胶与所述高碘酸钠的质量比10:2，10:3，10:4。
其中，所述醛基化琼脂糖凝胶与所述纯化壳寡糖的质量比为100:5-15。
优选地，所述醛基化琼脂糖凝胶与所述纯化壳寡糖的质量比为100:6，100:7，100:8，100:9，100:10，100:11，100:12，100:13，100:14。
其中，所述步骤S1中，醛基化反应的温度为15-40℃，时间为0.5-3h，转速为100-300rpm。
其中，所述步骤S2中，偶联反应的温度为25-40℃，时间为8-24h，转速为100-300rpm。
其中，所述步骤S3中，还原反应的温度为2-6℃，时间为1-5h。
其中，所述步骤S4中，所述亲和层析介质储存的温度为2-6℃，所述乙醇溶液的浓度为10-25%。
本发明第二方面提供了一种分离纯化壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
S1、先将含壳聚糖酶的发酵液离心除去菌体，得到完全澄清的发酵液；
S2、利用本发明第一方面提供的方法制备得到的亲和层析介质孵育步骤1）中得到的样品；
S3、洗脱步骤S2中亲和层析介质吸附的壳聚糖酶。
本发明的有益效果：
本发明提供的用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，具有以下优点：
1、制备亲和配基的壳寡糖容易获得，价格低廉；
2、制备工艺具有操作简单、提纯方法稳定可靠、容易控制及对设备要求低的特点；
3、提供了一个新的分离纯化壳聚糖酶的亲和配基的制备工艺，具有很大的应用前景和良好经济、社会效益。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶5g置于250ml的三角瓶中，加入50ml浓度为0.01g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为25℃，转速为150rpm进行醛基化反应1h，制备得到醛基化琼脂糖6FF凝胶；
S2、取30 g壳寡糖用蒸馏水定容至500mL，配置成浓度为0.06g/mL的壳寡糖溶液，用美国GE公司生产的1812型卷式纳滤膜，在0.15 MPa的运行压力下进行超滤，每隔10min补充蒸馏水至出发体积，运行60min以充分除去单糖和二糖，然后不再充蒸馏水，继续运行浓缩壳寡糖溶液至最小体积，然后加入5倍体积的无水乙醇沉淀60min，抽滤收集沉淀，冷冻干燥，得到23.8g纯化壳寡糖，得率79.3%；
S3、取步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶1g，置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入步骤S2制备得到的纯化壳寡糖溶液，该纯化壳寡糖溶液的体积为10mL，浓度为 0.01g/mL，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为37℃，转速为150rpm进行偶联反应12h；
S4、再将步骤S3中制备得到的偶联纯化壳寡糖的琼脂糖凝胶转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.01g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为4℃的冰箱内，还原反应2h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S5、最后将步骤S4制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于4℃储存在浓度为20%的乙醇溶液中备用。
采用实施例1制备得到的亲和层析介质分离纯化壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
S1、先将5ml含壳聚糖酶的发酵液6000rpm离心15min除去菌体，得到完全澄清的发酵液；
S2、取实施例1制备得到的亲和层析介质10ml装入层析柱（Φ1.0 cm×10 cm）中，用100ml 蒸馏水平衡；
S3、将步骤S1中完全澄清的发酵液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为30mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%壳聚糖溶液洗脱壳聚糖酶，流速为20mL/h，洗脱1h。
实施例1中的琼脂糖凝胶还可选自琼脂糖6FF凝胶、琼脂糖4FF凝胶、琼脂糖CL-6B凝胶、琼脂糖CL-4B凝胶、琼脂糖6B凝胶、琼脂糖4B凝胶中的任意一种或任意几种的组合。
为了验证不同组分的琼脂糖凝胶制备得到的亲和层析介质对壳聚糖酶的分离纯化效果，以实施例1为参考，控制实验条件和参数不变，通过变换琼脂糖凝胶的组分和配比设置第一组对比试验，琼脂糖凝胶的配比和组分如表一。
表一 不同组分的琼脂糖凝胶对壳聚糖酶分离纯化效果的影响
对比试验 琼脂糖凝胶的组分和配比 壳聚糖酶的分离纯化倍数
对比试验1 琼脂糖6FF凝胶5g 5.6
对比试验2 琼脂糖4FF凝胶5g 6.2
对比试验3 琼脂糖CL-6B凝胶5g 5.9
对比试验4 琼脂糖CL-4B凝胶5g 5.7
对比试验5 琼脂糖6B凝胶5g 6.1
对比试验6 琼脂糖4B凝胶5g 6.3
对比试验7 琼脂糖6FF凝胶3g，琼脂糖CL-6B凝胶2g 6.8
对比试验8 琼脂糖6FF凝胶2g，琼脂糖CL-6B凝胶1g，琼脂糖4B凝胶2g 7.1
对比试验9 琼脂糖4FF凝胶1g，琼脂糖CL-6B凝胶2g，琼脂糖6B凝胶2g 6.9
对比试验10 琼脂糖6FF凝胶1g、琼脂糖4FF凝胶0.5g、琼脂糖CL-6B凝胶1g、琼脂糖CL-4B凝胶1g、琼脂糖6B凝胶0.5、琼脂糖4B凝胶1g 6.8
通过上述对比试验可以看出，琼脂糖凝胶的组分为上述任一一种或是几种的组合（参考对比试验1-10），制备得到的亲和层析介质都可以分离纯化壳聚糖酶；当琼脂糖凝胶的组分为两种或两种以上时（参考对比试验7-10），壳聚糖酶的分离纯化效果明显优于对比试验1-6；因此，琼脂糖凝胶优选上述琼脂糖凝胶中的两种或两种以上。
实施例2
本发明提供了一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶2g，琼脂糖CL-6B凝胶1g，琼脂糖4B凝胶2g，置于250ml的三角瓶中，加入50ml浓度为0.03g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为25℃，转速为150rpm进行醛基化反应1h，制备得到醛基化琼脂糖6FF凝胶；
S2、取30 g壳寡糖用蒸馏水定容至500mL，配置成浓度为0.06g/mL的壳寡糖溶液，用美国GE公司生产的1812型卷式纳滤膜，在0.15 MPa的运行压力下进行超滤，每隔10min补充蒸馏水至出发体积，运行60min以充分除去单糖和二糖，然后不再充蒸馏水，继续运行浓缩壳寡糖溶液至最小体积，然后加入5倍体积的无水乙醇沉淀60min，抽滤收集沉淀，冷冻干燥，得到23.8g纯化壳寡糖，得率79.3%；
S3、取步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶1g，置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入步骤S2制备得到的纯化壳寡糖溶液，该纯化壳寡糖溶液的体积为10mL，浓度为 0.01g/mL，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为37℃，转速为150rpm进行偶联反应12h；
S4、再将步骤S3中制备得到的偶联纯化壳寡糖的琼脂糖凝胶转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.01g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为4℃的冰箱内，还原反应2h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S5、最后将步骤S4制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于4℃储存在浓度为20%的乙醇溶液中备用。
采用实施例2制备得到的亲和层析介质分离纯化壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
S1、先将5ml含壳聚糖酶的发酵液6000rpm离心15min除去菌体，得到完全澄清的发酵液；
S2、取实施例1制备得到的亲和层析介质10ml装入层析柱（Φ1.0 cm×10 cm）中，用100ml 蒸馏水平衡；
S3、将步骤S1中完全澄清的发酵液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为30mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%壳聚糖溶液洗脱壳聚糖酶，流速为20mL/h，洗脱1h。
为了验证不同质量比的琼脂糖凝胶与高碘酸钠制备得到的亲和层析介质对壳聚糖酶的分离纯化效果，以实施例2为参考，控制实验条件和参数不变，通过变换高碘酸钠的浓度设置第二组对比试验，如表二。
表二 不同质量比的琼脂糖凝胶与高碘酸钠对壳聚糖酶分离纯化效果的影响
对比试验 高碘酸钠的质量（g） 琼脂糖凝胶与高碘酸钠的质量比 壳聚糖酶的分离纯化倍数
对比试验1 0.1 10:0.2 5.2
对比试验2 0.25 10:0.5 6.5
对比试验3 0.5 10:1 7.1
对比试验4 1.0 10:2 9.8
对比试验5 1.5 10:3 15.2
对比试验6 2.0 10:4 13.4
对比试验7 2.5 10:5 12.7
对比试验8 3.0 10:6 8.6
通过上述对比试验可以看出，琼脂糖凝胶与高碘酸钠的质量比为10:1-5时，制备得到的亲和层析介质分离纯化壳聚糖酶的效果最优，因此琼脂糖凝胶与高碘酸钠的质量比优选10:3-5。
实施例3
本发明提供了一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶2g，琼脂糖CL-6B凝胶1g，琼脂糖4B凝胶2g，置于250ml的三角瓶中，加入50ml浓度为0.03g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为20℃，转速为250rpm进行醛基化反应2h，制备得到醛基化琼脂糖6FF凝胶；
S2、取30 g壳寡糖用蒸馏水定容至500mL，配置成浓度为0.06g/mL的壳寡糖溶液，用美国GE公司生产的1812型卷式纳滤膜，在0.15 MPa的运行压力下进行超滤，每隔10min补充蒸馏水至出发体积，运行60min以充分除去单糖和二糖，然后不再充蒸馏水，继续运行浓缩壳寡糖溶液至最小体积，然后加入5倍体积的无水乙醇沉淀60min，抽滤收集沉淀，冷冻干燥，得到23.8g纯化壳寡糖，得率79.3%；
S3、取步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶1g，置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入步骤S2制备得到的纯化壳寡糖溶液，该纯化壳寡糖溶液的体积为10mL，浓度为 0.015g/mL，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为30℃，转速为200rpm进行偶联反应20h；
S4、再将步骤S3中制备得到的偶联纯化壳寡糖的琼脂糖凝胶转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.01g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为5℃的冰箱内，还原反应3h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S5、最后将步骤S4制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于3℃储存在浓度为15%的乙醇溶液中备用。
采用实施例3制备得到的亲和层析介质分离纯化壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
S1、先将5ml含壳聚糖酶的发酵液6000rpm离心15min除去菌体，得到完全澄清的发酵液；
S2、取实施例1制备得到的亲和层析介质10ml装入层析柱（Φ1.0 cm×10 cm）中，用100ml 蒸馏水平衡；
S3、将步骤S1中完全澄清的发酵液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为30mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%壳聚糖溶液洗脱壳聚糖酶，流速为20mL/h，洗脱1h。
为了验证不同质量比的醛基化琼脂糖凝胶与纯化壳寡糖制备得到的亲和层析介质对壳聚糖酶的分离纯化效果，以实施例2为参考，控制实验条件和参数不变，通过变换纯化壳寡糖的浓度设置第三组对比试验，如表三。
表三 不同质量比的醛基化琼脂糖凝胶与纯化壳寡糖对壳聚糖分离纯化效果的影响
对比试验 纯化壳寡糖的质量（g） 醛基化琼脂糖凝胶与纯化壳寡糖的质量比 壳聚糖酶的分离纯化倍数
对比试验1 0.01 100:1 3.7
对比试验2 0.03 100:3 5.2
对比试验3 0.05 100:5 8.1
对比试验4 0.07 100:7 10.6
对比试验5 0.09 100:9 14.5
对比试验6 0.1 100:10 15.2
对比试验7 0.13 100:13 17.9
对比试验8 0.15 100:15 19.8
对比试验9 0.17 100:17 18.2
对比试验10 0.2 100:20 16.3
通过上述对比试验可以看出，醛基化琼脂糖凝胶与纯化壳寡糖的质量比为100: 9-15时，制备得到的亲和层析介质分离纯化壳聚糖酶的效果最优，因此醛基化琼脂糖凝胶与纯化壳寡糖的质量比优选100: 9-15。
实施例4
本发明提供了一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
S1、首先取洗净抽干的琼脂糖6FF凝胶2g，琼脂糖CL-6B凝胶1g，琼脂糖4B凝胶2g，置于250ml的三角瓶中，加入50ml浓度为0.03g/mL的高碘酸钠溶液，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为30℃，转速为200rpm进行醛基化反应1.5h，制备得到醛基化琼脂糖6FF凝胶；
S2、取30 g壳寡糖用蒸馏水定容至500mL，配置成浓度为0.06g/mL的壳寡糖溶液，用美国GE公司生产的1812型卷式纳滤膜，在0.15 MPa的运行压力下进行超滤，每隔10min补充蒸馏水至出发体积，运行60min以充分除去单糖和二糖，然后不再充蒸馏水，继续运行浓缩壳寡糖溶液至最小体积，然后加入5倍体积的无水乙醇沉淀60min，抽滤收集沉淀，冷冻干燥，得到23.8g纯化壳寡糖，得率79.3%；
S3、取步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶1g，置于砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入步骤S2制备得到的纯化壳寡糖溶液，该纯化壳寡糖溶液的体积为10mL，浓度为 0.015g/mL，置于恒温震荡培养箱中，控制温度为35℃，转速为300rpm进行偶联反应10h；
S4、再将步骤S3中制备得到的偶联纯化壳寡糖的琼脂糖凝胶转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤后抽干，转入250mL三角瓶中，加入50mL浓度为0.01g/mL的硼氢化钠溶液，置于温度为5℃的冰箱内，还原反应4h，制备得到稳定的亲和层析介质；
S5、最后将步骤S4制备得到的亲和层析介质转移到砂芯漏斗中用蒸馏水洗涤抽干，于5℃储存在浓度为25%的乙醇溶液中备用。
采用实施例4制备得到的亲和层析介质分离纯化壳聚糖酶的方法，包括以下步骤：
S1、先将5ml含壳聚糖酶的发酵液6000rpm离心15min除去菌体，得到完全澄清的发酵液；
S2、取实施例1制备得到的亲和层析介质10ml装入层析柱（Φ1.0 cm×10 cm）中，用100ml 蒸馏水平衡；
S3、将步骤S1中完全澄清的发酵液加入层析柱中孵育10 min后，使用浓度为1%的氯化钠溶液洗脱杂蛋白，设定流速为30mL/h，洗脱2h，再使用浓度为1%壳聚糖溶液洗脱壳聚糖酶，流速为20mL/h，洗脱1h。
为了验证不同浓度的壳聚糖溶液洗脱对壳聚糖酶的分离纯化效果，以实施例4为参考，控制实验条件和参数不变，通过变换壳聚糖浓度设置第四组对比试验，如表四。
表四 不同壳聚糖浓度洗脱对壳聚糖酶分离纯化效果的影响
对比试验 壳聚糖浓度（%） 壳聚糖酶的分离纯化倍数
对比试验1 0.5 5.2
对比试验2 0.6 7.6
对比试验3 0.7 10.8
对比试验4 0.8 11.3
对比试验5 0.9 15.9
对比试验6 1.0 19.8
对比试验7 1.1 16.5
对比试验8 1.2 15.9
对比试验9 1.3 15.5
对比试验10 1.4 13.8
通过上述对比试验可以看出，壳聚糖浓度为0.9-1.3%时，制备得到的亲和层析介质分离纯化己糖激酶的效果最优，因此壳聚糖浓度优选为0.9-1.3%。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、首先采用琼脂糖凝胶作为基质，经高碘酸钠溶液醛基化反应，制备得到醛基化琼脂糖凝胶；
S2、其次将壳寡糖进行纳滤，除去单糖和二糖，制备得到纯化壳寡糖，作为亲和配基，偶联在步骤S1制备得到的醛基化琼脂糖凝胶上；
S3、再采用硼氢化钠溶液还原步骤S2制备得到的偶联产物，制备得到稳定的亲和层析介质；
S4、最后将步骤S3制备得到的亲和层析介质用蒸馏水洗涤抽干，储存在乙醇溶液中备用。
2.根据权利要求1所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，将壳寡糖进行纳滤，是先将壳寡糖用蒸馏水配置成浓度为0.05-0.15g/mL的壳寡糖溶液，再用纳滤膜进行纯化，除去单糖和二糖，加入3-6倍体积的无水乙醇沉淀、冷冻干燥，制备得到纯化壳寡糖作为亲和配基。
3.根据权利要求2所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶选自琼脂糖6FF凝胶、琼脂糖4FF凝胶、琼脂糖CL-6B凝胶、琼脂糖CL-4B凝胶、琼脂糖6B凝胶、琼脂糖4B凝胶中的任意一种或任意几种的组合。
4.根据权利要求2所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶与所述高碘酸钠的质量比10:1-5。
5.根据权利要求2所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述醛基化琼脂糖凝胶与所述纯化壳寡糖的质量比为100:5-15。
6.根据权利要求1-5中任意一项权利要求所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，醛基化反应的温度为15-40℃，时间为0.5-3h，转速为100-300rpm。
7.根据权利要求1-5中任意一项权利要求所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，偶联反应的温度为25-40℃，时间为8-24h，转速为100-300rpm。
8.根据权利要求1-5中任意一项权利要求所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，还原反应的温度为2-6℃，时间为1-5h。
9.根据权利要求1-5中任意一项权利要求所述的一种用于分离纯化壳聚糖酶的亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，所述亲和层析介质储存的温度为2-6℃，所述乙醇溶液的浓度为10-25%。
10.一种分离纯化壳聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、先将含壳聚糖酶的发酵液离心除去菌体，得到完全澄清的发酵液；
S2、利用权利要求1-9中任意一种方法制备得到的亲和层析介质孵育步骤1）中得到的样品；
S3、洗脱步骤S2中亲和层析介质吸附的壳聚糖酶。
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