CN101078008A

CN101078008A - 壳聚糖酶的分离纯化工艺

Info

Publication number: CN101078008A
Application number: CN 200710048346
Authority: CN
Inventors: 余蓉; 李晓红; 杨俐; 杨继虞
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2007-01-29
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2007-11-28

Abstract

本发明涉及壳聚糖酶的分离纯化工艺。将产壳聚糖酶真菌发酵液离心得粗酶液，经交联壳聚糖树脂亲和吸附，用缓冲液洗至无蛋白流出，再以1－5‰的Cu²⁺洗脱，洗脱液透析浓缩后用凝胶过滤层析进行分离，获得电泳纯的壳聚糖酶。本工艺具有特异性高、工艺简便、蛋白质不易失活、纯化效果好、回收率高以及成本低等优点，具有推广应用价值。

Description

壳聚糖酶的分离纯化工艺

技术领域本发明涉及的是一种壳聚糖酶的分离纯化工艺，具体而言就是用交联壳聚糖树脂对产壳聚糖酶的真菌粗提液中壳聚糖酶进行亲和吸附，用Cu²⁺洗脱，再用凝胶过滤层析而分离提纯出来的方法。

背景技术壳聚糖酶为壳聚糖的专一性水解酶，被广泛用于壳寡糖的制备工艺中，具有很高的应用价值。目前，壳聚糖酶的生产主要是从产壳聚糖酶的真菌发酵液中来提取。在壳聚糖酶的分离纯化中，目前文献报道的常用工艺是盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法。例如，《郑州工程学院学报》2001(4)，19～23报道蔡静平等将假单胞菌VIIIT39发酵液依次进行硫酸铵盐析、透析和Sephadex G-100层析，得到电泳纯的壳聚糖酶，活力回收为36.55％；《无锡轻工业大学学报》2004(3)，10～14报道陈小娥等将曲霉CJ22-326的初提液依次经过乙醇沉淀、CM-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析和Phenyl SepharoseCL-4B疏水层析，得到电泳纯的壳聚糖酶，活力回收为22.17％；《中国医药工业杂志》2002(8)，378～381报道葛正红等分离纯化青霉菌产生的壳聚糖酶，依次采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-cellulose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析，得到电泳纯的壳聚糖酶，活力回收率为21％；《食品与发酵工业》2004(5)，49～52报道邱乐泉等对假单胞菌H3的壳聚糖酶粗酶液依次用硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐、Sepharose Q-XL阴离子交换层析和Superdex G-75凝胶过滤层析进行纯化，得到电泳纯的壳聚糖酶，活力回收率为18.2％。综上所述，采用盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法虽可纯化壳聚糖酶，但纯化步骤繁琐、工艺条件控制复杂、经多步骤操作后酶活力损失大，回收率较低，而且烦琐的分离工艺中使用了多种分离介质，导致成本增加。

发明内容综合考虑各种分离纯化工艺的利弊，本发明提出了一种用交联壳聚糖树脂亲和层析纯化壳聚糖酶的具体方法。该方法具有特异性高、工艺简便、蛋白质不易失活、纯化效果好、回收率高以及成本低等优点，具有推广应用价值。

本发明的壳聚糖酶的分离纯化工艺是将产壳聚糖酶的真菌发酵液用交联壳聚糖树脂进行亲和吸附，经缓冲液洗至无蛋白流出后，用1-5‰的Cu²⁺溶液洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩后，用凝胶过滤层析进行分离。

本发明的上述方法利用酶与其天然底物的自然结合，用交联壳聚糖树脂直接作为亲和层析的配基，不需另外选择载体，避免了传统亲和层析载体需活化并与配基偶联、偶联剂溴化氰有毒等缺点，其吸附特异性高、吸附性能稳定，仅亲和层析这一步纯化倍数即可达30。

本发明的上述方法采用低浓度的Cu²⁺作为亲和层析的洗脱剂，大大降低了成本。有研究表明Cu²⁺能通过与壳聚糖的N原子之间形成N→Cu²⁺配位键而吸附于交联壳聚糖树脂，因此利用Cu²⁺和壳聚糖酶与交联壳聚糖树脂之间的竞争性结合即达到洗脱目的。交联壳聚糖树脂可用浓度低于1％的醋酸或1mmol/L的EDTA再生。

本发明的上述方法将亲和层析和凝胶过滤层析相结合，能得到电泳纯的壳聚糖酶，活力回收率达45％。

以下结合附图所示的试验结果，通过若干实例的具体实施方式，再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

壳聚糖酶SDS-PAGE图谱：1为粗酶液，2为亲和层析穿透峰，3为亲和层析洗脱液，4为分子筛层析收集的壳聚糖酶，5为低分子量蛋白标准

具体实施方式

实例1：(1)球孢白僵菌发酵液离心除去菌丝体，收集上清得到粗酶液。(2)交联壳聚糖树脂制备：将2.5％壳聚糖盐酸溶液用注射器注入凝结液(20％NaOH、30％甲醇混合均匀)，得白色空心球，用水洗至中性后用丙酮洗涤，50℃真空干燥。将上述方法所得干燥品置于戊二醛溶液中，磁力搅拌4小时后用水和丙酮反复洗涤除去戊二醛，最后50℃真空干燥即得交联的珠状壳聚糖树脂。(3)交联壳聚糖树脂装柱，取粗酶液100ml上样，再用20mmol/L醋酸缓冲液洗至无蛋白流出。(4)以4‰的Cu²⁺、25ml/h的流速洗脱8小时。(5)收集洗脱液透析浓缩后以Superdex 75分离，收集活性峰。(6)交联壳聚糖树脂用1％醋酸再生。得到电泳纯的壳聚糖酶，回收率为45.32％。

实例2：(1)球孢白僵菌发酵液离心除去菌丝体，收集上清得到粗酶液。(2)交联壳聚糖树脂制备：将2.5％壳聚糖盐酸溶液用注射器注入凝结液(20％NaOH、30％甲醇混合均匀)，得白色空心球，用水洗至中性后用丙酮洗涤，50℃真空干燥。将上述方法所得干燥品置于戊二醛溶液中，磁力搅拌4小时后用水和丙酮反复洗涤除去戊二醛，最后50℃真空干燥即得交联的珠状壳聚糖树脂。(3)交联壳聚糖树脂装柱，取粗酶液100ml上样，再用25mmol/L醋酸缓冲液洗至无蛋白流出。(4)以5‰的Cu²⁺、25ml/h的流速洗脱10小时。(5)收集洗脱液透析浓缩后以Superdex 75分离，收集活性峰。(6)交联壳聚糖树脂用1mmol/L EDTA再生。得到电泳纯的壳聚糖酶，回收率为46.55％。

实例3：(1)球孢白僵菌发酵液离心除去菌丝体，收集上清得到粗酶液。(2)交联壳聚糖树脂制备：将2.5％壳聚糖盐酸溶液用注射器注入凝结液(20％NaOH、30％甲醇混合均匀)，得白色空心球，用水洗至中性后用丙酮洗涤，50℃真空干燥。将上述方法所得干燥品置于戊二醛溶液中，磁力搅拌4小时后用水和丙酮反复洗涤除去戊二醛，最后50℃真空干燥即得交联的珠状壳聚糖树脂。(3)交联壳聚糖树脂装柱，取粗酶液100ml上样，再用20mmol/L醋酸缓冲液洗至无蛋白流出。(4)以3‰的Cu²⁺、25ml/h的流速洗脱8小时。(5)收集洗脱液透析浓缩后以Superdex 75分离，收集活性峰。(6)交联壳聚糖树脂用1mmol/L EDTA再生。得到电泳纯的壳聚糖酶，收率为43.63％。

壳聚糖酶活力测定采用PMAB法。用盐酸氨基葡萄糖(GlcN-HCl)溶液做标准曲线。一个酶活力单位定义为每分钟释放1μg GlcN-HCl还原糖所需要的酶量。

Claims

1.壳聚糖酶的分离纯化工艺，用交联壳聚糖树脂亲和层析进行分离纯化。其特征在于将产壳聚糖酶真菌发酵液离心得粗酶液，经交联壳聚糖树脂亲和吸附，以缓冲液洗至无蛋白流出，再以一定浓度的Cu²⁺洗脱，洗脱液透析浓缩后用凝胶过滤层析进行分离，获得电泳纯的壳聚糖酶。交联壳聚糖树脂用醋酸或EDTA再生。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶的分离纯化工艺，其特征在于可用于产壳聚糖酶真菌发酵液或粗酶提取液中壳聚糖酶的分离纯化。

3.如权利要求1所述的壳聚糖酶的分离纯化工艺，其特征在于直接用交联壳聚糖树脂进行亲和层析。

4.如权利要求1所述的壳聚糖酶的分离纯化工艺，其特征在于用Cu²⁺作为亲和层析的洗脱液。

5.如权利要求1所述的壳聚糖酶的分离纯化工艺，其特征在于洗脱用Cu²⁺的浓度为1-5‰。