CN101921346B - 一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，包括步骤：将香菇菌丝体粉碎后通过脱脂，室温水提生物活性多糖、去蛋白、透析除盐、径向流色谱纯化和冷冻干燥；其中，径向流色谱纯化中所用洗脱液为Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液中的一种；所用阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶。该分离方法不影响香菇菌丝体多糖天然结构及分离效果，得到的香菇菌丝体多糖含量高且保留了其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料；且工艺简短，能耗小，成本低，从而确保稳定、快速的多糖分离，便于工业化生产。

Description

一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法

技术领域

本发明涉及多糖的色谱分离技术领域，具体涉及一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法。

背景技术

香菇(Lentinula edodes)为担子菌纲白蘑科真菌，是世界名贵食用菌兼药用菌之一。香菇内含丰富的活性多糖，现代科学研究证明，香菇多糖是一种非特异免疫刺激剂，具有抑制肿瘤、抗病毒、抗氧化和增强免疫力等多方面的活性功能，且无任何毒副作用。

采用深层发酵所得香菇菌丝体提取多糖，产量大，周期短，易控制，便于工业化生产。目前多糖的分级纯化采用传统的轴流式柱中DEAE-纤维素(即：二乙氨乙基纤维素)吸附、洗脱的层析法，存在产品产量低，耗时长、分离效率低、压降大、中试放大困难等缺点，一直是限制香菇多糖产业化开发和菌业精深加工发展的技术瓶颈问题。总之，国内对食药用菌多糖的提取分离研究虽然已有一定规模和历史，但多停留在低水平重复和小规模试验阶段，创新性技术很少，未能真正使多糖的分离在工业化生产中得以大规模的应用。

为了解决上述问题，中国发明专利ZL 02138962.4中公开了一种香菇菌多糖的分离纯化工艺，该工艺采用一定分子量的超滤膜对香菇菌多糖进行分离，但由于膜包在分离过程中容易阻塞，且操作压力大，能耗高，不适于工业化生产。申请号为CN200610116956.3的中国发明专利申请中公开了一种香菇多糖的分离纯化方法，该方法提供一种在层析柱中不易堵塞，可批量生产的香菇多糖分离方法，但实际操作流速缓慢，不易线性放大。中国发明专利ZL 200510017261.5中公开了一种分离香菇多糖和香菇菌多糖的方法，该方法采用聚乙二醇沉淀多糖，虽可简化流程，降低成本，但多糖得率较低，仍不能满足大规模的需求。

径向流色谱法(Radical Flow Chromatography，RFC)是近些年发展起来的新型色谱分离技术，它采用了径向流动技术，流动相携带样品沿径向迁移，不同于传统轴向色谱柱的流体在柱内从一端流向另一端。在径向柱中，流动相和样品可以从色谱柱的周围流向柱圆心，也可以从柱圆心流向柱周围。它的主要特点是：(一)反压降较低，在相同的体积流速下，尤其适当体积流速较高时，径向流色谱柱的柱压比传统轴向柱的柱压低得多；较低的反压降，使径向流色谱可采用较高的流动相速度，从而样品出峰较快，同时对设备的要求也较低。(二)便于线性放大，由于特殊的径向流流动设计，在只增加柱长、保持色谱柱直径不变的情况下，即可线性增大样品处理量，即样品处理规模可在保持相似色谱条件下直接放大，各组分保留时间及分辨情况基本相同。(三)分离效率高，为样品流动提供了较大的横截面积，更高的体积流速，而且使样品在柱内暴露时间短，不仅有利于生物活性物质快速分离纯化，而且能提高样品的回收率和最终产物的浓度。

张正光等用径向阳离子交换柱从CL-CDl细胞培养上清液中分离纯化尿激酶原。分离结果表明，PRO-UK的活性提高了44.3倍，蛋白质含量下降了98％以上，体积缩小至1/7，回收率达87.7％(军事医学科学学院院刊，1997，2(21)：47-50)。郭立安等人利用径向离子交换色谱技术从促性腺激素的粗提物中分离纯化了促卵泡激素，得到很好的分离结果，同时比较了径向离子交换色谱于经典离子交换色谱在纯化工艺放大过程中的分离效果，证实径向流色谱比经典色谱更适合于促卵泡激素的纯化，并建立了适合大规模纯化的新工艺(色谱，2000，18(6)：577-579)。刘国诠利用CM径向柱分离小牛血清的结果是经SDSPAGE证实，所分离的牛血清白蛋白基本为纯品，总蛋白回收率大于90％；同时，他将牛血清上样品增加6倍后，所得分离结果几乎完全相同(生物工程下游技术，1993)。孙涛等用膜径向离子交换色谱分离凝血酶原复合物，该方法将流速从3ml/min提高到20ml/min，且保持分离物质的生物活性(色谱，2000，18(4)：350-352)。Gustavsson等采用琼脂糖型连续床层亲和径向色谱柱分离乳酸脱氢酶，他们首次将凝胶填料直径从10μm放大到60mm，而不影响分离效果(Per-Erik Gustavsson and Per-Olof Larsson，Journal of ChromatographyA，2001)。但径向色谱在多糖类产品的分离中尚未应用。

发明内容

本发明提供了一种快速、高效的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，该分离方法不影响香菇菌丝体多糖天然结构及分离效果，得到的香菇菌丝体多糖含量高且保留了其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料。

一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，包括步骤：

(1)脱脂：将香菇菌丝体粉末用乙醇浸没进行脱脂，过滤得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末；

(2)超声辅助水提：将上述脱脂后香菇菌丝体粉末加入蒸馏水中形成料液，经超声波提取、离心，所得上清液浓缩后加入乙醇，冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖；

(3)去蛋白：将上述香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液，剧烈混合后，离心除去蛋白，得到水提液；

(4)透析：将上述水提液装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，收集透析袋中的液体，得到香菇菌丝体多糖液；

(5)径向流色谱纯化：将上述香菇菌丝体多糖液用洗脱液配成溶液，离心后取上清液，将上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，每至多15mL收集一次(优选每6mL～10mL收集一次)，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到第一组分和第二组分；第一组分的分子量一般为120000Da～140000Da，第二组分的分子量一般为160000Da～170000Da；

其中，所述的洗脱液选用pH6.5～8.5的Tris-盐酸缓冲液、pH6.8～9.0巴比妥-盐酸缓冲液、pH6.0～8.0的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中的一种。

所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的糖凝胶，可选用DEAE Sepharose FF、DEAE-32、DEAE-52、DEAE-Sephacel等通用市售填料中的一种，如GE公司的阴离子交换填料DEAE系列。

(6)冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析，再经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。

本发明分离得到的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖均为中性多糖。

所述的Tris-盐酸缓冲液即三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照2005年版《中国药典》。

所述的磷酸盐缓冲液和巴比妥-盐酸缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照2005年版《中国药典》。

为了达到更好地分离效果，优选：

步骤(1)中，所述的香菇菌丝体粉末为过50～120目筛的粉末；

所述的脱脂温度为15℃～35℃，脱脂时间为20h～30h。

步骤(1)的脱脂过程重复的次数为1次～3次。

步骤(2)中，所述的脱脂后香菇菌丝体粉末的克数与蒸馏水的毫升数之比为1∶5～20。

所述的超声波提取的温度为50℃～80℃，功率为8KHz～20KHz，时间为0.5h～2h。

所述的离心的条件为在3000转/分钟(rpm)～5000转/分钟的转速下离心10min～30min。

所述的上清液浓缩至料液体积的0.3倍～0.8倍，得到浓缩液，加入浓缩液体积3倍～5倍的乙醇，于0℃～4℃冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖。

步骤(3)中，所述的氯仿与正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为3～5∶1；

所述的离心条件为在3000转/分钟～5000转/分钟的转速下离心10min～30min；

步骤(3)的去蛋白过程重复的次数为3次～6次。

步骤(5)中，所述的装有阴离子交换填料的径向流色谱柱是将阴离子交换填料用洗脱液浸泡2h～4h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为15％～35％的填料液，将填料液按10mL/min～30mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡50mL～150mL而制得的。所述的径向流色谱柱可选用市售常用规格的径向流色谱柱，如容积为50mL、250mL、1L等的径向流色谱柱。

步骤(5)中，所述的溶液的浓度为5mg/mL～30mg/mL。

步骤(5)中，所述的离心的条件为在5000转/分钟～9000转/分钟的转速下离心5min～15min。

步骤(5)中，所述的上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱的速度为1mL/min～5mL/min；所述的上清液的总量为5mL～20mL。

步骤(5)中，以0～0.5mol/L的洗脱液进行线性梯度洗脱，流速为5mL/min～15mL/min。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明方法将香菇菌丝体粉碎后通过脱脂，水提生物活性多糖、去蛋白、透析除盐、径向流柱层析和冷冻干燥，能够得到纯度高的香菇菌丝体多糖；2.采用本发明方法分离香菇菌丝体多糖，具有操作压力低(不超过0.1Mpa)，流速高、线性放大容易，而且样品处理量大等特点；3.本发明方法在不影响分离效率的前提下，具有色谱分离操作时间短(一般只需0.5～1.5h)，从而有利于提高香菇菌丝体多糖生物活性，增加回收率和确保多糖含量，符合针剂等保健行业的生产要求，提高了名贵食药用菌香菇的综合利用率和附加值；4.采用径向流色谱分离到的多糖组分与传统轴向色谱的结果相同，多糖质量稳定，损失小，工艺简短，能耗小，成本低，从而确保稳定、快速的多糖分离，便于工业化生产；5.本发明分离方法还适用其他菇类菌丝体。

附图说明

图1为实施例1径向流色谱纯化中的洗脱曲线；

图2为实施例1中第二香菇菌丝体多糖的HPLC图谱；

图3为实施例1中第一香菇菌丝体多糖的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中径向流色谱纯化的仪器和试剂为：径向流色谱柱(容积50ml，内环直径8.46cm，外环直径1.9cm，高度3.28cm，美国Sepragen公司)、恒流泵(YZ1515X，保定兰格恒流泵有限公司)、烧杯；阴离子交换填料DEAE系列(GE公司)、香菇菌丝体(浙江益圣菌物发展有限公司提供)、Tris-盐酸缓冲液、PBS缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液均为分析纯。

实施例1：

1、脱脂：取干燥香菇菌丝体，粉碎，过50目筛，将过50目筛的粉末放入1000ml烧杯中，加入无水乙醇，搅拌至粉末被完全浸没，室温下脱脂24h。过滤除去黄褐色上清液，滤渣中再加入无水乙醇，室温下重复脱脂24h，过滤除去黄褐色上清液，得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末。

2、超声辅助水提：在步骤1所得的脱脂后香菇菌丝体粉末中加入蒸馏水形成料液，按1g脱脂后香菇菌丝体粉末加15mL蒸馏水的料液比加入，50℃下用8KHz超声波提取2.0h，以3000rpm的转速离心15min，上清液45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至料液体积的0.5倍，得到浓缩液，再逐渐加入浓缩液体积4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖。

3、去蛋白：将步骤2所得的香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液(体积比为4∶1)，剧烈混合后，以3000rpm的转速离心10min，除去蛋白，得到清液；将清液溶于蒸馏水中，重复上述去蛋白操作3次，得到清液即水提液。

4、透析：将步骤3所得水提液用透析袋(MW6000)在流水中透析48h，再用去离子水透析24h，进一步去除小分子低聚糖、色素等杂质，收集香菇菌丝体多糖液。

5、径向流色谱纯化：

(1)装柱：将阴离子交换填料DEAE-52用pH6.5的Tris-盐酸缓冲液浸泡2h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为15％的填料液，将填料液按30mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡50mL，得到装有阴离子交换填料的径向流色谱柱。

(2)上样：将步骤4中香菇菌丝体多糖液用pH6.5的Tris-盐酸缓冲液配成5mg/mL的溶液，5000rpm离心15min，取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为5mL/min，上样量为20mL。

(3)洗脱：上样后，以0～0.5mol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH6.5)进行线性梯度洗脱，流速为15mL/min，收集洗脱液，每10mL收集一次，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，如图1，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为128000Da的第一组分和分子量为163000Da的第二组分。

整个径向流色谱纯化仅用时55min，且经抗肿瘤活性试验显示第二组分具有较好的抗肿瘤活性。

6、冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析24h，经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。苯酚-硫酸法检测中性多糖回收率达85.2％。

实施例2：

1、脱脂：取干燥香菇菌丝体，粉碎，过120目筛，将过120目筛的粉末放入1000ml烧杯中，加入无水乙醇，搅拌至粉末被完全浸没，室温下脱脂24h。过滤除去黄褐色上清液，滤渣中再加入无水乙醇，室温下重复脱脂24h，过滤除去黄褐色上清液，得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末。

2、超声辅助水提：在步骤1所得的脱脂后香菇菌丝体粉末中加入蒸馏水形成料液，按1g脱脂后香菇菌丝体粉末加5mL蒸馏水的料液比加入，80℃下用20KHz超声波提取0.5h，以5000rpm的转速离心30min，上清液45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至料液体积的0.5倍，得到浓缩液，再逐渐加入浓缩液体积4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖。

3、去蛋白：将步骤2所得的香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液(体积比为4∶1)，剧烈混合后，以5000rpm的转速离心30min，除去蛋白，得到清液；将清液溶于蒸馏水中，重复上述去蛋白操作6次，得到清液即水提液。

4、透析：将步骤3所得水提液用透析袋(MW6000)在流水中透析48h，再用去离子水透析24h，进一步去除小分子低聚糖、色素等杂质，收集香菇菌丝体多糖液。

5、径向流色谱纯化：

(1)装柱：将阴离子交换填料DEAE-32用pH8.5的巴比妥-盐酸缓冲液浸泡2h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为35％的填料液，将填料液按10mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡150mL，得到装有阴离子交换填料的径向流色谱柱。

(2)上样：将步骤4中香菇菌丝体多糖液用pH8.5的巴比妥-盐酸缓冲液配成30mg/mL的溶液，9000rpm离心15min，取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为1mL/min，上样量为5mL。

(3)洗脱：上样后，以0～0.5mol/L的巴比妥-盐酸缓冲液(pH8.5)进行线性梯度洗脱，流速为5mL/min，收集洗脱液，每10mL收集一次，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为129000Da的第一组分和分子量为165000Da的第二组分。

整个径向流色谱纯化仅用时68min，且经抗肿瘤活性试验显示第二组分具有较好的抗肿瘤活性。

6、冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析透析24h，经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。苯酚-硫酸法检测中性多糖回收率达83.3％。

实施例3：

1、脱脂：取干燥香菇菌丝体，粉碎，过80目筛，将过80目筛的粉末放入1000ml烧杯中，加入无水乙醇，搅拌至粉末被完全浸没，室温下脱脂24h。过滤除去黄褐色上清液，滤渣中再加入无水乙醇，室温下重复脱脂24h，过滤除去黄褐色上清液，得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末。

2、超声辅助水提：在步骤1所得的脱脂后香菇菌丝体粉末中加入蒸馏水形成料液，按1g脱脂后香菇菌丝体粉末加10mL蒸馏水的料液比加入，65℃下用15KHz超声波提取1.0h，以4000rpm的转速离心20min，上清液45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至料液体积的0.5倍，得到浓缩液，再逐渐加入浓缩液体积4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖。

3、去蛋白：将步骤2所得的香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液(体积比为4∶1)，剧烈混合后，以4000rpm的转速离心20min，除去蛋白，得到清液；将清液溶于蒸馏水中，重复上述去蛋白操作4次，得到清液即水提液。

4、透析：将步骤3所得水提液用透析袋(MW6000)在流水中透析48h，再用去离子水透析24h，进一步去除小分子低聚糖、色素等杂质，收集香菇菌丝体多糖液。

5、径向流色谱纯化：

(1)装柱：将阴离子交换填料DEAE Sepharose FF用pH7.8的Tris-盐酸缓冲液浸泡3h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为25％的填料液，将填料液按25mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡100mL，得到装有阴离子交换填料的径向流色谱柱。

(2)上样：将步骤4中香菇菌丝体多糖液用pH7.8的Tris-盐酸缓冲液配成15mg/mL的溶液，8000rpm离心10min，取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为3mL/min，上样量为10mL。

(3)洗脱：上样后，以0～0.5mol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH7.8)进行线性梯度洗脱，流速为10mL/min，收集洗脱液，每10mL收集一次，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为131000Da的第一组分和分子量为162000Da的第二组分。

整个径向流色谱纯化仅用时52min，且经抗肿瘤活性试验显示第二组分具有较好的抗肿瘤活性。

6、冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析透析24h，经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。苯酚-硫酸法检测中性多糖回收率达87.1％。

实施例4：

1、脱脂：取干燥香菇菌丝体，粉碎，过60目筛，将过60目筛的粉末放入1000ml烧杯中，加入无水乙醇，搅拌至粉末被完全浸没，室温下脱脂24h。过滤除去黄褐色上清液，滤渣中再加入无水乙醇，室温下重复脱脂24h，过滤除去黄褐色上清液，得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末。

2、超声辅助水提：在步骤1所得的脱脂后香菇菌丝体粉末中加入蒸馏水形成料液，按1g脱脂后香菇菌丝体粉末加15mL蒸馏水的料液比加入，70℃下用10KHz超声波提取1.0h，以3500rpm的转速离心12min，上清液45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至料液体积的0.5倍，得到浓缩液，再逐渐加入浓缩液体积4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖。

3、去蛋白：将步骤2所得的香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液(体积比为4∶1)，剧烈混合后，以3500rpm的转速离心12min，除去蛋白，得到清液；将清液溶于蒸馏水中，重复上述去蛋白操作5次，得到清液即水提液。

4、透析：将步骤3所得水提液用透析袋(MW6000)在流水中透析48h，再用去离子水透析24h，进一步去除小分子低聚糖、色素等杂质，收集香菇菌丝体多糖液。

5、径向流色谱纯化：

(1)装柱：将阴离子交换填料DEAE Sephacel用pH7.5的PBS缓冲液浸泡2h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为20％的填料液，将填料液按18mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡100mL，得到装有阴离子交换填料的径向流色谱柱。

(2)上样：将步骤4中香菇菌丝体多糖液用pH7.5的PBS缓冲液配成12mg/mL的溶液，6500rpm离心10min，取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为2.5mL/min，上样量为10mL。

(3)洗脱：上样后，以0～0.5mol/L的PBS(pH7.5)进行线性梯度洗脱，流速为6.5mL/min，收集洗脱液，每10mL收集一次，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为125000Da的第一组分和分子量为168000Da的第二组分。

整个径向流色谱纯化仅用时75min，且经抗肿瘤活性试验显示第二组分具有较好的抗肿瘤活性。

6、冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析透析24h，经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。苯酚-硫酸法检测中性多糖回收率达86.2％。

实施例5：

1、脱脂：取干燥香菇菌丝体，粉碎，过100目筛，将过100目筛的粉末放入1000ml烧杯中，加入无水乙醇，搅拌至粉末被完全浸没，室温下脱脂24h。过滤除去黄褐色上清液，滤渣中再加入无水乙醇，室温下重复脱脂24h，过滤除去黄褐色上清液，得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末。

2、超声辅助水提：在步骤1所得的脱脂后香菇菌丝体粉末中加入蒸馏水形成料液，按1g脱脂后香菇菌丝体粉末加8mL蒸馏水的料液比加入，70℃下用15KHz超声波提取1.0h，以4000rpm的转速离心10min，上清液45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至料液体积的0.5倍，得到浓缩液，再逐渐加入浓缩液体积4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖。

3、去蛋白：将步骤2所得的香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液(体积比为4∶1)，剧烈混合后，以4000rpm的转速离心10min，除去蛋白，得到清液；将清液溶于蒸馏水中，重复上述去蛋白操作5次，得到清液即水提液。

4、透析：将步骤3所得水提液用透析袋(MW6000)在流水中透析48h，再用去离子水透析24h，进一步去除小分子低聚糖、色素等杂质，收集香菇菌丝体多糖液。

5、径向流色谱纯化：

(1)装柱：将阴离子交换填料DEAE-52用pH7.0的Tris-盐酸缓冲液浸泡2.5h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为25％的填料液，将填料液按15mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡100mL，得到装有阴离子交换填料的径向流色谱柱。

(2)上样：将步骤4中香菇菌丝体多糖液用pH7.0的Tris-盐酸缓冲液配成10mg/mL的溶液，6000rpm离心8min，取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为4mL/min，上样量为16mL。

(3)洗脱：上样后，以0～0.5mol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)进行线性梯度洗脱，流速为12mL/min，收集洗脱液，每10mL收集一次，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为13000Da的第一组分和分子量为166000Da的第二组分。

整个径向流色谱纯化仅用时77min，且经抗肿瘤活性试验显示第二组分具有较好的抗肿瘤活性。

6、冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析透析24h，经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。苯酚-硫酸法检测中性多糖回收率达85.4％。

Claims (5)

1.一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，包括步骤：

(1)脱脂：将香菇菌丝体粉末用乙醇浸没进行脱脂，过滤得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末；

(2)超声辅助水提：将上述脱脂后香菇菌丝体粉末加入蒸馏水中形成料液，经超声波提取、离心，所得上清液浓缩后加入乙醇，冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖；

(3)去蛋白：将上述香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液，剧烈混合后，离心除去蛋白，得到水提液；

(4)透析：将上述水提液装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，收集透析袋中的液体，得到香菇菌丝体多糖液；

(5)径向流色谱纯化：将上述香菇菌丝体多糖液用洗脱液配成溶液，离心后取上清液，将上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，每至多15mL收集一次，用苯酚-硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为120000Da～140000Da的第一组分和分子量为160000Da～170000Da的第二组分；

其中，所述的洗脱液为pH6.5～8.5的Tris-盐酸缓冲液、pH6.8～9.0巴比妥-盐酸缓冲液、pH6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中的一种；

所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶；

(6)冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析，再经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖；

步骤(1)中，所述的香菇菌丝体粉末为过50～120目筛的粉末；

所述的脱脂温度为15℃～35℃，脱脂时间为20h～30h；

步骤(1)的脱脂过程重复的次数为1次～3次；

步骤(2)中，所述的超声波提取的温度为50℃～80℃，功率为8KHz～20KHz，时间为0.5h～2h；

所述的离心的条件为在3000转/分钟～5000转/分钟的转速下离心10min～30min；

所述的上清液浓缩至料液体积的0.3倍～0.8倍，得到浓缩液，加入浓缩液体积3倍～5倍的乙醇，于0℃～4℃冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖；

步骤(3)中，所述的氯仿与正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为3～5∶1；

所述的离心条件为在3000转/分钟～5000转/分钟的转速下离心10min～30min；

步骤(3)的去蛋白过程重复的次数为3次～6次；

步骤(5)中，所述的装有阴离子交换填料的径向流色谱柱是将阴离子交换填料用洗脱液浸泡2h～4h，配制成阴离子交换填料的克数与洗脱液的毫升数的百分比为15％～35％的填料液，将填料液按10mL/min～30mL/min的流速装入径向流色谱柱内，用顺时针和逆时针各平衡50mL～150mL而制得的；

步骤(5)中，所述的溶液的浓度为5mg/mL～30mg/mL。

2.根据权利要求1所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的脱脂后香菇菌丝体粉末的克数与蒸馏水的毫升数之比为1∶5～20。

3.根据权利要求1所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的离心的条件为在5000转/分钟～9000转/分钟的转速下离心5min～15min。

4.根据权利要求1所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱的速度为1mL/min～5mL/min；

所述的上清液的总量为5mL～20mL。

5.根据权利要求1所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步骤(5)中，以0～0.5mol/L的洗脱液进行线性梯度洗脱，流速为5mL/min～15mL/min。

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