CN102649824B - 应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,包括如下步骤:1)黑木耳热水浸提;2)将黑木耳多糖提取液浓缩后加入Savag试剂,震荡离心;3)在去除蛋白的多糖水溶液中加入体积浓度≥95%的乙醇进行醇沉,所得的沉淀进行清洗;4)将含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖冷冻干燥;5)将冻干后的黑木耳粗多糖溶于蒸馏水中,得样品溶液;将样品溶液泵入径向色谱仪,选用DEAE-52纤维素作为填料;分别用蒸馏水以及浓度为0.2M的NaCl溶液进行洗脱; 6)收集浓度为0.2M的NaCl溶液所对应的洗脱液,依次经透析、浓缩、干燥,得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品开发技术领域,涉及功能性食品活性成分多糖的分离纯化方法和黑木耳的利用,特别是一种从黑木耳中分离制备具有抗肿瘤活性多糖的方法。
背景技术
黑木耳是一种营养丰富的食用菌,不仅具有显著的抗凝和阻止胆固醇在血管上的沉积,防止血栓形成的作用,而且我国中医证实黑木耳具有很好的抗肿瘤效果,根据文献报道黑木耳的抗肿瘤效果与存在的黑木耳多糖具有很大关系。目前黑木耳多糖的分离方法主要是采用柱层析色谱(轴色谱)方法,采用径向色谱分离具有抗肿瘤的作用的黑木耳多糖未见文献报道。
现有的关于抗肿瘤活性多糖的方法主要是采用柱层析色谱方法,其局限是分离效率低、分离速度慢,其次,柱层析色谱方法大批量制备较困难。
现有的黑木耳多糖,其结构式为:
其存在的缺陷主要为:对抗结肠癌活性不明显,只有一定的清除自由基活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种分离效率高、分离速度快的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,包括如下步骤:
1)、将黑木耳放入65~70℃热水中保温浸提160~200 min,得黑木耳多糖提取液;
2)、将黑木耳多糖提取液浓缩,得浓缩液;浓缩液中碳水化合物的含量为2.5~3.0mg/ml;
在浓缩液中加入占浓缩液体积40~60%的Savag试剂,震荡离心(例如为3000rpm离心15~20min)后,所得的上清液为去除蛋白的多糖水溶液;
3)、在去除蛋白的多糖水溶液中加入体积浓度≥95%的乙醇进行醇沉,得沉淀;体积浓度≥95%的乙醇是去除蛋白的多糖水溶液体积的1.8~2.2倍;
将沉淀用体积浓度≥95%的乙醇进行清洗(例如清洗两次);得含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖;
4)、将含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖冷冻干燥,得冻干后的黑木耳粗多糖;
5)、将冻干后的黑木耳粗多糖按照1g/15~20ml的料液比溶于蒸馏水中,得样品溶液;
将样品溶液泵入径向色谱仪,样品溶液的上样量为25~50ml;选用DEAE-52纤维素作为填料;分别用以下2种洗脱剂进行洗脱:蒸馏水和浓度为0.2M的 NaCl溶液,流速均为7.5~8.5ml/min,每种洗脱剂的洗脱时间55~65min;
6)、收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液,依次经透析、浓缩、干燥,得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖。
作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的改进: Savag试剂由氯仿:正丁醇=3:0.9~1.1的体积比混合而得。
作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进:步骤6)为:收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液,用截留分子量为7000~9000Da的半透膜透析20~28h,再用旋转蒸发仪浓缩,直至所得的浓缩液为原体积的10%~12%;再冷冻干燥至恒重。
作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进:
步骤1)的浸提中:黑木耳与热水的料液比为:1g/20~25ml;
步骤2)的浓缩为用旋转蒸发仪浓缩。
作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进:所述步骤2)和步骤6)的旋转蒸发仪浓缩均为:真空度≤110Pa,温度为39~42℃;
步骤4)和步骤6)的冷冻干燥的真空度≤80Pa,温度为-45~ -55℃。
作为本发明的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法的进一步改进:步骤4)和步骤6)的冷冻干燥前,先于-70~ -80℃快速冷冻3.5~4.5h。
本发明还同时提供了上述方法分离而得的黑木耳多糖,其结构式为:
采用本发明方法分离所得的具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖粉末,纯度达93%以上。
本发明的步骤1)的浸提,为了提高得率,步骤1)的浸提次数1~3次,即,可对滤渣进行反复浸提。
在本发明的步骤2)中,较佳为:在浓缩液加入占浓缩液体积50%的Savag试剂, Savag试剂为氯仿:正丁醇=3:1(v/v)。
在本发明的步骤3)中,较佳的醇沉时间为≥120分钟。
在本发明的步骤5)中,开启径向色谱仪和流动相输液泵,将充分溶解的粗多糖溶液(即样品溶液)和流动相输入径向色谱仪;用薄层层析法检测径向色谱流出液,根据所得的色谱图收集抗肿瘤多糖(即黑木耳多糖),即用薄层层析方法检测洗脱组分,收集合并具有抗肿瘤活性的多糖。
本发明所得的黑木耳多糖对结肠癌具有很好治疗效果,其使用方式和用量等同于现有的黑木耳多糖。
本发明结构式的黑木耳多糖相对于现有的黑木耳多糖而言,具有如下优点:
1、本发明所分离得到的多糖对结肠癌COLO205和HCT-15细胞的抑制率分别达到97.26%和98.72%。
2、本发明分离得到的多糖对结肠癌细胞的抑制率与剂量呈一定的量效关系。
3、本发明分离得到的多糖副作用不明显,给药组与对照组的血象、肝肾功能无显著性差异。
本发明的从黑木耳中分离黑木耳多糖的方法与现有的柱层析色谱(轴色谱)分离黑木耳多糖的方法相比,具有以下优点:
1、得率高,1kg黑木耳可得到400mg左右纯度≥93%的黑木耳多糖;
2、分离速度快,对于25~35ml进样量的样品溶液,整个步骤5)的分离只需120分钟左右;而现有分离法一般需要240~300分钟。
3、本发明的分离方法可以线性放大,方便工业化生产。
4、本发明的分离方法成本较低。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的工艺流程图。
图2为实施例1的洗脱曲线;
峰1和峰2分别代表用蒸馏水和0.2M NaCl洗脱的洗脱峰。
图3为本发明所得的黑木耳多糖的分子式。
具体实施方式
实施例1、一种应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,依次进行如下步骤:
1)、将1000g黑木耳放入25000ml温度为65~70℃热水中保温浸提180min,得黑木耳多糖提取液。
2)、将黑木耳多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩(100Pa,40℃),得浓缩液;浓缩液中碳水化合物的含量为2.8mg/ml;可采用苯酚-硫酸比色法检测浓缩液中碳水化合物的含量;
在浓缩液加入占浓缩液体积50%的Savag试剂,反复震荡,然后3000rpm离心15min,从而除去蛋白沉淀,得到上清液为去除蛋白的多糖水溶液;
Savag试剂为氯仿:正丁醇=3:1(v/v)。
3)、在去除蛋白的多糖水溶液中加入2倍体积的95%(为体积浓度)的乙醇进行醇沉(醇沉时间约为120分钟),得沉淀;
将所述沉淀用95%(体积浓度)的乙醇进行清洗两次(每次的用量为100ml);得含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖;
4)、将含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖放于-80℃的超低温冰箱中迅速冷冻,冷冻4h后,再用冷冻干燥仪进行冻干(即于-45℃冷冻干燥至恒重,真空度80Pa);得10.8g冻干后的黑木耳粗多糖。
5)、称取冻干后的黑木耳粗多糖1.5g溶于30ml蒸馏水中,得样品溶液;
选用的径向色谱仪为SepraPrep S,美国Sepragen公司生产。
选用DEAE-52纤维素作为填料(即DEAE-52纤维素的体积约为500ml)。分别用以下2种洗脱剂作为流动相进行洗脱:蒸馏水和浓度为0.2M的NaCl溶液。
将上述样品溶液全部泵入上述径向色谱仪,待样品溶液全部进入填料(DEAE-52纤维素)后,开始泵入流动相,流动相泵入的顺序依次为蒸馏水、浓度为0.2M的 NaCl溶液,流速均为8.0ml/min,每种流动相洗脱60min,收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱部分。
6)、将所收集的浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液用截留分子量为8000Da的半透膜透析24h,再用旋转蒸发仪浓缩(110Pa,42℃)至原体积的10%,然后放入-80℃的超低温冰箱冷冻4h,再转移至冷冻干燥器中冷冻干燥(即于-45℃冷冻干燥至恒重,真空度80Pa),得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖53.26mg,纯度达97%以上。黑木耳多糖的结构式为:
实施例2、一种应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,依次进行如下步骤:
1)、将500g黑木耳放入10000ml温度为70℃热水中保温浸提180 min,得黑木耳多糖提取液。
2)、将黑木耳多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩(100Pa,40℃),得浓缩液;浓缩液中碳水化合物的含量为3.0mg/ml;采用苯酚-硫酸比色法检测浓缩液中碳水化合物的含量;
在浓缩液加入占浓缩液体积50%的Savag试剂,反复震荡,然后3000rpm离心20min,从而除去蛋白沉淀,得到上清液为去除蛋白的多糖水溶液;
Savag试剂为氯仿:正丁醇=3:1(v/v)。
3)、在去除蛋白的多糖水溶液中加入2倍体积的95%(体积浓度)的乙醇进行醇沉(醇沉时间约为120分钟),得沉淀;
将所述沉淀用95%(体积浓度)的乙醇进行清洗两次;得含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖;
4)、将含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖放于-75℃的超低温冰箱中迅速冷冻,冷冻4h后,再用冷冻干燥仪进行冻干(即于-50℃冷冻干燥至恒重,真空度80Pa);得5.5g冻干后的黑木耳粗多糖。
5)、称取冻干后的黑木耳粗多糖2.5g溶于40ml蒸馏水中,得样品溶液;
选用的径向色谱仪为SepraPrep S,美国Sepragen公司生产,选用DEAE-52纤维素作为填料(即DEAE-52纤维素的体积约为500ml)。分别用以下2种洗脱剂作为流动相进行洗脱:蒸馏水和浓度为0.2M的 NaCl溶液。
将上述样品溶液全部泵入上述径向色谱仪,待样品溶液全部进入填料(DEAE-52纤维素)后,开始泵入流动相,流动相泵入的顺序依次为蒸馏水、浓度为0.2M的 NaCl溶液,流速均为8.0ml/min,每种流动相洗脱60min,收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱部分。
6)、将所收集的浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液用截留分子量为8000Da的半透膜透析24h,再用旋转蒸发仪浓缩(100Pa,39℃)至原体积的10%,然后放入-70℃的超低温冰箱冷冻4h,再转移至冷冻干燥器中冷冻干燥(即于-45℃冷冻干燥至恒重,真空度80Pa),得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖86.52mg,纯度达95%以上。其结构式为:
实施例3、一种应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,依次进行如下步骤:
1)、将1500g黑木耳放入30000ml温度为70℃热水中浸提200 min,得黑木耳多糖提取液。
2)、将黑木耳多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩(100Pa,39℃),得浓缩液;浓缩液中碳水化合物的含量为2.5mg/ml;采用苯酚-硫酸比色法检测浓缩液中碳水化合物的含量;
在浓缩液加入占浓缩液体积50%的Savag试剂,反复震荡,然后3000rpm离心15min,从而除去蛋白沉淀,得到上清液为去除蛋白的多糖水溶液;
Savag试剂为氯仿:正丁醇=3:1(v/v)。
3)、在去除蛋白的多糖水溶液中加入2倍体积的为95%(体积浓度)的乙醇进行醇沉(醇沉时间约为120分钟),得沉淀;
将所述沉淀用95%(体积浓度)的乙醇进行清洗两次(每次的用量为300ml);得含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖;
4)、将含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖放于-80℃的超低温冰箱中迅速冷冻,冷冻4h后,再用冷冻干燥仪进行冻干(即于-45℃冷冻干燥至恒重,真空度80Pa);得16.1g冻干后的黑木耳粗多糖。
5)、称取冻干后的黑木耳粗多糖3.0g,溶于45ml蒸馏水中,得样品溶液;
选用的径向色谱仪为SepraPrep S,美国Sepragen公司生产,选用DEAE-52纤维素作为填料(即DEAE-52纤维素的体积为500ml)。分别用以下2种洗脱剂作为流动相进行洗脱:蒸馏水和浓度为0.2M的 NaCl溶液。
将上述样品溶液全部泵入上述径向色谱仪,待样品溶液全部进入填料(DEAE-52纤维素)后,开始泵入流动相,流动相泵入的顺序依次为蒸馏水、浓度为0.2M的 NaCl溶液,流速均为8.0ml/min,每种流动相洗脱60min,收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱部分。
6)、将所收集的浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液用截留分子量为8000Da的半透膜透析24h,再用旋转蒸发仪浓缩(110Pa,42℃)至原体积的12%,然后放入-80℃的超低温冰箱冷冻4h,再转移至冷冻干燥器中冷冻干燥(即于-45℃冷冻干燥至恒重,真空度80Pa),得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖108.36mg,纯度达98%以上。其结构式为:
实验1、将上述本发明所得的黑木耳多糖进行如下的抗肿瘤实验:
实验方法具体如下:
结肠癌COLO205和HCT-15细胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,取对数生长期细胞用于实验。
将处于对数生长期细胞接种于96孔微量培养板内,培养24 h待细胞贴壁后加入不同浓度的黑木耳多糖,每个浓度设3个复孔,并设相应浓度的溶媒(即不加样品,仅加相应体积的样品溶解液)对照及无细胞调零孔。药物与细胞在37℃、5% CO2条件下共孵育48小时后加入40μL0.5mg/ml的MTT溶液,置培养箱中反应4小时,弃去孔中培养基和MTT后加入150μL/孔的DMSO,震荡溶解生成的紫色结晶后立即用酶标仪在570nm和630nm波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值(OD值),测定波长为570nm,校正波长为630nm,所得值再减去空白的吸光度。按照公式(1-OD样品组/OD对照组)×100%计算肿瘤生长抑制率。
实验结果具体如下:
表1、 本发明分离的黑木耳多糖与人参多糖对结肠癌细胞抑制率的比较
通过实验表明黑木耳多糖对结肠癌COLO205和HCT-15细胞具有显著的抑制率,高浓度剂量组抑制率可达到97%以上,与人参多糖剂量组存在显著差异(P<0.05)。
实验2、本发明分离的多糖对小鼠的保护作用
取60只小鼠,接种COLO205瘤,采用实体瘤接种方法。小鼠按性别雌雄各半,随机分为5个组,即正常对照组、肿瘤对照组、多糖腹腔注射组(10 mg/kg./天)、人参多糖对照组(10 mg/kg./天)和环磷酰胺组,每组各为12只,适应环境3天,给予各药物组小鼠相应途径和剂量药物,共10天。检测各项指标。
实验结果分析:
表2、 黑木耳多糖对小鼠的保护作用
由上表可见,环磷酰胺组小鼠外周血白细胞及淋巴细胞数明显降低,与正常对照组比较均有显著性差异(P<0.01),黑木耳多糖腹腔注射组小鼠白细胞及淋巴细胞数明显高于环磷酰胺组,相比较均有显著性差异(P<0.05)。并且黑木耳多糖腹腔注射组比人参多糖组白细胞及淋巴细胞数明显偏高(P<0.05)。黑木耳多糖组的T-SOD值比肿瘤对照组明显升高(P<0.01),提示多糖可提高荷瘤小鼠血液中的SOD水平,MDA值比肿瘤对照组明显降低(P<0.001),显示多糖可降低氧自由基,使MDA水平明显降低,减少机体脂质过氧化损伤,对机体有保护作用。
对比实验1、将背景技术中所告知结构式的黑木耳多糖(为现有产物)如同实验1进行抗肿瘤实验,实验结果具体如下表3所述:
表3、 现有的多糖对结肠癌细胞抑制率
对比例1、将实施例1的步骤5)改成以下内容:
称取冻干后的黑木耳粗多糖1.5g溶于30ml蒸馏水中,得样品溶液;
选用柱层析色谱(轴色谱)方法,具体如下:
层析柱规格为Φ18×800mm,填料为DEAE-52,用蒸馏水和0.2mol/LNaCl进行洗脱,每种洗脱剂的洗脱时间120分钟,苯酚-硫酸比色法检测洗脱完成情况。
其余同实施例1,最终得50.8mg纯度为95%的黑木耳多糖(结构式同实施例1)。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,其特征是包括如下步骤:
1)、将黑木耳放入65~70℃热水中保温浸提160~200 min,得黑木耳多糖提取液;
2)、将所述黑木耳多糖提取液浓缩,得浓缩液;所述浓缩液中碳水化合物的含量为2.5~3.0mg/ml;
在所述浓缩液中加入占浓缩液体积40~60%的Savag试剂,震荡离心后,所得的上清液为去除蛋白的多糖水溶液;
3)、在所述去除蛋白的多糖水溶液中加入体积浓度≥95%的乙醇进行醇沉,得沉淀;所述体积浓度≥95%的乙醇是去除蛋白的多糖水溶液体积的1.8~2.2倍;
将所述沉淀用体积浓度≥95%的乙醇进行清洗;得含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖;
4)、将所述含有抗肿瘤活性的黑木耳粗多糖冷冻干燥,得冻干后的黑木耳粗多糖;
5)、将冻干后的黑木耳粗多糖按照1g/15~20ml的料液比溶于蒸馏水中,得样品溶液;
将样品溶液泵入径向色谱仪,样品溶液的上样量为25~50ml;选用DEAE-52纤维素作为填料;分别用以下2种洗脱剂进行洗脱:蒸馏水和浓度为0.2M的 NaCl溶液,流速均为7.5~8.5ml/min,每种洗脱剂的洗脱时间55~65min;
6)、收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液,依次经透析、浓缩、干燥,得到具有抗肿瘤活性的黑木耳多糖;
所述黑木耳多糖的结构式为:
2.根据权利要求1所述的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,其特征是:所述Savag试剂由氯仿:正丁醇=3:0.9~1.1的体积比混合而得。
3.根据权利要求2所述的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,其特征是:所述步骤6)为:收集浓度为0.2M的 NaCl溶液所对应的洗脱液,用截留分子量为7000~9000Da的半透膜透析20~28h,再用旋转蒸发仪浓缩,直至所得的浓缩液为原体积的10%~12%;再冷冻干燥至恒重。
4.根据权利要求2或3所述的从应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,其特征是:
所述步骤1)的浸提中:黑木耳与所述热水的料液比为:1g/20~25ml;
所述步骤2)的浓缩为用旋转蒸发仪浓缩。
5.根据权利要求4所述的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,其特征是:
所述步骤2)和步骤6)的旋转蒸发仪浓缩均为:真空度≤110Pa,温度为39~42℃;
所述步骤4)和步骤6)的冷冻干燥的真空度≤80Pa,温度为-45~ -55℃。
6.根据权利要求5所述的应用径向色谱从黑木耳中分离抗肿瘤多糖组分的方法,其特征是:所述步骤4)和步骤6)的冷冻干燥前,先于-70~-80℃快速冷冻3.5~4.5h。
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