CN103254302A

CN103254302A - 从毛蚶中分离制备一种抗肿瘤多肽化合物的方法和用途

Info

Publication number: CN103254302A
Application number: CN2013101111399A
Authority: CN
Inventors: 于荣敏; 陈莉莉; 朱建华; 宋丽艳
Original assignee: 于荣敏
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-04-01
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及毛蚶(Arca subcrenata Lischke)中一种活性多肽化合物的分离制备及其医药用途。所述制备方法包括将毛蚶剥壳、内容物清洗，加入缓冲液匀浆，提取，离心除渣，取上清液，硫酸铵分级沉淀，透析脱盐得到抗肿瘤活性组分。将活性组分透析脱盐、冷冻干燥后，进行离子交换柱层析，分别收集活性峰，再经疏水柱层析实现分离纯化，就得到一个纯度为99％的抗肿瘤活性多肽化合物。本发明创造性地运用现代提取分离技术从毛蚶中分离得到一个物质基础明确、分子量为20491.0Da的活性多肽化合物。该化合物具有显著的抗肿瘤活性，体外抗肿瘤实验表明抑瘤率达到87％，且毒副作用小，可用于新型抗肿瘤药物的开发和应用。

Description

从毛蚶中分离制备一种抗肿瘤多肽化合物的方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种从海洋生物毛蚶(Arca subcrenata Lischke)中经过一系列提取、分离、层析纯化等步骤得到一个具抗肿瘤活性的多肽化合物，其内容包括分离制备方法及该化合物抗肿瘤医药用途。

背景技术

毛蚶(Arca subcrenata Lischke)属于软体动物门，属于瓣鳃纲列齿目蚶科，是我国资源丰富的海产生物之一。毛蚶的营养与药用价值很高，其壳和肉皆有药用价值，药用历史悠久。其贝壳为中药瓦楞子，《神农本草经》及历代本草均有记载，具有化痰、软坚、止痛等功效；蚶肉是其软体部分，在《海洋中药》、《食疗本草》、《本草拾遗》和《医林纂要》等中药现代和古书籍文献中均有记载，具有补血、温中、健胃等功效。因此，合理利用海洋资源，对毛蚶软体部分进行深入、系统研究具有重大意义。

经检索文献发现，在国外从毛蚶中提取活性物质的研究未见报道。而在国内对毛蚶的研究主要集中对毛蚶多糖成分的分离及其抗氧化或免疫活性方面和毛蚶水解产物活性的研究，但是对毛蚶蛋白多肽类物质的研究则很少，如：中国专利申请号98110478.9公开了“一种能抗癌的海洋生物提取物”技术，所用的方法过于简单，得到的物质复杂而且无法进行定量，无法对其进行药物的开发与利用；而中国专利申请号2005100043797.4公开了“一种毛蚶抗癌肽类提取物及其制备方法”和200610043222.7公开了一种“从毛蚶中提取小分子活性多肽的方法”，这两个专利主要针对于分子量3000Da以下的小分子多肽活性复合组分进行了研究；此外，中国专利申请号200510043846.4公开了“一种毛蚶糖肽类提取物及其制备方法”。上述专利文献仅描述了从毛蚶中提取活性粗蛋白、多肽类物质的过程，其提取产物是粗的复合成分，纯度不高且活性物质基础不明确。迄今为止，均未见从毛蚶中提取分离到纯度高且物质基础明确的抗肿瘤多肽化合物及其理化性质、结构解析的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于借助现代提取分离纯化技术，从海洋生物中提取分离蛋白多肽类活性物质，特别是提供一种来源于毛蚶的活性多肽化合物，包括制备方法、医药用途和结构解析等。

本发明是通过如下的技术方案来实现的：将新鲜毛蚶剥壳、取出内容物、清洗、加入缓冲液、匀浆、提取、离心、取上清液、硫酸铵分级沉淀、取沉淀透析脱盐，采用离子交换柱层析分离，分别收集活性峰，透析脱盐后经疏水层析柱分离，得到纯度为99％、分子量为20491.0Da的抗肿瘤活性多肽化合物，并对其结构进行解析。

该多肽化合物是天然提取分离的物质，具有显著的抗肿瘤活性，体外抗肿瘤实验表明其抑瘤率达到了87％；另外，由于该成分为天然提取分离所得，未经任何化学修饰；再次，该多肽化合物尚具有毒副作用低的特点。本发明涉及经过离子交换层析法和疏水层析法分离纯化得到一个多肽化合物，该多肽化合物纯度高、毒性低、抗肿瘤活性显著，适用于医药用途。

附图说明

图1为实例1中用电喷雾电离质谱测定活性多肽化合物的相对分子量图谱。

图2、3、4、5、6、7、8为实例1中基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱测定多肽化合物的部分氨基酸序列图谱。

具体实施方式：

下面结合技术方案和图表详细说明本发明的具体实施例。

实施例1

将毛蚶剥壳，取其内容物，用低温蒸馏水清洗三次，控干后称重，按照1∶3的重量比例加入提取缓冲液(pH＝8.0，0.03mol/L，磷酸钠缓冲液)，采用高速组织捣碎机，以8000rpm间隔匀浆3min至细腻无块状，将匀浆液置于低频超声仪中超声提取40min，使用低温高速离心机，10000rpm，4℃，离心30min，去渣，量取上清液的体积后将其置于冰浴环境中加入70％饱和度的硫酸铵，继续搅拌盐析1h，高速离心除去沉淀取上清液，量取体积后加入100％饱和度的硫酸铵，再继续搅拌盐析1h，离心30min(10000rpm，4℃)，收集沉淀。将沉淀用少量提取液溶解后置于3000D透析袋中透析24h以除盐，每间隔6h更换外周蒸馏水。将透析脱盐后的活性组分使用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进行分离，用pH为6.0-8.0的0.03mol/L的Tris-HCl缓冲液作为初始洗脱液，通过增加氯化钠的浓度进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰，收集0.1mol/L氯化钠洗脱的洗脱液，透析脱盐后，再使用Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析柱分离。首先用1.0mol/L，pH为6.0-8.0的硫酸铵磷酸缓冲液进行洗脱，然后依次用含0.5mol/L和0mol/L的硫酸铵和pH为6.0-8.0的磷酸钠缓冲液进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰，收集不含硫酸铵的磷酸钠缓冲液洗脱的洗脱液，透析脱盐后，浓缩冷冻干燥，得到了毛蚶中的活性多肽化合物。用RP-HPLC(反相高效液相色谱)检测该多肽化合物的纯度为99％。采用EMS-MS(电喷雾电离质谱)测定了该多肽的分子量为20491.0Da，用MALDI-TOF/TOF-MS(基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱)检测了多肽化合物的部分片段氨基酸序列。

实施例2

采用MTT法对整个提取分离过程进行抗肿瘤活性跟踪筛选。

将处于对数生长期的肿瘤细胞(贴壁细胞需用胰酶消化)，制成含细胞3～4×10³个/ml单细胞悬液(细胞密度)，分别接种于无菌96孔培养板中，100μl/孔，于5％CO₂，37℃培养箱中培养。细胞培养12h后，设空白对照组(加等体积RPMI1640)、阳性对照(顺铂)和给药组，每个浓度组设3个重复孔，加入药物，每孔总反应体积为200μl，细胞置培养箱中培养48h。实验终止前4h加人MTT20μl(5mg/ml)继续培养4h，弃上清液，加入DMSO200μl/孔，置于振荡仪上振荡10min，用酶标仪于波长570nm处测定A₅₇₀值。以顺铂为阳性对照，使用药理学方法计算IC₅₀值(抑制率达到50％时的药物浓度)。以顺铂为阳性对照药，测定此多肽化合物对人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞HT-29的抑制作用。实验结果如表1所示。

表1.多肽化合物的体外抗肿瘤活性测试结果

综述所述，本发明所涉及的经分离纯化得到的毛蚶多肽化合物具有很强的抗肿瘤作用，且具有毒性低，制备过程天然、无污染、结构明确。故，该多肽化合物有望被开发成为一种安全、有效、质量可控的新型抗肿瘤药物。

Claims

1.一种毛蚶(Arcasubcrenata Lischke)中抗肿瘤活性多肽化合物，其分子量为20491.0Da。该多肽化合物的氨基酸片段序列包含ISMEDVEESR、KNGMHSIDVNHDGK、HRAYWADNTYLMK、CMDLPYDVLDTGGKDR、SSDKNTDLVDLFELDMVPDR、KNNECMNMIMDVIDTNTAAR和PYYCSLDNVHDGAGLSMEDVEEDK。

2.权利要求1的毛蚶中的抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征是：将新鲜毛蚶剥壳、取出内容物清洗，加入缓冲液匀浆、提取，离心，取上清液，硫酸铵分级沉淀，取沉淀透析脱盐，采用离子交换柱层析分离，分别收集活性峰，透析脱盐后经疏水层析柱分离，得到了纯度为99％的活性多肽化合物。

3.根据权利要求2述的毛蚶中抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征在于加入的缓冲液为0.01～0.05mol/L，pH为6.0～9.0的磷酸钠、磷酸钾或Tris碱缓冲液，加入缓冲液的体积与毛蚶的重量比为1∶1～1∶3，用高速组织捣碎机进行匀浆。

4.根据权利要求2所述的毛蚶中抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征在于采用硫酸铵分级沉淀，先使提取上清液达到70％饱和度硫酸铵，离心，取上清夜，加入硫酸铵盐析达到100％饱和度，离心，留沉淀。

5.根据权利要求2所述的毛蚶中抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征在于将沉淀用少量缓冲液溶解后，用透析袋透析脱盐后，用DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换层析柱分离，其洗脱初始缓冲液为pH8.0Tris-HCl缓冲液，0～2.0mol/L NaCl进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰。

6.根据权利要求2所述的毛蚶中抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征在于收集用0.1mol/L氯化钠洗脱的洗脱液，透析脱盐后，用Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析柱分离，其洗脱液为0.03mol/L，pH8.0磷酸钠缓冲液，浓度2.0～0mol/L的硫酸铵进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰。

7.根据权利要求2所述的毛蚶中抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征在于收集用不含硫酸铵的磷酸钠缓冲液洗脱的洗脱液，透析脱盐后，浓缩冷冻干燥，得到了毛蚶中的活性多肽化合物。

8.根据权利要求2所述的毛蚶中抗肿瘤活性多肽化合物的分离制备方法，其特征在于得到的毛蚶多肽化合物的分子量为20491.0Da。

9.权利要求1或2所述的毛蚶中抗肿瘤多肽化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。