CN102167725A

CN102167725A - 一种孔鳐血管生成抑制因子rcaif-i的制备方法

Info

Publication number: CN102167725A
Application number: CN2010105932076A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 罗红宇; 冯刚; 曲有乐
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2011-08-31

Abstract

本发明涉及一种孔鳐血管生成抑制因子RCAIF-I的制备方法，步骤为将孔鳐软骨匀浆，离心去渣，取上清液，加入硫酸铵、静置、离心，取沉淀透析，进行离子交换层析，收集各峰后，透析脱盐，经凝胶柱反复分离，得一单峰，即为抑制因子RCAIF-I。本发明的原料为资源较广泛的孔瑶软骨，用来替代鲨鱼在成本上较低廉；提取、纯化工艺较简单，易于操作；制得的抑制因子RCAIF-I经12％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳-考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色法显示为一条带，分子量为36.2kDa，等电点约为5.0-6.0，具有显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用，可用于肿瘤疾病的治疗。

Description

一种孔鳐血管生成抑制因子RCAIF-I的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种源于孔鳐的血管生成抑制因子的分离、纯化制备方法，具体地讲是一种从孔鳐软骨中制备有抑制血管生成作用的蛋白质的方法。

背景技术

自1972年美国哈佛医学院教授Folkman首次提出的“肿瘤生长依赖于血管形成”的观点以来，肿瘤新生血管的形成与肿瘤的生长、转移关系受到普遍关注。诸多研究表明，血管生成是一个由多种细胞因子参与的、动态的、协调的复杂过程，涉及一系列形态学改变(如内皮细胞的定向运动和增殖、新生微血管、内皮细胞新的基底膜合成和血管腔产生等一系列步骤)及生化学改变(如血管生成因子、细胞因子及相关抑制因子之间的调节失衡)。而肿瘤的生长与转移依赖血管生成，建立丰富的血液循环，以供应肿瘤组织异常旺盛的生化代谢以及瘤细胞的繁殖与转移。因此，血管生成是肿瘤生长、发展的必经之路，且与实体瘤的发生、转移有着密切的关系，从而以其为重要靶点的抗肿瘤药物研发受到国内外的广泛关注。

近年来，源于鲨鱼的血管生长抑制因子得到广泛和深入研究，而从中提取的Neovastat已进入III期临床实验。但是，随着鲨鱼资源的减少和资源保护，寻找鲨鱼软骨的替代资源成为研究的热点，经过研究发现，魟鱼，亦称鳐鱼的软骨与鲨鱼软骨具有相似的生理或药理活性，而且软骨资源总量远高于鲨鱼，并从中发现了部分血管生成抑制因子。如中国发明专利CN1978464A“鳐血管生成抑制因子I的分离、纯化及其N-末端氨基酸序列”即从鳐类鱼中发现了一种分子量为42kDa的血管生成抑制因子。

鳐鱼资源丰富，仅浙江沿海就有20多种，其中赤红和孔鳐最为常见。血管生成抑制因子RCAIF-I是从孔鳐软骨中分离得到的一种活性蛋白，鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型实验表明该蛋白具有显著的血管生成抑制作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种孔鳐血管生成抑制因子RCAIF-I的制备方法，制得的抑制因子RCAIF-I具有显著的血管生成抑制作用，可用于肿瘤疾病的治疗。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种孔鳐血管生成抑制因子RCAIF-I的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取RCAIF-I粗提物：将孔鳐软骨破碎匀浆，按1∶4～1∶8(g/mL)的比例放置于磷酸盐缓冲溶液中于0～4℃下振荡抽提24～48h，以8000～12000rpm的转速离心15～25min，上清液用30％～60％(重量/体积百分比)的饱和硫酸铵进行分级沉淀，将得到的沉淀物置于透析袋中用蒸馏水透析12～24h，透析液冷冻干燥，得血管生成抑制因子RCAIF-I粗提物；

2)离子交换层析纯化：将上述得到的RCAIF-I粗提物溶于磷酸盐缓冲溶液中，用微孔滤膜过滤，滤液上Cellulose DE-52离子交换树脂进行层析，洗脱速度为3～5ml/min，获得5个明显的分离峰，收集第5峰，合并洗脱液透析12～24h，冷冻干燥；

3)凝胶色谱纯化：将离子交换纯化粗品溶于磷酸盐缓冲溶液中，浓度为15～20mg/ml，用微孔滤膜过滤后于葡聚糖凝胶G-75柱中进行洗脱，洗脱速度为0.8～1.5ml/min，获得4个明显分离峰，收集第2峰，透析12～24h，冷冻干燥，得RCAIF-I。经高效液相色谱检测为一单峰(高效液相色谱条件为：流动相40％乙腈-水(0.05％TFA)，流速1ml/min，上样量为10μl，样品浓度为0.5mg/ml)。

作为改进，所述磷酸缓冲溶液的pH为6.8～7.8，浓度为0.01～0.02mol·L-1。

再改进，所述步骤2)中的Cellulose DE-52离子交换树脂进行层析，层析条件为：色谱柱型号为1.6～2.6cm×80～120cm，流动相A为0.01～0.02mol·L-1，pH6.8～7.8的磷酸盐缓冲溶液；B液为A液加NaCl溶液，二元梯度洗脱的NaCl溶液的浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L氯化钠、1.0mol/L。

最后，所述步骤3)中的葡聚糖凝胶G-75柱的层析条件为：色谱柱型号为1.6～2.6cm×80～120cm，流动相为0.01～0.02mol·L-1mol·L-1，pH6.8～7.8的磷酸盐缓冲溶液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：原料为资源较广泛的孔瑶软骨，用来替代鲨鱼在成本上较低廉；提取、纯化工艺较简单，易于操作；制得的抑制因子RCAIF-I经12％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳-考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色法显示为一条带，分子量为36.2kDa，等电点约为5.0-6.0，具有显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用，可用于肿瘤疾病的治疗。

附图说明

图1是本发明实施例用Cellulose DE-52离子交换柱进行离子交换时所获得的分离峰图，其中横轴为接收管数，纵向轴是吸光度值(mAU)，曲线A280-1为洗脱曲线；

图2是本发明实施例用Superdex 75进行层析时所获得的分离峰图，其中横轴为接收管数，纵向轴是吸光度值(mAU)，曲线A280-21为洗脱曲线；

图3是本发明实施例用ZORBAX 300SB-C18HPLC柱进行层析时所获得的分离峰图，其中横轴为洗脱时间t(min)，纵向轴是吸光度值(V)，曲线为洗脱曲线；

图4是本发明实施例用SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色法显示图，纵轴为分子量(kDa)，其中泳道为1标准分子量蛋白质，泳道2为RCAIF-I电泳条带；

图5是本发明实施例作抑制CAM血管生成的测定的结果比较图，其PBS为阴性对照，CS为阳性对照。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

一种孔鳐血管生成抑制因子RCAIF-I的制备方法，制备流程如下：孔鳐软骨→组织破碎→硫酸铵沉淀粗分→离子交换层析纯化→凝胶渗透色谱纯化→冷冻干燥→血管生成抑制因子RCAIF-I。

1、孔鳐软骨组织捣碎机破碎；

2、孔鳐软骨有碎粒100g和500mL抽提液混和，抽提液中有0.9867g磷酸氢二钠和0.1123g磷酸二氢钾，随后将该混和物的pH值调至7.4，于20℃下振荡24h，再于4℃、10000r/min转速下离心20min，弃残渣，得到上清液；

3、将第2步所得上清液依次用30％、60％，(重量/体积百分比)的饱和硫酸铵溶液对所得孔鳐软骨粗提液进行分级沉淀，将所得的30％～60％沉淀以蒸馏水透析过夜，再经冷冻干燥获得RCAIF-I粗提物；

5、用Cellulose DE-52离子交换柱进行层析，洗脱速度为5ml/min，氯化钠阶梯洗脱浓度分别用0.1mol/L、0.5mol/L氯化钠、1.0mol/L氯化钠，获得5个明显的分离峰，收集第5峰；

6、用Superdex 75柱进行层析，洗脱速度为1.0ml/min，获得4个明显分离峰，收集第2峰；

7、用ZORBAX 300SB-C18HPLC进行检测(高效液相色谱条件为：流动相40％乙腈-水(0.05％TFA)，流速1ml/min，上样量为10μl，样品浓度为0.5mg/ml)，仅发现1个峰；

8、用重蒸水进行脱盐，冷冻干燥，获得RCAIF-I样品。

所得的RCAIF-I经12％的SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色法显示为一条带，分子量为36.2kDa。

将制得的RCAIF-I作抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术-无气室孵育法”[记载于《中山大学学报(自然科学版)》，2003年第2册(第42卷)：第126-128页]，测定时滤纸片大小为3mm×3mm；加样前孵化时间为4天；加样量：RCAIF-I分别为0.1g/L、0.4g/L、0.8g/L；0.01mol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照；0.4g/L的硫酸软骨素(CS)为阳性对照，加样量为10μL。加样后继续孵化24h，以给药点为中心，以半径间隔5mm将CAM划分为3个区域，计数各区域的血管数.

结果表明，孔鳐血管生成抑制因子显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈剂量依赖关系(表1，图5)

表1加样48h后CAM上RCAIF-I的血管生成抑制效果的统计学分析

Claims

1.一种孔鳐血管生成抑制因子RCAIF-I的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取RCAIF-I粗提物：将孔鳐软骨破碎匀浆，按1∶4～1∶8g/mL的比例放置于磷酸盐缓冲溶液中于0～4℃下振荡抽提24～48h，以8000～12000rpm的转速离心15～25min，上清液用30％～60％(重量/体积百分比)的饱和硫酸铵进行分级沉淀，将得到的沉淀物置于透析袋中用蒸馏水透析12～24h，透析液冷冻干燥，得到血管生成抑制因子RCAIF-I粗提物；

3)凝胶色谱纯化：将离子交换纯化粗品溶于磷酸盐缓冲溶液中，浓度为15～20mg/ml，用微孔滤膜过滤后于葡聚糖凝胶G-75柱中进行洗脱，洗脱速度为0.8～1.5ml/min，获得4个明显分离峰，收集第2峰，透析12～24h，冷冻干燥，得RCAIF-I。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲溶液的pH为6.8～7.8，浓度为0.01～0.02mol·L^-1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的Cellulose DE-52离子交换树脂进行层析，层析条件为：色谱柱型号为1.6～2.6cm×80～120cm，流动相A为0.01～0.02mol·L^-1，pH6.8～7.8的磷酸盐缓冲溶液；B液为A液加NaCl溶液，二元梯度洗脱的NaCl溶液的浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L氯化钠、1.0mol/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的葡聚糖凝胶G-75柱的层析条件为：色谱柱型号为1.6～2.6cm×80～120cm，流动相为0.01～0.02mol·L-1mol·L-1，pH6.8～7.8的磷酸盐缓冲溶液。