CN100371347C - 毛蚶中的多肽蛋白类活性物质及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharcasubcrenata；)中的多肽蛋白类活性物质，及其制备方法和用途，所述制备方法包括直接将毛蚶匀浆后得到的上清液进行离子交换柱层析，脱盐后，再经凝胶柱层析分离，合并分子量为3-150kDa的各峰，浓缩干燥后，得到多肽蛋白类活性物质。上述活性物质具有73.72%的抑瘤率，可制成抗肿瘤药物，且纯度高，低毒低。

Description

毛蚶中的多肽蛋白类活性物质及其制备方法和用途
技术领域：
本发明公开了一种毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharcasubcrenata；)中的多肽蛋白类活性物质，及其制备方法和用途。
背景技术：
毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)属于软体动物门，瓣鳃纲，列齿目，蚶科。其贝壳为中药瓦楞子。有31～34条放射肋。壳表面有毛，呈茶褐色。产于我国北部沿海。
《中国海洋药物》杂志2003年第2期P37，介绍了牡蛎蛋白的分离方法。新鲜牡蛎软体，4℃下以2倍量生理盐水匀浆，3000r/min离心15min，取上清液，分别加入(NH)2SO4，使溶液的(NH)2SO4的饱和度分别达到50％、75％和100％，4℃下静置12h。再以3000r/min离心15min，取沉淀，少量水溶解后，倒入透析袋脱盐。每2h换水一次。直至15％CaCl2检测溶液中无SO4 2-存在，最后得到蛋白。牡蛎提取物的营养分析显示，牡蛎中含有丰富的糖源、蛋白质及必需氨基酸，特别是牛磺酸含量高，还含有多种必须的微量元素和多种维生素。《本草纲目》等均记载了牡蛎的治疗功效，牡蛎入药在我国已有千年的历史。除此之外，申请人在检索过程中并未发现关于毛蚶多肽蛋白类活性物质的药用报道及其提取方法的报道。
上述文献报道的方法中使用的(NH)2SO4沉淀步骤来提取蛋白，得到的只是粗总蛋白，其中含有多糖等多种杂质，是多种成分的混合物。所得提取物不能直接用于纯度要求高的用途中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于毛蚶中的多肽蛋白类活性物质，及其制备方法和医药用途，通过本发明的制备方法提取得到的毛蚶的多肽蛋白类活性物质纯度大大提高，可以直接用于纯度要求高的用途中。
本发明是通过如下的技术方案来实现的。将毛蚶内容物清洗后，加入蒸馏水，匀浆，离心去渣，取上清；对上清进行离子交换柱层析，分别收集各峰后，脱盐，经凝胶柱层析分离，合并分子量为3-150kDa的各峰，经浓缩干燥后得到毛蚶多肽蛋白类活性物质。
将该多肽蛋白类活性物质，配以适当的药用辅料，制成适当剂型的药物，可用于抑制肿瘤。适当的剂型例如是注射剂。
用本发明的多肽蛋白类活性物质制成的抗肿瘤药物，可有73.72％的抑瘤率，同时因为是天然生物提取物质，具有低毒的特点。本发明的毛蚶多肽蛋白类活性物质的提取方法，直接将毛蚶蛋白进行离子交换柱层析，脱盐后，再进行凝胶柱层析分离，可达到将多肽蛋白提取物在分离提取的同时得到纯化的效果，更好地适用于医药用途。
最佳实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
取毛蚶，去壳，取其内容物，用4℃常水清洗3次后，再用4℃的蒸馏水清洗两遍；按1∶3的重量比加入蒸馏水，以5000r/min匀浆3min，在离心机上去渣，离心10min后取上清；对上清进行离子交换柱层析(利用DEAE阴离子交换剂，采用磷酸缓冲溶液进行0.8-1.5M盐浓度梯度洗脱)，通过该步骤，已经将提取物按照对离子交换介质吸附能力的不同分离纯化。分别收集各峰后，透析脱盐。脱盐后再经凝胶柱层析分离(填料为Sephadex G-50，利用磷酸缓冲液进行洗脱)，进一步将相同吸附力的提取物按照不同分子量进行分离，将得到的分子量在3-150kDa的各峰合并，浓缩，干燥，得到毛蚶的多肽蛋白类活性物质，它的组成及纯度有了很大的提高。
实施例2
取上述毛蚶的多肽蛋白类活性物质进行荷瘤小鼠的体内肿瘤实验，取雄性昆明种小鼠，体重19～21g，随机分组，每组10只。每只小鼠左腋下接种0.2ml S180艾氏腹水癌的瘤液。次日开始以生理盐水为阴性对照，5-氟尿嘧啶为阳性对照进行腹腔注射，注射8天后称重，解剖皮下瘤块，称重。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算公式如下：
瘤重抑制率％＝(1-T/C)×100％
T：治疗组平均瘤重
C：阴性对照组平均瘤重
药物对小鼠S180肿瘤的抑制作用
  组别   给药剂量   给药途径及天数   动物体重(g)  平均瘤重(g)   抑瘤率(％)   给药前后体重变化
  药前   药后
  生理盐水样品5-氟尿嘧啶   20ml/kg75mg/kg10ml/kg   ip×8ip×8ip×8   20.7420.5520.96   23.6520.3216.3  1.610.4230.457 73.7271.61 -1.12％-22.23％
实验结果表明，本发明提取的活性蛋白的抑瘤率高达73.72％，且其毒性低于阳性对照5-氟尿嘧啶组(样品组小鼠实验前后体重下降明显低于5-氟尿嘧啶组，说明其毒性较低)；同时，该制剂对体外肿瘤细胞的培养也有较高的抑制率。因此，本发明的提取物具有高效低毒，制作过程无污染等特点，有望为临床提供一种安全、有效、质量可控的新型抗肿瘤药物。

Claims (5)

1.一种毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)中的多肽蛋白类活性物质，它是通过下述方法制备的：将毛蚶内容物清洗后，加入蒸馏水，匀浆，离心去渣，取上清，对上清进行离子交换柱层析，分别收集各峰后，脱盐，经凝胶柱层析分离，合并分子量为3-150kDa的各峰，经浓缩干燥后得到多肽蛋白类活性物质。
2.权利要求1的毛蚶中的多肽蛋白类活性物质的制备方法，该方法包括将毛蚶内容物清洗后，加入蒸馏水，匀浆，离心去渣，取上清，对上清进行离子交换柱层析，分别收集各峰后，脱盐，经凝胶柱层析分离，合并分子量为3-150kDa的各峰，经浓缩干燥后得到多肽蛋白类活性物质。
3.按照权利要求2的制备方法，其中所述的毛蚶的内容物清洗步骤是：先用4℃常水清洗3次后，再用4℃的蒸馏水清洗两遍；所述加入的蒸馏水与毛蚶的重量比为3∶1。
4.含有权利要求1的毛蚶中的多肽蛋白类活性物质的药物组合物。
5.权利要求1的毛蚶中的多肽蛋白类活性物质在制备用于抑制肿瘤的药物中的用途。
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