CN103204907A

CN103204907A - 孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103204907A
Application number: CN2013100403173A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 胡发远; 罗红宇; 徐银峰
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2013-02-01
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: CN103204907B

Abstract

本发明公开了孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途，该多肽类血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL），ESI/MS检测给出分子离子峰m/z793.11Da（[M+H]⁺）孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）的血管生成，以及人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的增殖。孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。<u/>

Description

孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，本发明还涉及该孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，本发明还涉及该孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的用途。

背景技术

自上世纪70 年代美国哈佛医学院教授Folkman首次提出的“肿瘤生长依赖于血管形成”的观点以后，肿瘤新生血管的形成与肿瘤的生长、转移关系受到普遍关注。诸多研究表明，血管生成是一个由多种细胞因子参与的、动态的、协调的复杂过程，涉及一系列形态学改变（如内皮细胞激活，降解基底膜、内皮细胞的定向运动和增殖、新生微血管、内皮细胞新的基底膜合成、血管腔产生、芽式生长并形成血管襻等一系列步骤）及生物化学改变（如血管生成因子、细胞因子及相关抑制因子之间的调节失衡）。而肿瘤的生长与转移依赖血管生成，建立丰富的血液循环，以供应肿瘤组织异常旺盛的生化代谢以及瘤细胞的繁殖与转移。因此，血管生成是肿瘤生长、发展的必经之路，且与实体瘤的发生、转移有着密切的关系，而抑制新生血管生成，对于恶性肿瘤的防治具有重要意义。

目前，人们已针对血管生成不同环节开发破坏或抑制血管生成，有效地阻止肿瘤生长和转移的药物----肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibitor，TAI），如针对血管内皮细胞抑制其增殖、诱导其凋亡而达到抗肿瘤目的的endostatin和agiostain等；针对血管内皮生长因子（VEGF）或其受体（VEGFR）的药物avastin和anti-huMAB-VEGFR1等。

软骨是一种无血管组织，对肿瘤侵噬具有一定的抵抗性，目前已从鲨鱼软骨中分离得到了多种血管生成抑制因子，如：1983年Lee和Langer首次报道从姥鲨的鳍和脊椎软骨中制备了新血管生成抑制因子SCAPI，1997年王路等从中国姥鲨软骨中获得新生血管抑制因子SCDI，1998年Sheu等从青鲨软骨中分离纯化了相对分子量分别为10 kDa和14 kDa两条多肽组成的新血管生成抑制因子U-995，1999年王树森等从鲨鱼软骨中获得了相对分子量为32 680 Da的血管生成抑制因子CDAI，2000年美国加州大学的Liang等从鲨鱼软骨中分离纯化获得相对分子量大约为10 kDa的新型血管生成抑制因子SCF2，2000年和2001年沈先荣等从鲸鲨软骨中提取分离了两种高纯度血管生成抑制因子SCAIF1（18 kDa）和SCAIF80（80 kDa），2001年和2003年曾锋等以广东阳江鲨鱼软骨为原料，分离出新生血管生成抑制因子SCAI-a（12.6 kDa）和SCAI-c（17.4 kDa）。孔鳐与鲨鱼同属软骨鱼类，研究表明孔鳐软骨成分中亦含有与鲨鱼软骨血管生成抑制因子类似的抗肿瘤活性物质，如马润娣等从孔鳐软骨中制备了分子量为42 kDa血管生成抑制因子I（中国发明专利：公开号CN 1978464A），王斌等从孔鳐软骨中制备了分子量为36.2 kDa血管生成抑制因子RCAIF-I（中国发明专利：公开号CN102167725 A）。但是，软骨鱼类血管生成抑制因子分子量多处于10-100 kDa之间，具有分子量大不能透过半透膜、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、半衰期短、清除率高、生物利用度低等蛋白类药物的缺点，限制了软骨类血管生成抑制因子的深入开发。因此，寻找分子量小、活性显著和稳定性强的血管生成抑制因子成为软骨活性物质研究的重点。众所周知，蛋白质的生理功能取决于其特定的氨基酸序列，用合适的蛋白酶水解，就能释放出天然、高效、新颖和稳定性强的生物活性肽。基于此，以孔鳐软骨为实验材料，通过对酶解工艺和制备技术的综合应用，将有可能获得活性显著和稳定性强的血管生成抑制因子，为海洋抗肿瘤药物的开发提供候选药物。

但是，申请人研究发现，以孔鳐软骨为原料，利用酶解技术制备多肽类血管生成抑制因子的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性多肽类血管生成抑制因子及其应用更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，以及人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的增殖。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，其特征在于该血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu SEQ ID NO:1，ESI/MS检测给出分子离子峰m/z 793.11 Da（[M+H]⁺）。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以孔鳐软骨为原料，按固液比1 g：5~10 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中（含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7.6），于4 ℃振荡抽提36~48 h后，抽提溶液于4 ℃以下，以4 000 r/min离心15~25 min，去除残渣收集上清液；上清液继续在4 ℃下12000 r/min离心20~25 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为3 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4℃下透析18~30 h，每隔6 h更换Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液1次，透析袋内溶液即为孔鳐软骨粗提液。

2）孔鳐软骨粗提液置于4 ℃下预冷0.5~1 h，缓慢加入4 ℃下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5~1 h后，于4 ℃以下9 000 r/min离心15~25 min，取离心上清液加入4 ℃下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5~1 h后，4 ℃以下9 000 r/min离心15~25 min，取沉淀置于截留分子量为3 kDa 的透析袋内用Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液透析24~36 h，每隔6 h更换Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液1次，透析液冷冻干燥，得孔鳐软骨蛋白；

3）取冻干孔鳐软骨蛋白，按照料液比1 g：3~5 mL加入Tris-HCl缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.5~8.5），按照软骨蛋白质量的2.0~3.0%加入胰蛋白酶，于温度35~45℃下酶解3~5 h，得孔鳐软骨蛋白酶解产物；

4）将制备的孔鳐软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得孔鳐软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子。

作为优选，所述步骤3）中的胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10⁴U/g。

作为改进，所述步骤4）中的灭酶处理为：将孔鳐软骨蛋白酶解产物升温至90~95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温，然后离心，得孔鳐软骨蛋白酶解液。

再改进，所述步骤4）的超滤、脱盐和层析的具体过程为：

超滤：将孔鳐软骨蛋白酶解液于0.1~0.15 MPa的工作压力和20~25 ℃的工作温度下采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，即为超滤酶解液；

脱盐：将超滤酶解液制成浓度为10~20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱，然后用质量浓度70~80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液。脱盐酶解液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；

层析：将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成8~12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制作用得1个高血管生成抑制作用多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）。

优选，所述大孔树脂为D101。

再优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Zorbax C18；流动相：A水，B乙腈；梯度洗脱：0 %-50 % B，32min；50%-100% B，2min；100%- 100% B，3min；紫外检测波长220 nm。

本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的应用，其特征在于Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）在1 μg/只、10 μg/只、和100 μg/只的浓度下，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制率分别为46.5%、68.7%和85.0%；对人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的IC₅₀分别为0.32 mg/mL和0.15 mg/mL；Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明工艺科学合理，选用胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合膜超滤分级、大孔树脂脱盐和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的多肽类血管生成抑制因子具有较高的活性；与化学合成的多肽类血管生成抑制因子相比较，本发明制得的多肽类血管生成抑制因子具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。

附图说明

图1是本发明的脱盐酶解物的阴离子交换树脂DEAE-52纤维素层析图；

图2是本发明的离子交换层析酶解物的葡聚糖凝胶G-15层析图；

图3 是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备的凝胶层析酶解物的RP-HPLC分析图；

图4 是本发明的Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）的反相高效液相色谱（RP-HPLC）；

图5是本发明的Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）的质谱图（ESI/MS）。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，制备工艺流程如下：孔鳐软骨"蛋白抽提"酶解"酶解物"膜超滤"大孔树脂脱盐"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱分析、制备"孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子。

实施例1：

1）以孔鳐软骨为原料，按固液比1 g：5 mL加入到浓度为1.0 mol/L的盐酸胍溶液中（含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7.6），于4 ℃振荡抽提48 h，抽提溶液于4 ℃以下，以4 000 r/min离心20 min，去除残渣收集上清液；上清液继续在4℃下12000 r/min离心25 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为3 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液于4℃下透析静置24 h，每隔6 h更换Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液1次，透析袋内溶液即为孔鳐软骨粗提液；

2）孔鳐软骨粗提液置于4 ℃下预冷1 h，缓慢加入4 ℃下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置1 h后，于4 ℃以下9 000 r/min离心15 min，取离心上清液加入4 ℃下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置1 h后，4 ℃以下9 000 r/min离心25 min，取沉淀置于截留分子量为3 kDa 的透析袋内用Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液透析24 h，每隔6 h更换Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液1次，透析液冷冻干燥，得孔鳐软骨蛋白；

3）取冻干孔鳐软骨蛋白，按照料液比1 g：3 mL加入Tris-HCl缓冲液（0.02 mol/L，pH 8.0），按照软骨粗蛋白质量的3.0%加入胰蛋白酶，于温度40℃下酶解5 h，得孔鳐软骨蛋白酶解产物；

4）将步骤3）所得的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：

①灭酶：将孔鳐软骨蛋白酶解产物升温至90~95℃，并于此温度保持10 min后，冷却至室温，然后离心，得孔鳐软骨蛋白酶解液。

②超滤：将孔鳐软骨蛋白酶解液于0.1~0.15 MPa的工作压力和20~25 ℃的工作温度下采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，即为超滤酶解液；

③脱盐：将超滤酶解液制成浓度为15 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱，然后用质量浓度80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液。脱盐酶解液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；

④阴离子交换层析：将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为15 mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最高组分为离子交换层析酶解物（F6）（图1）；

⑤凝胶色谱层析：将上述离子交换层析酶解物（F6）用双蒸水配成10 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物（F61）（图2）。

⑥高效液相色谱精制：将上述制备的凝胶层析酶解物（F61）用双蒸水配成50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（条件：进样量20 μg；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：A水，B乙腈；梯度洗脱：0 %-50 % B，32min；50%-100% B，2min；100%- 100% B，3min；紫外检测波长220 nm；根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制作用得1个高血管生成抑制作用多肽。（见图3）。

⑦结构检测：RP-HPLC检测收集的高血管生成抑制作用多肽为单一峰（见图4），利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL），ESI/MS检测给出分子离子峰m/z 793.11Da（[M+H]⁺）。

将上述制得的孔鳐软骨蛋白抗肿瘤多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）进行人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的增殖抑制实验。实验结果表明：该多肽对人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的IC₅₀分别为0.32 mg/mL和0.15 mg/mL。

将制得的多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）作抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM) 血管生成的测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术－无气室孵育法”[记载于《中山大学学报（自然科学版）》，2003年第2册（第42卷）：第126-128页]，测定时滤纸片大小为3mm×3mm；加样前孵化时间为4天；加样量：Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）分别为1 μg/只、10 μg/只、0.8 μg/只；0.01mol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液（PBS）为阴性对照；5 μg/只的硫酸软骨素（CS）为阳性对照。加样后继续孵化24h，以给药点为中心，以半径间隔5 mm将CAM划分为3个区域，计数各区域的血管数，按下式计算血管生成抑制率：

血管生成抑制率=（对照组血管分支点数一给药组血管分支点数）/对照组血管分支点数×100%

结果表明，Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM) 血管生成并呈剂量依赖关系，在1 μg/只、10 μg/只、和100 μg/只的浓度下，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制率分别为46.5%、68.7%和85.0%（表1）。

表1 孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu（GEEGTMGL）对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用

组别	鸡胚数	用药量（μg/只）	血管分支点数（ ±s）	抑制率(%)
					对照	5	--	68.6±3.8	--
硫酸软骨素	5	5	26.4±1.5	61.5
					GEEGTMGL	5	1	36.7±2.3	46.5
GEEGTMGL	5	10	21.5±0.8	68.7
					GEEGTMGL	5	100	10.3±0.6	85.0

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途

<130> zjou1301

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Glu Glu Gly Thr Met Gly Leu

1 5

Claims

1.孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，其特征在于该孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu SEQ ID NO:1，ESI/MS检测给出分子离子峰m/z 793.11Da（[M+H]⁺）。

2.一种权利要求1所述的孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以孔鳐软骨为原料，按固液比1 g：5~10 mL加入到浓度为1.0 mol/L的盐酸胍溶液中（含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7.6），于4 ℃振荡抽提36~48 h，抽提溶液于4 ℃以下，以4 000 r/min离心15~25 min，去除残渣收集上清液；上清液继续在4℃下12000 r/min离心20~25 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为3 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液于4℃下透析静置18~30 h，每隔6 h更换Tris-HCl（0.02 mol/L，pH 7.6）缓冲液1次，透析袋内溶液即为孔鳐软骨粗提液；

3）取冻干孔鳐软骨蛋白，按照料液比1 g：3~5 mL加入Tris-HCl缓冲液（0.02 mol/L，pH为 7.5~8.5），按照软骨粗蛋白质量的2.0~3.0%加入胰蛋白酶，于温度35~45℃下酶解3~5 h，得孔鳐软骨蛋白酶解产物；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10⁴U/g。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4）中的灭酶处理为：将孔鳐软骨蛋白酶解产物升温至90~95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温，然后离心，得孔鳐软骨蛋白酶解液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的超滤、脱盐和层析的具体过程为：

脱盐：将超滤酶解液制成浓度为10~20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱，然后用质量浓度70~80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液，脱盐酶解液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；

层析：将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成8~12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用得1个高血管生成抑制作用多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu SEQ ID NO:1。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为D101。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Zorbax C18；流动相：A水，B乙腈；梯度洗脱：0 %-50 % B，32min；50%-100% B，2min；100%- 100% B，3min；紫外检测波长220 nm。

8.权利要求1所述的孔鳐软骨蛋白抗肿瘤多肽可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物用途。