CN101021452A - 一种高效快速微藻藻红蛋白分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用超声波破碎、硫酸铵分级沉淀和强阴离子交换柱层析分离纯化微藻藻红蛋白的方法。首先将冻干藻粉及藻泥按1∶20～25加蒸馏水进行溶解，用超声波破碎、高速冷冻离心，得藻红蛋白粗提液。加入固体硫酸铵至一定的饱和度时进行分级沉淀，磷酸钠缓冲液平衡透析，离心20min后，采用强阴离子CaptoTMQ柱层析交换柱层析将上清液一步纯化，得到藻红蛋白。本发明通过硫酸铵分级沉淀、强阴离子交换柱层析一步纯化得到藻红蛋白，其纯度达到OD545/OD280＝5.70，具有纯化效果好、上样量大、样品得率高等特点，所分离得藻红蛋白纯度达到5.70，总收率63％，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条带。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用超声波破碎、硫酸铵分级沉淀和强阴离子交换剂CaptoTM Q层析介质分离纯化微藻藻红蛋白的方法。
背景技术
藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于某些藻类(主要是蓝藻和红藻)藻胆体(Phycobilisomes)中的一类色素复合蛋白，在藻细胞中主要起捕获和传递光能的作用。根据其特征吸收峰的不同，可分为3大类：藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)。藻胆蛋白可作为天然色素用于染料、化妆品和食品工业，还可用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞仪技术方面的生物化学示踪物。从80年代初，日本人Iijima发现藻蓝蛋白具有增强机体免疫力的活性以来，人们不断发现了藻蓝蛋白的抗肿瘤、抗氧化等其它重要活性。它亦可作为光动力治疗肿瘤中的光敏素，结合激光辐射，可以有效的杀伤肿瘤细胞(李冠武等.肿瘤防治杂志，2002，9(2)：144-146)。
紫球藻细胞内有一个大而呈星形的色素体，内含丰富的藻红蛋白及藻蓝蛋白，藻红蛋白占藻胆蛋白84％，其中以B-藻红蛋白含量最多。利用无载体电泳从过柱的蛋白中分离出B-藻红蛋白、b-藻红蛋白和R藻蓝蛋白，最后获得的B-藻红蛋白OD545/OD280比率≥5(Kost-Reyeset al.Eur J Biochem.1979，102(1)：83-91)。通过Toypearl DEAE-650M离子交换、羟基磷灰石和Sephadex G-200凝胶分离得到紫球藻B-藻红蛋白，最终得到的B-藻红蛋白OD542/OD500＝2.00，OD542/OD280＞6.0(Stadnichuk et al.J Photochemistry Photobiology B.1997，39：19-23)。Bermejo等利用两步层析的方法分离纯化紫球藻B-藻红蛋白，采用反向高性能液体色谱梯度半制备方法，用C4大孔径柱和含有0.05％三氟乙酸(TFA)的水溶液和0.05％TFA的乙氰溶液分离藻红蛋白的α、β和γ亚基的水溶液和0.05％TFA的乙氰溶液分离藻红蛋白的α、β和γ亚基，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳产生三条接近的条带，这三条带和它的三个亚基相对应。他们还制备自然态的B-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白。建立一种新的且可放大的分离纯化紫球藻B-藻红蛋白的方法，该实验结合膨化床和DEAE-纤维素填充床两种层析方法(Bermejo etal.J Chromatogr A.2001，917(1-2)：135-145，J Biotech.2002，93：73-85；JChromatogr B.2003，709：317-325)。利用Sephadex G-200凝胶层析分离紫球藻B-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白，并利用这两种蛋白氨基基团之间的相互反应形成人工B-藻红蛋白-R-藻蓝蛋白共价联合体，实验结果表明这种人工共价联合体的稳定性高于B-藻红蛋白，有望用于藻胆蛋白探针的制备(Ma et al.Plant Sci.2003，164：253-257)。温少红等将紫球藻的水溶性粗提物经过硫酸铵沉淀和羟基磷灰石柱层析，分离纯化得到B-藻红蛋白(B-PE)，B-PE在545nm和563nm各有一个吸收峰，在498nm有一吸收肩峰。他们还将藻胆蛋白粗提物经硫酸铵沉淀、透析、羟基磷灰石和Sephadex G-100柱层析，分离纯化得到B-藻红蛋白，纯度(OD545/OD280)分别为4.92和3.78，聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳得到一条带(温少红等.海洋通报.2000，19(3)：90-93；中国海洋药物.2001，3：33-35)。
蔷薇藻(Rhodella reticulata)可作为藻胆蛋白的一个重要来源，通过光强试验验证，光调节效应可用于藻胆蛋白产量的最佳化(Mihova SG，et al.Journal of Biotechnology，1996，48：251-257)。蔷薇藻(Rhodella violacea)的藻红蛋白(PE)有两种转录物，前体信使和成熟信使，因此，R.violacea可作为研究基因表达调控以及叶绿体和核基因组相互作用的极为有意义的模型(Lichtle L，etal.Plant Physiol，1996，112：1045-1054)。单细胞红藻R.violacea strain6的藻胆体中含有一种新的藻红蛋白，编码该藻红蛋白基因可作为rpeB基因被一内含子分割的证据(Thomas JC.J Biological Chemister，1999，274：2472-2482)。
本发明的目的就是提供一种将藻粉经超声波破碎，硫酸铵分部沉淀得到粗藻胆蛋白，经强阴离子交换剂CaptoTM Q柱层析纯化得到高纯度的藻红蛋白的方法。
为实现本发明的目的而采用的技术方案是：首先将微藻藻粉按1∶20～25加蒸馏水进行溶解，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)按照剂量为电流30％、脉冲8.5s和处理时间600s因素指标调整好后，对藻细胞进行破碎。破碎后用高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶10-15加蒸馏水稀释后继续用超声波破碎2次，于4℃、6000r/min离心20min，各取上清液，合并3次超声波破碎所得上清液(即为藻红蛋白粗提液)加入固体硫酸铵至30-80％饱和度，混匀后静置过夜，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，再用pH7.0的0.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡透析24h。将透析后的样品于4℃、6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。将装好的强阴离子交换剂CaptoTM Q层析介质柱用0.02mol/L磷酸钠缓冲液平衡，直至流出液pH值为7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用0.03-0.06mol/L磷酸钠缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用1.0～2.0mol/L NaCl作梯度洗脱，流速1.5mL/min。将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD545/OD280比值，收集样品，透析、浓缩、离心、冻干得样品。本发明具体的技术方案包括以下具体的步骤：
1、藻红蛋白的提取：称取一定量冻干藻粉，如蔷薇藻(Rhodella reticulate)冻干藻粉、紫球藻(Porphyridium cruentum)冻干藻粉按1∶20～25加蒸馏水，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)按照剂量为电流30％、脉冲8.5s和处理时间600s因素指标调整好后，对藻细胞进行破碎。破碎后于高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶10-15加蒸馏水继续用超声波破碎2次，于高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，取上清液。合并上述3次超声波破碎所得上清液即为藻红蛋白粗提液。
2、硫酸铵分级沉淀：粗提液分组，分别加入固体硫酸铵，硫酸铵饱和度为20％、35％、50％、65％和80％，进行杂蛋白质和目的蛋白质的分级沉淀，静置过夜后，采用高速冷冻离心机，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析15～24h，然后用pH7.00.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡透析15～24h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。分别测定经硫酸铵分级沉淀的藻红蛋白样品纯度，以确定硫酸铵分级沉淀所采用的饱和度。
3、强阴离子交换剂CaptoTM Q柱层析：将装好的CaptoTM Q柱，用pH7.0缓冲液平衡，直至流出液为pH7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用1.0～2.0mol/L NaCl溶液作梯度洗脱，将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD545/OD280比值，收集较纯的样品，透析、浓缩、离心、冻干得藻红蛋白样品。
本发明具有的优点在于藻红蛋白经过CaptoTM Q离子交换柱层析一步纯化，纯度达到OD545/OD280＝5.70，所得样品在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示一条带，说明已达到电泳纯，总收率63％。采用CaptoTM Q离子交换柱层析具有纯化效果好、上样量大、样品得率高等特点。与已报道的藻红蛋白分离纯化方法相比，采用CaptoTM Q离子交换柱层析优于采用羟基磷灰石柱层析、Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1。
1、藻红蛋白的提取：称取5g紫球藻冻干藻粉按1∶20的比例加100mL蒸馏水，搅匀，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)按照剂量为电流30％、脉冲8.5s和处理时间600s因素指标调整好后，对藻细胞进行超声波破碎。破碎后于高速冷冻离心机4℃ 6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥加75mL蒸馏水继续用超声波破碎2次。合并上述3次超声波所得上清液即为藻红蛋白粗提液。
2、硫酸铵分级沉淀：粗提液分组，分别加入固体硫酸铵，饱和度为20％、35％、50％、65％和80％，混匀后进行杂蛋白质和目的蛋白质的分级沉淀，静置过夜，高速冷冻离心机，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，然后用0.01mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)pH7.0缓冲液平衡透析24h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃ 6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。分别测定经硫酸铵分级沉淀的藻红蛋白样品纯度，以确定硫酸铵分级沉淀所采用的饱和度。
3、藻红蛋白CaptoTM Q柱层析纯化：将装好的CaptoTM Q柱，用0.02mol/L磷酸钠缓冲液平衡，直至流出液为pH7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用1.5mol/L NaCl作梯度洗脱，洗脱液总体积为300mL，流速1.5mL/min，每管收集约5mL。将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD545/OD280比值，收集较纯的样品，透析、浓缩、冻干得紫球藻藻红蛋白样品。
实施例2
1、藻红蛋白的提取：称取5g蔷薇藻冻干藻粉按1∶25的比例加125mL蒸馏水，搅匀，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)按照剂量为电流30％、脉冲8.5s和处理时间600s因素指标调整好后，对藻细胞进行超声波破碎。破碎后于高速冷冻离心机4℃6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶10加50mL蒸馏水继续用超声波破碎2次。合并上述3次超声波破碎所得上清液即为藻红蛋白粗提液。
2、硫酸铵分级沉淀，粗提液分组，分别加入固体硫酸铵，饱和度为20％、35％、50％、65％和80％，混匀后进行杂蛋白质和目的蛋白质的分级沉淀，静置过夜，高速冷冻离心机，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，然后用0.02mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)pH7.0缓冲液平衡透析24h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。分别测定经硫酸铵分级沉淀的藻红蛋白样品纯度，以确定硫酸铵分级沉淀所采用的饱和度。
3、藻红蛋白CaptoTM Q柱层析纯化，将装好的CaptoTM Q柱，用0.02mol/L磷酸钠(pH7.0)缓冲液平衡，直至流出液pH7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用1.0mol/L NaCl作梯度洗脱，洗脱液总体积为500mL，流速2.0mL/min，每管收集约5mL。将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD545/OD280比值，收集较纯的样品，透析、浓缩、冻干得蔷薇藻藻红蛋白。
Claims (3)
1、一种采用硫酸铵分级沉淀和离子交换层析分离微藻藻红蛋白的方法，其特征是：
I、藻粉加蒸馏水用超声波破碎细胞，破碎后用高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，离心分离上清液，沉淀的藻泥加蒸馏水用超声波再行破碎2次，合并上述破碎后所得全部上清液即为藻红蛋白粗提液；
II、藻红蛋白粗提液加入饱和度分别为20％、35％、50％、65％和80％固体硫酸铵，过夜、进行离心沉淀，取沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中蒸馏水透析，磷酸钠缓冲液平衡透析，将透析后的样品离心，取上清液即为上样样品；
III、将样品上样于平衡好的强阴离子交换剂CaptoTM Q离子交换柱柱顶，用0.01mol/L-0.02mol/L缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，用1.0～2.0mol/L NaCl进行梯度洗脱，流速1.5mL/min。
2、根据权利要求1所述的硫酸铵分级沉淀和离子交换层析分离微藻藻红蛋白的方法，其特征是藻粉和藻泥超声波破碎前分别按1∶20～25和1∶10～15加蒸馏水进行溶解与稀释。
3、根据权利要求1所述的硫酸铵分级沉淀和离子交换层析分离微藻藻红蛋白的方法，其特征是经固体硫酸铵分级沉淀后的沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，再用pH为7.0的0.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡透析24h，于4℃、6000r/min离心20min，取上清液。
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