CN102707001B - 一种微藻蛋白组的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微藻蛋白组的分析方法，步骤为：（1）微藻细胞收集；（2）提取细胞内蛋白质：（3）差异表达蛋白鉴定。本发明提供了一种分析微藻蛋白组的手段，这种手段涉及细胞收集、蛋白质的提取、蛋白质的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的蛋白质的定性和定量结果，为微藻蛋白组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的蛋白组学研究具有重要的意义。
Description
发明领域
本发明属于生物燃料领域，涉及一种微藻蛋白组的分析方法。
背景技术
随着人类社会的不断发展，对能源的需求与日俱增，在化石燃料资源日益枯竭的情况下，可持续能源的开发显得尤为重要。生物能源领域是一个新兴的能源研究领域，包括生物乙醇和生物柴油等。其中，生物乙醇的应用存在技术兼容性差等问题，使得生物柴油具有了更大的优势。目前生物柴油的生产，主要是通过产油植物，包括各种豆类等，然而植物的生长、生存环境的限制，使得产油过程受季节、环境影响严重。现在，通过微藻生产柴油，已经成为一种热门的生产途径。由于微藻生长迅速，可在海水及污水等恶劣环境中生长，不占用耕地，产油效率高，其研究具有重要的意义。藻产油尚在起步阶段，在其发展成为可以适应大规模工业生产之前还有许多技术知识需要积累，而微藻培养过程中相关的蛋白质研究就是其中一个关键方向，目前微藻相关的蛋白组学研究方法几乎是空白。因此，对微藻油脂积累过程中的蛋白组监控的方法的开发就显得尤为重要了。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种微藻蛋白组的分析方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种微藻蛋白组的分析方法，包括如下步骤：
（1）微藻细胞收集：
取出已培养好的微藻藻液样品，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；
（2）提取细胞内蛋白质：
①从冻干细胞中取4份，每份50-100mg，分别置于离心管中，每管加入0.5-1mL细胞裂解液，混匀，以每超声8-10s，间歇5-6s的方法冰上间歇超声破碎共40-60s；加入5-15μL的质量比为2-4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10-30min；加入5-15μL80-120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1-3h；12000-15000rpm离心25-40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；
②测定蛋白浓度：
采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白
分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50-150μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积4-6倍的-20℃--40℃的丙酮，沉淀12-20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃--40℃的体积浓度为70%-85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；
④蛋白还原以及酶解
向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10-40μL 40-60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；
加入1-4μL三（2-羧乙基）膦，在50-60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1-2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10-15min，终止还原反应；加浓度为0.2-0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20-30μL，37℃反应12-18小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记
在每个蛋白酶解液中分别加入一管用60-80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；
⑥溶液混合
将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于-40℃保存；
（3）差异表达蛋白鉴定
将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相-Q-Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果。
所述微藻为小球藻（Chlorella sorokiniana）、栅藻（Scenedesmus obliquus）、集胞藻（Synechocystis sp.PCC6803）及鱼腥藻（Anabaena sp.PCC7120）。
所述步骤（3）二维液相-Q-Tof质谱的检测条件为：
①一维强阳离子交换柱分离：
色谱柱：ZORBAX BIO-SCX II强阳离子交换柱，3.5μm，35×0.3mm；
流动相：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；
流动相流速：10μL·min-1；
②二维C18柱分离：
色谱柱：ZORBAX 300SB-C18trap柱5μm，5×0.3mm；
ZORBAX 300SB-C18柱3.5μm，150mm×75μm；
流动相配比：流动相A：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；流动相B：体积比为95/5/0.1的乙腈/水/甲酸；
流动相流速：300nL·min-1；
③质谱条件：
离子化方式：正离子电喷雾模式；
电压：1500V；
离子源温度：150°C；
扫描范围：70~2500m/z。
本发明提供了一种分析微藻蛋白组的手段，这种手段涉及细胞收集、蛋白质的提取、蛋白质的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的蛋白质的定性和定量结果，为微藻蛋白组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的蛋白组学研究具有重要的意义。
附图说明
图1为四种不同接种密度（1×104cells/mL，1×105cells/mL，1×106cells/mL，1×107cells/mL）的小球藻培养体系蛋白表达量比较：四种不同密度由低到高分别表示为IN104，IN105，IN106，IN107；以1×104cells/mL的蛋白表达量为1进行比较。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何限制。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种微藻蛋白组的分析方法，包括如下步骤：
（1）小球藻（Chlorella sorokiniana）细胞培养及收集：
对小球藻（Chlorella sorokiniana）进行四种不同细胞接种密度（1×104cells/mL，1×105cells/mL，1×106cells/mL，1×107cells/mL，依次用IN104，IN105，IN106，IN107表示）培养，当培养至OD560为0.8时，取出已培养好的微藻藻液样品，在3000rpm，4℃条件下离心3min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，在3000rpm，4℃条件下离心3min，收集下层的细胞在-80℃下冷冻干燥4h获得冻干细胞；
（2）提取细胞内蛋白质：
①从上面四种冻干细胞中各取1份，每份50mg，分别置于离心管中，每管加入0.5mL细胞裂解液，混匀，以每超声8s，间歇5s的方法冰上间歇超声破碎共40s；加入5μL的质量比为2:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10min；加入5μL80mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1h；12000rpm离心25min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；
②测定蛋白浓度：
采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白
分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积4倍的-20℃的丙酮，沉淀12h；离心，弃上清，沉淀用-20℃的体积浓度为70%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；
④蛋白还原以及酶解
向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10μL40mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；
加入1μL三（2-羧乙基）膦，在50℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10min，终止还原反应；加浓度为0.2μg/μL的胰蛋白酶水溶液20μL，37℃反应12小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记
在每个蛋白酶解液中分别加入一管用60μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；
⑥溶液混合
将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于-40℃保存；
（3）差异表达蛋白鉴定
将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相-Q-Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果。
二维液相-Q-Tof质谱的检测条件为：
①一维强阳离子交换柱分离：
色谱柱：ZORBAX BIO-SCX II强阳离子交换柱，3.5μm，35×0.3mm；
流动相：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；
流动相流速：10μL·min-1；
②二维C18柱分离：
色谱柱：ZORBAX 300SB-C 18trap柱5μm，5×0.3mm；
ZORBAX 300SB-C18柱3.5μm，150mm×75μm；
流动相配比：流动相A：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；流动相B：体积比为95/5/0.1的乙腈/水/甲酸；
流动相流速：300nL·min-1；
③质谱条件：
离子化方式：正离子电喷雾模式；
电压：1500V；
离子源温度：150°C；
扫描范围：70~2500m/z。
（4）实验结果
表1蛋白质鉴定表
如表1所示，通过本发明的方法提取微藻蛋白质一共鉴定到93种蛋白质。如图1所示，四种不同细胞培养密度导致蛋白表达量的差异，从整体上看，细胞密度为1×104cells/mL时，蛋白表达量较高。
实施例2
一种分析微藻蛋白组的方法，包括如下步骤：
（1）小球藻（Chlorella sorokiniana）细胞培养及收集：
对小球藻（Chlorella sorokiniana）进行四种不同细胞接种密度（1×104cells/mL，1×105cells/mL，1×106cells/mL，1×107cells/mL，依次用IN104，IN105，IN106，IN107表示）培养，当培养至OD560为1.0时，取出已培养好的微藻藻液样品，4000rpm，4℃条件下离心3min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，4000rpm，4℃条件下离心3min，在-80°C下冷冻干燥5h获得冻干细胞；
（2）提取细胞内蛋白质：
①从上面四种冻干细胞中各取1份，每份80mg，分别置于离心管中，每管加入0.8mL细胞裂解液，混匀，以每超声9s，间歇5s的方法冰上间歇超声破碎共50s；加入10μL的质量比为3:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应20min；加入10μL 100mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置2h；15000rpm离心30min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris,余量为水；
②蛋白浓度测定：
采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白
分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含100μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积5倍的-30℃的丙酮，沉淀18h；离心，弃上清，沉淀用-40℃的体积浓度为78%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；
④蛋白还原以及酶解
向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加20μL 50mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；
加入2μL三（2-羧乙基）膦，在55℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应12min，终止还原反应；加浓度为0.25μg/μL的胰蛋白酶水溶液25μL，37℃反应15小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记
在每个蛋白酶解液中分别加入一管用70μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；
⑥溶液混合
将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于-40℃保存；
（3）差异表达蛋白鉴定
将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相-Q-Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果。
二维液相-Q-Tof质谱测定检测条件同实施例1；
（4）实验结果
经检测，其结果同实施例1的结果相似，通过本发明的方法提取微藻蛋白质一共鉴定93种蛋白质，四种不同细胞培养密度导致蛋白表达量的差异，从整体上看，细胞密度为1×104cells/mL时，蛋白表达量较高。
实施例3
一种分析微藻蛋白组的方法，包括如下步骤：
（1）小球藻（Chlorella sorokiniana）细胞培养及收集：
对小球藻（Chlorella sorokiniana）进行四种不同细胞接种密度（1×104cells/mL，1×105cells/mL，1×106cells/mL，1×107cells/mL，依次用IN104，IN105，IN106，IN107表示）培养，当培养至OD560达到1.5，取出已培养好的微藻藻液样品，在5000rpm，4℃条件下离心4min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，在5000rpm，4℃条件下离心4min，收集下层的细胞在-80℃下冷冻干燥6h获得冻干细胞；
（2）提取细胞内蛋白质：
①从上面四种冻干细胞中各取1份，每份100mg，分别置于离心管中，每管加入1mL细胞裂解液，混匀，以每超声10s，间歇6s的方法冰上间歇超声破碎共60s；加入15μL的质量比为4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应30min；加入15μL120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置3h；15000rpm离心40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；
②测定蛋白浓度：
采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白
分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含150μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积6倍的-40℃的丙酮，沉淀20h；离心，弃上清，沉淀用-40℃的体积浓度为85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；
④蛋白还原以及酶解
向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加40μL 60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；
加入4μL三（2-羧乙基）膦，在60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应15min，终止还原反应；加浓度为0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液30μL，37℃反应18小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记
在每个蛋白酶解液中分别加入一管用80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；
⑥溶液混合
将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于-40℃保存；
（3）差异表达蛋白鉴定
将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相-Q-Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果；二维液相-Q-Tof质谱测定检测条件同实施例1：
（4）实验结果
经检测，其结果同实施例1的结果相似，通过本发明的方法提取微藻蛋白质一共鉴定93种蛋白质，四种不同细胞培养密度导致蛋白表达量的差异，从整体上看，细胞密度为1×104cells/mL时，蛋白表达量较高。
本发明所采用的小球藻（Chlorella sorokiniana）只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，本发明可以对栅藻（Scenedesmus obliquus）、集胞藻（Synechocystis sp.PCC6803）及鱼腥藻（Anabaena sp.PCC7120）的蛋白组进行分析。
Claims (2)
1.一种微藻蛋白组的分析方法，其特征是包括如下步骤：
（1）微藻细胞收集：
取出已培养好的微藻藻液样品，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；
（2）提取细胞内蛋白质：
①从冻干细胞中取4份，每份50-100mg，分别置于离心管中，每管加入0.5-1mL细胞裂解液，混匀，以每超声8-10s，间歇5-6s的方法冰上间歇超声破碎共40-60s；加入5-15μL的质量比为2-4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10-30min；加入5-15μL80-120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1-3h；12000-15000rpm离心25-40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；
②测定蛋白浓度：
采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白
分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50-150μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积4-6倍的-20℃--40℃的丙酮，沉淀12-20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃--40℃的体积浓度为70%-85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；
④蛋白还原以及酶解
向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10-40μL40-60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；
加入1-4μL三（2-羧乙基）膦，在50-60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1-2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10-15min，终止还原反应；加浓度为0.2-0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20-30μL，37℃反应12-18小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记
在每个蛋白酶解液中分别加入一管用60-80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；
⑥溶液混合
将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于-40℃保存；
（3）差异表达蛋白鉴定
将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相-Q-Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果；二维液相-Q-Tof质谱的检测条件为：
①一维强阳离子交换柱分离：
色谱柱：ZORBAX BIO-SCX II强阳离子交换柱，3.5μm，35×0.3mm；
流动相：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；
流动相流速：10μL·min-1；
②二维C18柱分离：
色谱柱：ZORBAX300SB-C18trap柱5μm，5×0.3mm；
ZORBAX300SB-C18柱3.5μm，150mm×75μm；
流动相配比：流动相A：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；流动相B：体积比为95/5/0.1的乙腈/水/甲酸；
流动相流速：300nL·min-1；
③质谱条件：
离子化方式：正离子电喷雾模式；
电压：1500V；
离子源温度：150℃；
扫描范围：70～2500m/z。
2.根据权利要求1所述的一种分析微藻蛋白组的方法，其特征是所述微藻为小球藻、栅藻、集胞藻或鱼腥藻。
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2012
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Also Published As
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