CN106478786A - 一种脱硫杆菌胞内有效蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱硫杆菌胞内有效蛋白的提取方法；主要包括脱硫杆菌发酵液处理和胞内蛋白提取两部分，涉及离心分离、萃取、纯化、风干等步骤。解决了目前脱硫杆菌蛋白提取的问题，填补了国内脱硫杆菌胞内蛋白专利领域的空白。该方法通过发酵液离心分离、细胞破碎、蛋白提取与纯化实现脱硫杆菌胞内有效蛋白的分离纯化。本发明是一种易于操作、成本低、安全可靠的提取方法。
Description
技术领域
本发明公开了一种脱硫杆菌胞内有效蛋白的提取方法，涉及生物化工领域，具体是针对于脱硫杆菌(CGMCC No.12756)胞内蛋白的提取。
背景技术
脱硫杆菌，又名排硫硫杆菌，英文名：Thiobacillus thioparus，革兰氏阴性菌，细短杆菌，严格自养，能量靠氧化硫代硫酸盐成硫酸盐取得能量，氮源为硝酸盐和铵盐。该菌最适温度28℃，最适pH为6.6～7.2。发现于泥土壤、运河水和其他淡水来源。目前国内对于脱硫杆菌的研究主要针对于脱硫杆菌对于环境保护、生物脱硫等领域的研究，而对于脱硫杆菌胞内蛋白的提取及研究，还处于起步阶段。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种脱硫杆菌胞内有效蛋白的提取方法。
本发明的技术方案为：一种脱硫杆菌胞内有效蛋白的提取方法，其具体步骤如下：
(1)脱硫杆菌活化培养、液体发酵培养，取发酵液，离心，去除上清液，收集下层沉淀；
(2)取步骤(1)中下层沉淀，加入1～2mL/g裂解液，在0～4℃条件下磁力搅拌，放入-18～-22℃冷冻8～10小时；
(3)将步骤(2)中的冷冻物质，在0～4℃条件下超声破碎，后再次放入-18～-22℃冷冻8～10小时；
(4)将步骤(3)中得到的冷冻物质，在0～4℃条件下超声破碎，离心；
(5)取步骤(4)中离心得到的上清蛋白溶液，加入有机混合溶液，充分混匀震荡后离心；
(6)将步骤(5)中的离心后混合物，去除上清液，加入有机溶剂，充分混匀震荡，将混液离心；
(7)重复操作步骤(6)2～4次，将得到的离心后的混合物，去除上清液，冻干机冷冻干燥，密闭，0～4℃冷藏保存。
优选步骤(1)中所述的脱硫杆菌，其分类命名为排硫硫杆菌，菌种拉丁学名是Thiobacillus thioparus，参据的微生物：NJYH5327，保藏日期是2016年7月11日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.12756。
优选步骤(1)中所述的活化培养为：选取单一菌落，挑取菌丝接入活化培养基中进行活化培养；其中培养基为LB液体培养基；活化培养基的体积装液量为20％～25％，活化温度36～38℃，搅拌转速160～200rpm，活化时间为3～7天。
优选步骤(1)中液体发酵培养为：发酵培养基的体积装液量为20％～25％；体积接种量为5％～8％；培养条件pH 6.5～7，温度36～38℃，转速160～200rpm，培养时间3～7天；其中发酵培养基的组分为：0.3～0.5g/L NH4Cl,0.6～1.0g/L MgSO4,3～5g/L K2HPO4,3～5g/L KH2PO4,8～12g/L Na2S2O3。
优选步骤(1)中离心转速为8000～12000rpm，时间20～30分钟，温度2～6℃。
优选步骤(2)中裂解液为尿素、两性表面活性剂和还原保护剂的水溶液；裂解液中尿素的浓度6～8mol/L，两性表面活性剂的浓度为30～40g/L，还原保护剂的浓度为0.03～0.05mol/L；其中两性表面活性剂为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)，还原保护剂为二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇(ME)。
优选步骤(2)中磁力搅拌转速为1400～1500rpm，磁力搅拌的时间为3～4小时。
优选步骤(3)和(4)中超声破碎功率均为200～400W，超声时间均为5～10秒，间隙均为3～7秒，持续时间均为20～40分钟；步骤(4)、(5)和(6)中离心转速均为6000～8000rpm，离心时间均为5～10分钟，温度均为2～6℃。
优选步骤(5)中有机混合溶液为醇、卤代烷烃与水的混合溶液；其中醇为甲醇或乙醇，卤代烷烃为三氯甲烷或二氯乙烷；醇、卤代烷烃、水和蛋白溶液的体积比为2～6：1～2：2～4：1。
优选步骤(6)中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或正丁醇；更优选甲醇与乙醇，有机溶剂与步骤(5)中蛋白溶液体积比为2～4：1。
综上所述，本发明主要包括脱硫杆菌发酵液处理和胞内蛋白提取两部分，涉及离心分离、萃取、纯化、冻干等步骤。解决了目前脱硫杆菌蛋白提取的问题，填补了国内脱硫杆菌胞内蛋白专利领域的空白。该方法通过发酵液离心分离、细胞破碎、蛋白提取与纯化实现脱硫杆菌胞内有效蛋白的分离纯化。本发明是一种易于操作、成本低、安全可靠的提取方法。本发明所得胞内蛋白，可用于脱硫杆菌的蛋白质学、蛋白质组学等领域的研究。
本专利选用的脱硫杆菌，其分类命名为脱硫硫杆菌，参据的微生物(株)为：NJYH5327，该菌株是本课题组自主筛选并包藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为CGMCC,保藏日期是2016年7月11日，登记入册的编号是CGMCC No.12756。
CGMCC No.12756菌株具有以下性质：
1、培养特征：
在固体LB培养基上培养，呈白色或淡黄色、微透明小圆点状，有光泽，边缘光滑整齐。
2、菌体形态特征：
在固体LB培养基上呈白色或淡黄色球形或椭圆型，直径0.5～1.7微米，单细胞外通常有一层荚膜。以极生鞭毛运动。
3、生理生化性质：
表1 CGMCC No.12756菌株生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用。
有益效果：
本发明所提供的方法操作程序简单，设备要求低，收率高。
保藏信息
上述硫杆菌其分类名为排硫硫杆菌，菌种的拉丁学名为Thiobacillusthioparus，参据的微生物(株)为：NJYH5327，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，保藏日期是2016年7月11日，登记入册的编号是CGMCCNo.12756。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
脱硫杆菌CGMCC No.12756选取单一菌落，挑取菌丝进行LB液体培养基进行活化培养，装液量(体积比)20％，温度为38℃，转速180rpm，培养5天。取活化后培养液进行液体发酵培养，发酵培养基组分：0.4g/L NH4Cl,0.8g/L MgSO4,4g/L K2HPO4,4g/L KH2PO4,10g/LNa2S2O3；培养条件：装液量(体积比)20％，接种量(体积比)8％，pH 7，温度38℃，转速180rpm，培养5天。取发酵培养液，以12000rpm，4℃条件离心20分钟，去除上清液，收集下层沉淀1g。将下层沉淀中加入2mL裂解液(裂解液配方：尿素8mol/L，CHAPS 40g/L，DDT0.04mol/L),在2℃、磁力搅拌转速为1500rpm条件下搅拌4小时。后将混液放入-20℃条件下冷冻10小时，取出后在2℃条件下超声破碎，超声破碎功率为300W，超声时间8秒，间隙5秒，持续时间30分钟。后再放入-20℃条件下冷冻10小时，取出后在2℃条件下超声破碎，超声破碎功率为300W，超声时间8秒，间隙5秒，持续时间30分钟。后将超声后的混合液在8000rpm，4℃条件下离心10分钟，取破碎后上清蛋白溶液1mL，加入有机混液(有机混液为甲醇：三氯甲烷：水：蛋白溶液(体积比)＝4：1：3：1)，充分搅匀震荡，后将混合液在8000rpm，4℃条件下离心10分钟，去除上清液，后加入甲醇，甲醇与离心后的蛋白体积比为4：1，充分搅匀震荡，将混合液在8000rpm，4℃条件下离心10分钟，循环去除上清液、加入甲醇、离心操作3次，后将离心混合物上清液去除，用冻干机冷冻干燥，密闭，将所提取的蛋白至于2℃条件下保存。
经HPLC检测，所提取胞内蛋白纯度在95％以上。
实施例2
脱硫杆菌CGMCC No.12756选取单一菌落，挑取菌丝进行LB液体培养基进行活化培养，装液量(体积比)25％，温度为36℃，转速160rpm，培养3天。取活化后培养液进行液体发酵培养，发酵培养基组分：0.3g/L NH4Cl,1.0g/L MgSO4,3g/L K2HPO4,5g/L KH2PO4,8g/LNa2S2O3；培养条件：装液量(体积比)25％，接种量(体积比)5％，pH 6.5，温度36℃，转速160rpm，培养3天。取发酵培养液，以8000rpm，6℃条件离心25分钟，去除上清液，收集下层沉淀1g。将下层沉淀中加入1mL裂解液(裂解液配方：尿素6mol/L，CHAPS 35g/L，ME 0.03mol/L),在4℃、磁力搅拌转速为1400rpm条件下搅拌3小时。后将混液放入-18℃条件下冷冻8小时，取出后在4℃条件下超声破碎，超声破碎功率为200W，超声时间10秒，间隙7秒，持续时间40分钟。后再放入-18℃条件下冷冻8小时，取出后在4℃条件下超声破碎，超声破碎功率为200W，超声时间10秒，间隙7秒，持续时间40分钟。后将超声后的混合液在6000rpm，6℃条件下离心8分钟，取破碎后上清蛋白溶液1mL，加入有机混液(有机混液为乙醇：三氯甲烷：水：蛋白溶液(体积比)＝6：2：4：1)，充分搅匀震荡，后将混合液在6000rpm，6℃条件下离心8分钟，去除上清液，后加入乙醇，乙醇与离心后的蛋白体积比为2：1，充分搅匀震荡，将混合液在6000rpm，6℃条件下离心8分钟，循环去除上清液、加入乙醇、离心操作2次，后将离心混合物上清液去除，用冻干机冷冻干燥，密闭，将所提取的蛋白至于2℃条件下保存。
经HPLC检测，所提取胞内蛋白纯度在90％以上。
实施例3
脱硫杆菌CGMCC No.12756选取单一菌落，挑取菌丝进行LB液体培养基进行活化培养，装液量(体积比)22％，温度为37℃，转速200rpm，培养7天。取活化后培养液进行液体发酵培养，发酵培养基组分：0.3g/L NH4Cl,1.0g/L MgSO4,3g/L K2HPO4,5g/L KH2PO4,12g/LNa2S2O3；培养条件：装液量(体积比)22％，接种量(体积比)7％，pH 6.8，温度37℃，转速200rpm，培养7天。取发酵培养液，以10000rpm，2℃条件离心30分钟，去除上清液，收集下层沉淀1g。将下层沉淀中加入1mL裂解液(裂解液配方：尿素7mol/L，CHAPS 30g/L，ME0.05mol/L),在4℃、磁力搅拌转速为1400rpm条件下搅拌3小时。后将混液放入-22℃条件下冷冻9小时，取出后在0℃条件下超声破碎，超声破碎功率为400W，超声时间5秒，间隙3秒，持续时间20分钟。后再放入-22℃条件下冷冻9小时，取出后在0℃条件下超声破碎，超声破碎功率为400W，超声时间5秒，间隙3秒，持续时间20分钟。后将超声后的混合液在7000rpm，2℃条件下离心5分钟，取破碎后上清蛋白溶液1mL，加入有机混液(有机混液为甲醇：二氯乙烷：水：蛋白溶液(体积比)＝2：1：2：1)，充分搅匀震荡，后将混合液在7000rpm，2℃条件下离心5分钟，去除上清液，后加入甲醇，甲醇与离心后的蛋白体积比为3：1，充分搅匀震荡，将混合液在7000rpm，2℃条件下离心5分钟，循环去除上清液、加入乙醇、离心操作4次，后将离心混合物上清液去除，用冻干机冷冻干燥，密闭，将所提取的蛋白至于0℃条件下保存。
经HPLC检测，所提取胞内蛋白纯度在93％以上。
Claims (10)
1.一种脱硫杆菌胞内有效蛋白的提取方法，其具体步骤如下：
(1)脱硫杆菌活化培养、液体发酵培养，取发酵液，离心，去除上清液，收集下层沉淀；
(2)取步骤(1)中下层沉淀，加入1～2mL/g裂解液，在0～4℃条件下磁力搅拌，放入-18～-22℃冷冻8～10小时；
(3)将步骤(2)中的冷冻物质，在0～4℃条件下超声破碎，后再次放入-18～-22℃冷冻8～10小时；
(4)将步骤(3)中得到的冷冻物质，在0～4℃条件下超声破碎，离心；
(5)取步骤(4)中离心得到的上清蛋白溶液，加入有机混合溶液，充分混匀震荡后离心；
(6)将步骤(5)中的离心后混合物，去除上清液，加入有机溶剂，充分混匀震荡，将混液离心；
(7)重复操作步骤(6)2～4次，将得到的离心后的混合物，去除上清液，冻干机冷冻干燥，密闭，0～4℃冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脱硫杆菌，其分类命名为排硫硫杆菌，菌种拉丁学名是Thiobacillus thioparus，参据的微生物：NJYH5327，保藏日期是2016年7月11日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.12756。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活化培养为：选取单一菌落，挑取菌丝接入活化培养基中进行活化培养；其中培养基为LB液体培养基；活化培养基的体积装液量为20％～25％，活化温度36～38℃，搅拌转速160～200rpm，活化时间为3～7天。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中液体发酵培养为：发酵培养基的体积装液量为20％～25％；体积接种量为5％～8％；培养条件pH 6.5～7，温度36～38℃，转速160～200rpm，培养时间3～7天；其中发酵培养基的组分为：0.3～0.5g/L NH4Cl,0.6～1.0g/L MgSO4,3～5g/L K2HPO4,3～5g/L KH2PO4,8～12g/L Na2S2O3。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中离心转速为8000～12000rpm，时间20～30分钟，温度2～6℃。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中裂解液为尿素、两性表面活性剂和还原保护剂的水溶液；裂解液中尿素的浓度6～8mol/L，两性表面活性剂的浓度为30～40g/L，还原保护剂的浓度为0.03～0.05mol/L；其中两性表面活性剂为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，还原保护剂为二硫苏糖醇或巯基乙醇。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中磁力搅拌转速为1400～1500rpm，磁力搅拌的时间为3～4小时。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)和(4)中超声破碎功率均为200～400W，超声时间均为5～10秒，间隙均为3～7秒，持续时间均为20～40分钟；步骤(4)、(5)和(6)中离心转速均为6000～8000rpm，离心时间均为5～10分钟，温度均为2～6℃。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(5)中有机混合溶液为醇、卤代烷烃与水的混合溶液；其中醇为甲醇或乙醇，卤代烷烃为三氯甲烷或二氯乙烷；醇、卤代烷烃、水和蛋白溶液的体积比为2～6：1～2：2～4：1。
10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(6)中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或正丁醇；有机溶剂与步骤(5)中蛋白溶液体积比为2～4：1。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN102707001A (zh) * | 2012-05-21 | 2012-10-03 | 天津大学 | 一种微藻蛋白组的分析方法 |
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