CN108330084A - 一种适用于高海拔低温环境的耐砷菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法 - Google Patents

一种适用于高海拔低温环境的耐砷菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于高海拔低温环境的耐砷菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法，该菌株鉴定为短芽孢杆菌，菌株号为1‑5，命名为短芽孢杆菌1‑5菌株(Brevibacillus 1‑5)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14767。该菌株能够耐受高浓度砷污染，将毒性态砷转化为非毒性态砷，有助于降低土壤中含砷量高的环保难题，且该菌在低温环境下也具有较强耐砷能力，能够用于高海拔及北方寒冷地区的土质改良，在制备土壤调理剂及砷污染修复剂等方面有良好的应用价值。

Description

一种适用于高海拔低温环境的耐砷菌株及基于该菌株制备微 生态制剂的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种适用于高海拔低温环境的耐砷菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法。
背景技术
砷是一种剧毒元素，自从1250年发现以来，已经发生了很多严重的砷中毒事件。全球至少有5000多万人正面临着地方性砷中毒的威胁。由于使用砷化合物的企业、采矿业及重金属冶炼等工业的迅速发展，已造成了我国土壤环境的严重砷污染。现已在我国的多个地区检测到了高浓度的砷，如贵州、湖南和新疆、西藏等地区均已发现了砷浓度为11—1200ppm的大面积土壤。砷通常是以 As3+和As5+的形式出现在土壤中，砷化合物的毒性极强，砷对人的中毒剂量为 0.01—0.052克，致死量为0.06—0.2克，已有相关研究发现高浓度的砷会增加患皮肤癌及膀胱、肾脏、肝脏和肺部肿瘤的风险。
我国矿产资源非常丰富，随着对矿产资源的开发也伴随严重的土壤砷污染。矿渣中的砷会在土壤中、水体中长期积累，然后含砷污染物会慢慢迁入到矿区相邻地区，使污染区域不断扩大。
因此，我们迫切需要一种对含砷尾矿及高砷土壤进行治理和修复的方法，能够阻止砷溶出、迁移进入地表及地下水体的高效的、经济实用的、环境友好型的技术方法。本方法属于国际上公认的、最有前途、最具潜力的砷污染土壤的处理方法——生物修复方法。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种适用于高海拔低温环境的耐砷菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
所述能够适用于低温环境的耐砷菌株已在2017年9月28日保藏于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14767，命名为Brevibacillus 1-5菌株，属于短芽孢杆菌。
其中，所述耐砷菌株适合生长温度为20—38℃，适合耐砷温度为22— 35℃。
优选地，所述耐砷菌株最适生长温度为34—38℃，最适耐砷温度25— 28℃。
所述解钾菌株的菌落表面光滑，不透明，菌落呈现淡黄色或深黄色，菌落直径5—8mm；能够利用葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉；能分解葡萄糖产生丙酮酸，能水解淀粉，卵磷脂酶水解实验阴性，明胶液化实验阳性。
所述耐砷菌株与作物无共生特点，对作物及其环境无害。
基于上述耐砷菌株制备微生态菌剂的固体发酵方法包括如下步骤：
(1)将麦麸、草炭、硅藻土按质量比(5—9):(1.5—2.5):1，优选为7:2:1混和均匀，得混合物，向混合物中加入质量为混合物质量1—1.5倍，优选为1.1 倍的蒸馏水，调节pH至7，高温灭菌，得混合培养基；
(2)挑取耐砷菌株接种到LB液体培养基中，于28℃下震荡培养，培养至菌液 OD600值为0.3—0.7，优选为0.5时取培养液，将培养液与LB液体培养基按体积比1:(18—22)，优选为1:20的比例混匀，于37℃下震荡培养20—28h，优选为 24h，获得种子菌液；
(3)将种子菌液按10％的接种量接种到混合培养基中，于25—37℃下培养45 —50h，至复合物中的活菌数达到4.0×1010cfu/g，得达到活菌数要求的菌剂，将菌剂干燥至含水量≤5％，即得耐砷菌微生态菌剂。
基于上述耐砷菌株制备微生态制剂的液体发酵方法是将耐砷菌株接种至液体培养基，于37℃、转速180rpm条件下发酵培养20—28h，优选为24h，得发酵液，即为耐砷菌微生态菌剂；或者，将发酵液进行干燥后得干燥物，即为耐砷菌微生态菌剂；所述液体培养基基配方为：LB肉汤20—30g/L，七水硫酸亚铁 40—50g/L，硫酸铵2—5g/L，硫酸氢二钾0.3—0.7g/L，七水硫酸镁0.3— 0.7g/L，氯化钾0.08—0.12g/L，硝酸钙0.008—0.012g/L，自然pH。优选地，所述液体培养基基配方为：LB肉汤25g/L，七水硫酸亚铁45g/L，硫酸铵3g/L，硫酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.1g/L，硝酸钙0.01g/L，自然 pH。
上述耐砷菌株可用于制备生物发酵有机肥，还可以用于制备土壤调理剂、改良剂或砷土壤修复剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供的菌株Brevibacillus 1-5及其发酵培养制备得到耐砷菌剂可以耐受砷浓度高达15—20g/L，并能在3—4天内将80％毒性砷转化为无毒性砷，能有效降低土壤中的砷污染程度，且该菌在低温环境下也具有较强的耐砷能力，能够用于高海拔及北方寒冷地区的土质改良。
2.本发明提供的耐砷菌剂制备方法简单，生产效率高，能实现工业化大生产，可与有机肥混合使用，也可以单独使用，对保持农业生态环境的平衡均具有极其重要意义和应用价值。
具体实施方式
实施例1耐砷菌的筛选与分离
自西藏河谷青稞种植地区、海拔3600米以上的土壤取样，空运寄回后立即分离；富集培养基成分为：砷酸钠150mmol/L，LB肉汤25g/L，七水硫酸亚铁45g/L，硫酸铵3g/L，硫酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.1g/L，硝酸钙0.01g/L，自然pH；试验分离出若干具有耐砷能力的菌株，接入试管斜面；摇瓶液体发酵进行复筛，将砷酸钠浓度提高至200mmol/L，获得耐砷能力最高的菌株1-5。
实施例2耐砷菌1-5的鉴定
根据《伯杰氏细菌学手册》对耐砷菌1-5进行生理生化鉴定，观察菌落形态，获取耐砷菌1-5的形态特征。菌株1-5在固体培养基上的菌落表面光滑，不透明，菌落呈现淡黄色或深黄色，菌落直径5—8mm；显微镜下观察该菌为短杆状，革兰氏染色阴性；能够利用葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉；能分解葡萄糖产生丙酮酸，能水解淀粉，卵磷脂酶水解实验阴性，明胶液化实验阳性。裂解法提取菌株1-5的总DNA，扩增出16s rDNA进行细菌分子鉴定，扩增产物经上海迈浦生物科技有限公司测序，并与GenBank数同源性比对，确定为Brevibacillus。
实施例3菌种的驯化
采用驯化培养基对所述菌株进行驯化，驯化培养基1成分为：高砷精金矿粉10g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.1g/L，硝酸钙0.01g/L，pH为1.5；将筛选得到Brevibacillus 1-5菌液1mL接入装有10 mL驯化培养基1的三角瓶中，温度为37℃，转速为200rpm条件下培养3d，取由驯化培养基1培养后的菌液1mL接入装有10mL驯化培养基2的三角瓶中，驯化培养基2的营养成分为：高砷精金矿粉200g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾 0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.1g/L，硝酸钙0.01g/L，pH为1.5，于 35℃，200rpm条件下培养3d后进行转接，重复转接10次，得到菌浓度为108—109个/mL的耐砷菌液。
实施例4耐砷菌Brevibacillus 1-5固体发酵制备微生态菌剂
(1)将麦麸、草炭、硅藻土按质量比7:2:1混和均匀，加入所述麦麸、草炭和硅藻土混合物总质量1.1倍的蒸馏水，调节pH至7，高温灭菌。
(2)挑取耐砷菌Brevibacillus 1-5接种到100mL LB液体培养基中，于28℃下震荡培养，培养至菌液OD600值约为0.5时取培养液，将培养液与LB液体培养基按体积比1:20的比例混匀，于37℃下震荡培养24h，获得种子菌液。
(3)将种子菌液以10％的接种量接种到(1)中所述混合物中，25—37℃下培养48h，至复合物中的活菌数达到4.0×1010cfu/g，将达到活菌数要求的菌剂在 40℃下干燥至含水量≤5％，得到Brevibacillus 1-5菌剂。
实施例5耐砷菌Brevibacillus 1-5液体发酵制备微生态菌剂
液体培养基配方为砷酸钠125mmol/L，LB肉汤25g/L，七水硫酸亚铁45 g/L，硫酸铵3g/L，硫酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.1g/L，硝酸钙0.01g/L，自然pH。培养温度为37℃，转速180rpm，培养时间24h，得发酵液可以直接用于土壤中，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于土壤的耐砷及其转化处理。

Claims (10)

1.一种能够适用于低温环境的耐砷菌株，其特征在于，所述耐砷菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14767，命名为Brevibacillus 1-5菌株。
2.如权利要求1所述的耐砷菌株，其特征在于，所述耐砷菌株适合生长温度为20—38℃，适合耐砷温度为22—35℃。
3.如权利要求2所述的耐砷菌株，其特征在于，所述耐砷菌株最适生长温度为34—38℃，最适耐砷温度25—28℃。
4.如权利要求1所述的耐砷菌株，其特征在于，所述解钾菌株的菌落表面光滑，不透明，菌落呈现淡黄色或深黄色，菌落直径5—8mm；能够利用葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉；能分解葡萄糖产生丙酮酸，能水解淀粉，卵磷脂酶水解实验阴性，明胶液化实验阳性。
5.如权利要求1所述的耐砷菌株，其特征在于，所述耐砷菌株与作物无共生特点，对作物及其环境无害。
6.基于权利要求1至5任一项所述耐砷菌株制备微生态菌剂的固体发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将麦麸、草炭、硅藻土按质量比(5—9):(1.5—2.5):1混和均匀，得混合物，向混合物中加入质量为混合物质量1—1.5倍的蒸馏水，调节pH至7，高温灭菌，得混合培养基；
(2)挑取耐砷菌株接种到LB液体培养基中，于28℃下震荡培养，培养至菌液OD600值为0.3—0.7时取培养液，将培养液与LB液体培养基按体积比1:(18—22)的比例混匀，于37℃下震荡培养20—28h，获得种子菌液；
(3)将种子菌液按10％的接种量接种到混合培养基中，于25—37℃下培养45—50h，至复合物中的活菌数达到4.0×1010cfu/g，得达到活菌数要求的菌剂，将菌剂干燥至含水量≤5％，即得耐砷菌微生态菌剂。
7.基于权利要求1至5任一项所述耐砷菌株制备微生态制剂的液体发酵方法，其特征在于，所述方法是将耐砷菌株接种至液体培养基，于37℃、转速180rpm条件下发酵培养20—28h，得发酵液，即为耐砷菌微生态菌剂；或者，将发酵液进行干燥后得干燥物，即为耐砷菌微生态菌剂；所述液体培养基基配方为：LB 肉汤20—30g/L，七水硫酸亚铁40—50g/L，硫酸铵2—5g/L，硫酸氢二钾0.3—0.7g/L，七水硫酸镁0.3—0.7g/L，氯化钾0.08—0.12g/L，硝酸钙0.008—0.012g/L，自然pH。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体培养基基配方为：LB肉汤25g/L，七水硫酸亚铁45g/L，硫酸铵3g/L，硫酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.1g/L，硝酸钙0.01g/L，自然pH。
9.如权利要求1至5任一项所述耐砷菌株在制备生物发酵有机肥中的应用。
10.如权利要求1至5任一项所述耐砷菌株在制备土壤调理剂、改良剂或砷土壤修复剂中的应用。
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