CN103184171A

CN103184171A - 猪肺炎支原体dj-166株及其应用

Info

Publication number: CN103184171A
Application number: CN2011104500296A
Authority: CN
Inventors: 车艳杰; 王海燕; 王勇鹣; 张锋; 高玉梅; 赵亚荣
Original assignee: FUZHOU DA BEI NONG BIOTECH Co Ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: CN103184171B

Abstract

本发明属于兽医微生物技术领域，特别涉及猪肺炎支原体DJ-166株及其应用。该株猪肺炎支原体可用于制备成预防用兽用生物制品或兽药。实验证实：本发明的猪肺炎支原体DJ-166株在制备的无细胞培养培养基中，活菌滴度高，均达到10^10-11CCU/ml，可大大降低生产成本；其免疫原性好，平均肺炎病变减少率可达80％以上。

Description

猪肺炎支原体DJ-166株及其应用

技术领域

本发明属于兽医微生物技术领域，特别涉及猪肺炎支原体DJ-166株及其应用。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体引起的一种猪的接触性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。据资料报道，世界各地分离的猪肺炎支原体均属于同一血清型，但分离株之间抗原性有很大差异。1992年Frey首次证实了猪肺炎支原体分离株之间抗原性的差异；1996年，Artiushin和Minion进一步证实了Frey的观点；1999年，Kokotovic也同样证实了这一结论。因此，分离出一株抗原性较好的猪肺炎支原体菌株进行疫苗和诊断试剂盒应用，对防治猪支原体肺炎至关重要，特别是分离出一株适合制备灭活疫苗的菌株，将填补国内无自主研发猪喘气病灭活疫苗的空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一株新的抗原性好的猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)。

本发明的另一目的在于提供该株猪肺炎支原体在制备用于猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药中的应用。

本发明还提供了该株猪肺炎支原体在制备疫苗或免疫诊断用试剂盒中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株，其微生物保藏号为CGMCC No.4545。

本发明的猪肺炎支原体DJ-166株可用于制备猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药。

进一步，本发明的猪肺炎支原体DJ-166株可用于制备疫苗。

所述的疫苗包括：灭活疫苗、基因工程疫苗。

本发明的猪肺炎支原体DJ-166株也可用于制备免疫诊断用试剂盒。

所述的免疫诊断用试剂盒包括抗体检测试剂盒、抗原检测试剂盒。

有益效果

本发明的猪肺炎支原体DJ-166株CGMCC No.4545为申请人自行分离得到，在制备的无细胞培养基中培养，活菌滴度可达10¹⁰～10¹¹CCU/ml，降低生产成本；其免疫原性好，平均肺炎病变减少率可达80％以上。

本发明的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株为申请人从山西养猪场35日龄二元杂交病猪肺脏组织分离得到，以江苏省地方标准(DB32/T 1461-2009)猪肺炎支原体检测PCR法，设计引物扩增出特异性猪肺炎支原体P36基因片段，经过基因测序后，初步确定为猪肺炎支原体。然后又经多重PCR(猪鼻支原体、猪絮状支原体和猪肺炎支原体)、培养特性、生化特性和血清学特性鉴定，证明为猪肺炎支原体，纯净。菌株在人工合成培养基传8代稳定后，经过3次克隆纯化后制备得到该株猪肺炎支原体。本发明的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申请人已于2011年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.4545。

附图说明

图1猪肺炎支原体DJ-166株PCR鉴定

其中，M：DNA标准DL 2000；1：DJ-166株扩增产物；2：阳性对照；3：阴性对照

图2猪肺炎支原体DJ-166株多重PCR鉴定

其中，M：DNA标准DL 2000；1：阴性对照；2：猪肺炎支原体阳性对照；3：组织样品(DJ-166株)；4：猪鼻支原体阳性对照；5：猪絮状支原体阳性对照；6：猪鼻支原体、猪絮状支原体和猪肺炎支原体阳性对照

图3猪肺炎支原体DJ-166株菌落间接表面荧光试验结果

具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例1本发明猪肺炎支原体DJ-166株分离鉴定

1培养基及其配制

液体培养基：

A液：脑心浸出液2.0g、PPLO肉汤5.0g、去离子水300ml

以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116℃高压灭菌20分钟，冷却后备用；

B液：10×Hank’s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸钠0.8g、

蛋白胨3.0g、硫代硫酸钠0.1g、0.1％酚红10ml、青霉素400U/ml、去离子水545ml。

以上各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用；

C液：健康马血清140ml

将A液、B液和C液充分混合均匀，1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6，制得猪肺炎支原体液体培养基。

固体培养基：在1000ml液体培养基的基础上添加：琼脂8.0g。

2病肺组织采集

用每毫升含2000个单位青霉素的生理盐水洗去血液和组织碎片后，无菌操作剪取有猪喘气病特征病变和健肺交界处肺组织块。

3病料PCR鉴定

按照江苏省地方标准(DB32/T 1461-2009)猪肺炎支原体检测PCR法进行。

3.1引物设计与合成

P1(序列1)：5’-TTACAGCGGGAAGACC-3’

P2(序列2)：5’-CGGCGAGAAACTGGATA-3’

预计扩增片段长度约为427bp。

3.2病料DNA提取

取约1.0g病料，剪碎后匀浆器加5.0ml液体培养基研磨成糊状，先低速4000r/min离心2min，上清再以12000r/min离心20min，弃上清，沉淀用250μlTE缓冲液重悬。煮沸10min，12000r/min离心3min，取上清-20℃保存备用。

3.3PCR反应

PCR扩增体系为：10×buffer 5.0μl，MgCl₂(25mM)2.0μl，dNTP(2.5mM)3.0μl，引物P1(50pmol/μl)0.5μl，引物P2(50pmol/μl)0.5μl，模板DNA 2.0μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，加双蒸水至50μl。反应条件为：95℃预变性8min，80℃1min进行热启动后加酶，98℃变性1s，49℃退火1min，72℃延伸2min，34个循环，72℃终延伸10min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

病料组织扩增片段长度约为427bp，见图1。

4菌株驯化及克隆纯化

4.1病料处理及菌株驯化

将猪肺炎支原体PCR检测阳性病料用每毫升含2000个单位青霉素生理盐水洗去血液和组织碎片后，将猪肺炎病灶及其邻近健康组织剪成芝麻粒大颗粒，接入含50％猪鼻支原体特异性血清、0.001％醋酸铊和每毫升含800单位青霉素的液体培养基中，共接种2管，每管放入10粒，置37℃培养。每间隔6日盲传1次，每日观察培养基pH变化，前3代均加入50％猪鼻支原体特异性血清。在传至第5代时，培养基颜色发生改变，传至8代后，即可出现pH规律性下降。

4.2克隆纯化

将传至第8代收获的培养物进行10倍系列稀释至10^-10，将10^-3、10^-4、10^-53个稀释度分别取出0.1ml接种于固体培养基平板上，置37±1℃ 5％CO₂培养箱培养10日，可见针尖大小菌落，在显微镜下挑取边缘整齐、外周质地疏松、中央致密单个菌落，接种液体培养基，37±1℃培养7日。按以上方法对菌落连续克隆3次后的培养液作为第1代菌种，命名为DJ-166株。

5PCR鉴定及测序

5.1PCR鉴定

将克隆后收获菌液提取的DNA按照上述3.3项进行PCR反应，结果均扩增出约427bp的目的片段。

5.2多重PCR鉴定

5.2.1多重PCR引物序列

mhp-f(序列3)：5’-TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3’；

mhr-f(序列4)：5’-GGGAAGAAAAAAATTAGGTAGGG-3’；

mfl-f(序列5)：5’-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3’；

m-r(序列6)：5’-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3’；

预计猪肺炎支原体扩增片段长度约为1000bp；猪鼻支原体扩增片段长度约为1129bp，猪絮状支原体扩增片段长度约为754bp。

5.2.2多重PCR反应

PCR扩增体系为：10×buffer 5.0μl，MgCl₂ 75nM，dNTP 10nM，上游引物均为8pmol，下游引物为12pmol，模板DNA 2.0μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，加双蒸水至50μl。反应条件为：95℃预变性8min，94℃变性30s，54.6℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸10min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

结果见图2。筛选出无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的猪肺炎支原体菌株。

5.3PCR产物的回收与测序

用凝胶回收试剂盒回收无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的猪肺炎支原体菌株PCR扩增为427bp的目的片段，将其克隆入pEASY-T1载体中，构建重组质粒，经PCR鉴定后由美国Invitrogen生命技术公司，用M13F引物测序，进行序列分析。

测序结果(序列7)如下：

CGGCGAGAAACTGGATATTCAAGTTCTTATTCGTAATTTGAGCTATCAATTCCGGTTAGTTTAGAATAAGCACAGAAACATTCACCGGCAATTTTAATATTTGAATAAGCAACAAAAGATGAATCACCATGTTCACCCATCACGTAGGCCTGAACCGAATTAGGCGATACTTTTGCTCTTTTTGCGATTGCAAATTGAAGCCTTGCTGTATCTAAAACAGTTCCACTACCGATAACTTTTTGATCGGAAAATCCAGATGCATCCCGGTAAGCCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAACAATAATACTTATTCCACTAAAGCCACTTTCTTTGACTTTTAGTGCAATTTCCCGGATAATTCGGATGTTATCAGCTACTAATTCAAGCCGAGTTTCACCCGGTTTTTGTGGTCTTCCCGCTGTAA

应用DNAStar软件将测序片段与猪肺炎支原体已公开序列的J株、168株、7448株和232株进行序列片段比对，猪肺炎支原体DJ-166株在碱基29位为A，J株为T；在碱基47位，DJ-166株为C，168株为T；在碱基48位，DJ-166株为A，7448株为G；在碱基79位、258位和402位，DJ-166株分别为C、T、C，232株为T、A、T。经NCBI Blast分析结果显示，DJ-166株与J株、168株、7448株、232株同源性为99％，进一步证明分离株为猪肺炎支原体。

实施例2本发明猪肺炎支原体DJ-166株生物学特性

1培养特性

将猪肺炎支原体DJ-166株接种于液体培养基中，37±1℃ 5％ CO₂条件下，培养5-9日，菌液呈轻度混浊，pH由7.6下降至6.5-7.0；在固体培养基上，生长缓慢，5％二氧化碳、37±1℃条件下培养7-10日，可见针尖大小菌落，显微镜下观察可见边缘整齐、外周质地疏松、中央致密菌落；将猪肺炎支原体DJ-166株菌液接种含青霉素和醋酸铊的培养基中，菌液生长无抑制。

2形态和生化特性

菌液涂片姬姆萨染色后，油镜观察呈多形性，可见到环状、丝状、点状、杆状或两极状等无细胞壁菌体；具有代谢葡萄糖产酸的生化特性。

3血清学特性

3.1生长抑制试验

在含有猪肺炎支原体抗血清的固体培养基表面，37℃ 5％ CO₂恒温培养箱培养10，无菌落生长，呈现特异的猪肺炎支原体生长抑制。

3.2代谢抑制试验

在含有猪肺炎支原体抗血清的液体培养基中，37℃恒温培养箱培养15日，pH值不下降，呈现特异的葡萄糖代谢抑制。

4间接菌落表面免疫荧光试验

菌落与支原体特异性抗体反应，与标记抗体结合后，荧光显微镜下观察呈现明亮的黄绿色荧光，见图3。

5溶血试验

挑取菌落接种于含鸡红细胞的固体培养基上培养2-3，菌落周围无溶血现象。

6精氨酸利用试验

挑取菌落接种于含精氨酸及酚红指示剂的液体培养基中，指示剂不变色，试验为阴性。

7薄膜和斑点形成试验

挑取菌落接种于含马血清的固体培养基上，菌落表面和周围不形成薄膜和斑点。

8红细胞吸附试验

将0.25％鸡红细胞液滴加于菌落上，静止后弃去红细胞液，用生理盐水冲洗2-3次，低倍镜下菌落表面和周围吸附有大量红细胞。

实施例3猪肺炎支原体DJ-166株活菌滴度测定

猪肺炎支原体DJ-166株在制备的无细胞培养基中(配制原料及方法见实施例1)，活菌滴度测定结果为10¹⁰-10¹¹CCU/ml，见表1。

表1猪肺炎支原体DJ-166株3次活菌浓度测定结果

实施例4猪支原体肺炎灭活疫菌《DJ-166株》制备

1水相制备

将收获猪肺炎支原体DJ-166株CGMCC No.4545菌液以2000r/min离心10分钟，弃掉沉淀，上清液以10000r/min离心60分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用pH7.2-7.4 Tris-NaCl缓冲液洗涤，离心洗涤3次后，配制成原培养物体积1/100菌悬液。加入1.0％硫柳汞使其终浓度为0.01％，混合均匀。置2-8℃灭活12小时，期间振摇1次，然后经超声裂解4次，每次1分钟(功率250-300W，超声5秒，间歇5秒)。经灭活和无菌检验合格后，用pH7.2-7.4Tris-NaCl缓冲液稀释至蛋白浓度为300μg/ml。

2油相制备

将矿物油佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟，冷却后备用。

3乳化

先将1份油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入1份水相后，以10000r/min搅拌5-8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。

疫苗经无菌、性状、安全和效力等检验均合格。

实施例5猪肺炎支原体DJ-166株免疫原性比较

实施例4制备的疫苗与国内市场上销售的进口苗，分别颈部肌肉注射2周龄健康易感猪各10头，每头2.0ml，另设10头作为对照猪，同条件下隔离饲养。注射后28日，连同条件相同对照猪进行攻毒，并于攻毒后28日剖杀，按28分计分法记录猪肺炎病变分数，按下列公式计算肺炎病变减少率，结果见表2。

表2猪肺炎支原体DJ-166株免疫原性比较结果

注：“/”表示无此项计算。

从表2结果可以看出，进口疫苗肺炎病变率平均减少79.3％；本发明分离株DJ-166株制备的疫苗肺炎病变率平均减少86.2％，优于进口疫苗。

实施例6猪肺炎支原体抗体检测试剂盒的制备及应用

1猪肺炎支原体抗体检测试剂盒制备及使用方法

1.1抗原包被板制备

1.1.1包被用稀释液将猪肺炎支原体DJ-166株CGMCC No.4545菌体蛋白稀释至工作浓度，包被酶标板，100μl/孔，密封后置2-8℃作用16小时。

1.1.2洗涤每孔加入350μl洗涤液，室温作用3分钟，甩出洗涤液，拍干，重复3次。

1.1.3封闭加入封闭液，每孔300μl，37℃作用1小时。按照1.1.2项洗涤，自然干燥。

1.2在抗原包被板上分别设定阴性对照和阳性对照孔，每孔100μl阴性对照。

1.3剩余孔加入待检血清，每孔100μl，置37℃孵育30分钟。

1.4将各孔中的液体倒掉后，每孔加入350μl洗涤液，重复洗涤3次。

1.5加入酶标二抗工作液，100μl/孔。

1.6置37℃孵育60分钟后重复步骤3.4。

1.7加入底物显色液每孔100μl，37℃避光显色15分钟。

1.8每孔加入50μl终止液，终止反应，在450nm下测定吸光值。

1.9检测样品有效性阳性血清对照平均值减去阴性血清对照平均值，其差值大于或等于0.150，阴性对照平均值必须小于0.150，试验方可成立。

1.10结果判定

1.10.1 S/P＜0.3，判为血清猪肺炎支原体抗体阴性。

1.10.2 0.3≤S/P≤0.4，判为血清猪肺炎支原体抗体可疑。

1.10.3 S/P＞0.4，判为血清猪肺炎支原体抗体阳性。

2猪肺炎支原体抗体检测试剂盒应用

临床收集的296份血清，通过间接血凝抑制试验确定猪肺炎支原体阳性血清为129份，可疑为6份，阴性为161份。296份血清分别采用某公司猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和本发明的试剂盒进行检测，结果见表3。

表3血清ELISA抗体检测结果比较

本发明试剂盒阳性检出率高于市场上某公司生产销售的猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒。

Claims

1.一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株，保藏号为CGMCC No.4545。

2.权1所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备用于猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药中的应用。

3.权1所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备疫苗中的应用。

4.权1所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备灭活疫苗或基因工程疫苗中的应用。

5.权1所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备免疫诊断用试剂盒中的应用。

6.权1所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备猪肺炎支原体抗体检测试剂盒中的应用。

7.权1所述的猪肺炎支原体DJ-166株在制备猪肺炎支原体抗原检测试剂盒中的应用。