CN112011489B - 富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法、培养基以及培养基的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基及其制备方法，所述培养基的组分包括marine broth 2216、脑心浸液琼脂、琼脂、FeCl₃、L‑半胱氨酸、GVPC、葡萄糖和热灭活的绵羊红细胞。此外，本发明还提供了一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法。本发明提供的从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基和方法，既可以有效抑制样品中其他杂菌的生长，降低分离难度，又有利于弗朗西斯菌及其邻近类群物种的生长，从而可以使弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种出现的个体数量增加，增加物种多样性，从而显著提高目标微生物被分离的概率。

Description

富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法、培养基以 及培养基的制备方法

技术领域

本发明属于微生物分离培养技术领域，具体涉及一种从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法、培养基以及培养基的制备方法。

背景技术

弗朗西斯菌科(Francisellaceae)是具有重要临床意义的病原菌，它们具有胞内寄生、宿主免疫逃逸机制以及伤口接触污染水源、土壤或食物的传播方式等特征。土拉热病(Tularemia)是由土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)引起的可导致人类和各种动物急性死亡的疾病，其临床感染主要与接触疫水、节肢动物叮咬及猎杀野生动物后剥皮过程的气溶胶吸入有关，且具有“自然宿主众多、传播途径多样、临床表现多样”等特征。目前，世界范围仍有土拉热病的散发和暴发流行，并且，该病临床诊断困难且对头孢菌素类抗生素天然耐药。

依据《伯杰氏系统细菌学手册》第二版，弗朗西斯菌(Francisellaceae)隶属γ-变形菌纲，硫发菌目(Thiotrichales)，弗朗西斯菌科(Francisellaceae)。目前，弗朗西斯菌科(Francisellaceae)仅包括一个单一的弗朗西斯菌属(Francisella)，弗朗西斯菌属包括土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)、新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)和蜃楼弗朗西斯菌(F.philomiragia)等菌种，模式菌种为土拉弗朗西斯菌。

弗朗西斯菌属是一类革兰氏阴性、镜下呈沙粒状、无芽孢、无鞭毛、无动力的短杆菌或球杆菌，可胞内寄生，长时间培养后呈多形性，可呈球状、杆状和丝状，菌体直径在0.2μm-1.7μm，具有一定的抗酸性，L-半胱氨酸可促进该菌属生长，但并非生长所必需。弗朗西斯菌属为严格需氧性细菌，属内仅西班牙弗朗西斯菌(F.hispaniensis)触酶阴性，其余均为弱阳性。Kovacs改良法氧化酶试验时，土拉弗朗西斯菌、蜃楼弗朗西斯菌和西班牙弗朗西斯菌呈现阳性，船城弗朗西斯菌(F.noatunensis)氧化酶阴性。利用16S rDNA序列相似度分析，能将大部分弗朗西斯菌鉴定到亚种水平，一些管家基因，如rpoB、shdA、mdh、groEL、rpoA、pgm和atpA是鉴定弗朗西斯菌的辅助鉴定靶位，对某些种间16S rDNA具有较高一致性的弗朗西斯菌，根据管家基因序列相似度与重建的系统发育树能将弗朗西斯菌准确鉴定到种。

弗朗西斯菌及其邻近类群物种(包括弗朗西斯菌科(Francisellaceae)、苛养杆菌科(Fastidiosibacteraceae)以及其他亲缘关系相近的菌种)在自然界中的存在广泛，且生态环境复杂多变，其不仅存在于各种淡水和咸水环境中，水生环境中的单细胞原虫、水生浮游动物以及节肢动物和脊椎动物等，也均可能成为其繁殖和扩散的载体。但目前弗朗西斯菌及其邻近类群物种的物种资源仍相对匮乏，弗朗西斯菌科、苛养杆菌科(Fastidiosibacteraceae)和柯克斯体科(Coxiellaceae)中已描述的物种数量均不超过10个。弗朗西斯菌等相关类群细菌对于疾病具有潜在的致病性，且部分菌种致病能力强、自然宿主多、传播途径多样、对社会危害性大；故认知这些类群的物种多样性及分布规律，对于其流行病学预防尤为重要。

科赫法则认为，纯培养是一切感染性疾病研究的基础。微生物纯培养的获得，不仅是感染性疾病诊断、耐药性、致病性和流病学调查研究的基础，也是后续减毒活疫苗研发和疾病预防和治疗的基础。鉴于弗朗西斯菌及其邻近类群物种具有重要临床意义，故其纯培养研究亦具有十分重要的研究价值。

弗朗西斯菌属于苛养性细菌，专性需氧，对分离培养要求较高，培养时间较长且培养难度大。目前尚无弗朗西斯菌分离培养的标准方法，较为常用的人工培养基有CHAB、巧克力平板、TM平板(Tyayer-Martin agar)和缓冲活性碳酵母平板(BCYEα)。弗朗西斯菌在分离过程中容易被其他微生物覆盖。培养基中可以根据环境样品分离需要添加不同的抗生素制作成选择培养基，可提高环境样品中弗朗西斯菌的分离效率，如CHAB-A平板、CHAB-PACCV平板、BCYEα-GVPC平板等。除了添加抗生素之外，在接种前对样品进行酸处理和热处理也可抑制样品中其他微生物的生长(详见：顾全,屈平华,陈守义,朱庆义.弗郎西斯菌分类鉴定与流行趋势的研究进展[J].微生物学通报,2015,42(02):393-399)。

现有用于弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种分离培养，特别是用于海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种分离培养的培养基和方法，可在一定程度上抑制样品中其他微生物的生长，降低弗朗西斯菌及其邻近类群物种的分离难度，但仍不能满足弗朗西斯菌及其邻近类群物种纯培养的要求，目标微生物检出率低，目标微生物被分离的概率低，从而不利于弗朗西斯菌及其和/或其邻近类群物种中的新物种的分离和物种多样性的描述。

发明内容

本发明的其中一个目的在于提供一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基及其制备方法。本发明提供的培养基，既可以有效抑制样品中其他杂菌的生长，降低目标微生物分离难度，又有利于弗朗西斯菌及其邻近类群物种的生长，从而可以使弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种出现的个体数量增加，物种多样性增加，显著提高目标微生物被分离的概率。

根据本发明的另一个目的在于提供一种可以从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法，利用本发明的方法，可以使目标微生物可以有效检出。

根据本发明的一个方面，提供了一种富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基，其中，每1L培养基中，包括以下组分：marine broth 2216 30-45g，脑心浸液琼脂20-30g，琼脂1-10g，FeCl₃ 0.2-0.5g，L-半胱氨酸0.2-0.6g，GVPC 10-30mL，葡萄糖5-15g和浓度为3-8％的热灭活的绵羊红细胞20-60mL。

本发明中，所述弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种包括弗朗西斯菌科(Francisellaceae)、苛养杆菌科(Fastidiosibacteraceae)以及其他亲缘关系相近的菌种；而所述其他亲缘关系相近的菌种包括：鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)和硫发菌科(Thiotrichaceae)等。

本发明通过选择CHAB培养基作为基础培养基，结合弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的生长特性以及模拟海水环境多盐离子环境，通过调整部分组分的用量以及添加marine broth 2216、FeCl₃和GVPC等成分，对CHAB培养基进行了优化，使其可以有效抑制除目标微生物以外的杂菌的生长，并为目标微生物的生长模拟良好的海水原生态环境，促进目标微生物的生长，从而可以有效提高海水环境样品中目标微生物被分离的概率。

在一些实施方式中，培养基的pH可以为6.8-7.2。

在一些实施方式中，每1L培养基中，可以包括以下组分：marine broth 2216 35-40g，脑心浸液琼脂23.5-27.5g，琼脂4-6g，FeCl3 0.30-0.35g，L-半胱氨酸0.35-0.45g，GVPC 18-22mL，葡萄糖9-11g和浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞35-45mL。

在一些实施方式中，每1L培养基中，可以包括以下组分：marine broth 221637.4g，脑心浸液琼脂25g，琼脂5g，FeCl₃ 0.325g，L-半胱氨酸0.4g，GVPC 20mL，葡萄糖10g和浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞40mL。

根据本发明的另一个方面，提供了上述培养基的制备方法，包括如下步骤：

取marine broth 2216，加水后加热溶解，然后去除杂质，得A液；

取脑心浸液琼脂和琼脂，加水溶解，得B液；

取FeCl₃、L-半胱氨酸和葡萄糖，加水溶解后，过滤除菌，然后加入GVPC和热灭活的绵羊红细胞，混合，得C液；

将A液和B液混合，调节pH，灭菌，然后与C液混合，倒平板，即得。

本发明提供的CHAB改良培养基的制备工艺简单，可以有效保留各成分的活性，制得的培养基有利于弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的生长，目标微生物的分离效果好。

在一些实施方式中，A液、B液和C液的体积比可以为3-6:3-6:1。由此，有利于A液、B液和C液的除菌处理和混合均匀。

在一些实施方式中，配制A液和B液所用的水可以为蒸馏水，配制C液所用的水可以为高压灭菌后的蒸馏水。

根据本发明的又一方面，提供了一种从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法，包括如下步骤：

(1)将海水环境样品浓缩后，加入0.5-1.5倍体积、pH为2.0-2.4的酸处理液，混合后静置3-10min，得预处理过的样品；

(2)取预处理过的样品涂布于本发明提供的培养基，然后将培养基置于培养箱，培养3-7天；

(3)对培养得到的微生物进行镜下形态观察和/或生理生化试验，依据弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的镜下形态特征和/或生理生化反应特性进行筛选并挑取单个菌落进行分离与纯培养，然后将纯化后的微生物进行分类鉴定，获得最终分离的目标微生物的种类和数量。

本发明发明人研究团队长期从事弗朗西斯菌及其邻近类群物种的分类鉴定、物种多样性及分布规律的研究，根据发明人研究团队多年从事分离弗朗西斯菌科细菌的经验，样本前处理策略以及培养基的选择和优化等，均可以大幅度提高弗朗西斯菌科细菌的分离培养效果，并增加其相关类群的物种多样性描述。

在2016年至2018年间，发明人研究团队通过对弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的分离与纯培养方法进行了采用对样本进行浓缩、酸处理等前处理策略以及对培养条件进行优化等方面的改进，抑制了目标菌以外的杂菌的生长，并显著提高了分离的阳性率，在181份海水和盐水湖样本中检出49份阳性样品(阳性率为27.07％)，并分离和描述了另弗朗西斯菌属(Allofrancisella)、假弗朗西斯菌属(Pseudofrancisella)、嗜半胱氨酸菌(Cysteinphilum)、苛养杆菌属(Fastidiosibacter)、易生杆菌属(Facilibium)和海盐弗朗西斯菌(Francisella salimarina)等5个属10余种。此后，发明人进一步对培养基进行了选择和优化，进一步提高了杂菌的抑制率和分离的阳性率。

通过本发明提供的从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法，发明人初步在48份海水中分离到31份阳性水样，且进一步在近海浅海中分离出2个分类地位介于弗朗西斯菌科和军团菌目之间潜在新科，以及多个弗朗西斯菌科和苛养杆菌科菌种。

在一些实施方式中，酸处理液可以为含有KCl和HCl的溶液。

在一些实施方式中，酸处理液可以由浓度为14.9g/L的KCl溶液和浓度为16.7g/L的HCl溶液按体积比18：1配制而成。

在一些实施例中，步骤(2)中培养箱培养的培养条件可以包括：20℃-30℃，5％CO₂。

在一些实施方式中，步骤(2)中培养箱培养的培养条件可以包括：25℃，5％CO₂。常规弗朗西斯菌分离培养方法中，培养温度一般采用35℃-37℃，该温度为大部分弗朗西斯菌的适宜生长温度。但一般细菌在35℃-37℃的温度下生长较快，而目标微生物生长较一般细菌缓慢，杂菌的快速向外扩散生长容易覆盖目标微生物，不利于目标微生物的检出。经试验发现，采用25℃的培养温度既能有效减缓杂菌生长，也能确保目标微生物的生长，有利于提高目标微生物的分离效率。

在一些实施方式中，步骤(2)还可以包括：在培养的第3天、第5天、第7天分别对培养基进行观察，挑选慢生长、表面及边缘光滑、湿润、扁平、圆形、灰白色、半透明的菌落进行初次分离与纯培养；步骤(3)是取初次分离与纯培养得到的微生物进行处理。

在一些实施方式中，步骤(1)还可以包括：根据样品菌量浓度，加入无菌生理盐水对酸处理后的样品进行稀释；步骤(2)是取稀释后的样品涂布于培养基。

在一些实施方式中，海水环境样品可以为取自近海浅海植物和海水生物较为丰富的区域的海水样品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过结合弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的生长特性、耐药性以及模拟海水环境多盐离子环境开发培养基，提供了一种既可以有效抑制海水环境样品中其他杂菌的生长，降低分离难度，又有利于弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的生长的可用于富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的培养基；

(2)进一步地，本发明通过对样品进行浓缩富集、进行酸处理去除杂菌以提高目标菌占比、采用本发明提供的培养基对样品中的微生物进行分离与纯培养以及对培养条件进行优化等方法及策略以减缓杂菌生长以及促进目标微生物的生长，可以有效完成弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的富集与分离，使弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种出现个体数量的增加，同时物种多样性增加，从而显著提高目标微生物被分离的概率，对海水环境目标微生物的鉴定和研究具有重要价值和意义。

附图说明

图1为采用本发明实施例4从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法结合实施例3制得的培养基对海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集与分离得到的分离效果图；

图2-3依次为培养温度为35℃、25℃时，采用不同的培养基以及不同的富集分离方法对海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集分离得到的分离效果图；

图4为采用CHAB-2216E-GVPC对海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集分离得到的分离效果图；

图5为采用BCYEα-2216E-Blood-GVPC对海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集分离得到的分离效果图；

图6-8依次为采用2216E-GVPC、CHAB-GVPC、CHAB-2216E-GVPC对海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集分离得到的分离效果图；其中，图中箭头指示的半透明小菌落即为目标微生物菌落；

图9为本发明分离的目标菌群潜在新种及相关菌株的16S rRNA基因发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，实施例中所用原料和试剂为可以通过市售获得的常规产品，如，浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞购于广州翔博生物科技有限公司，货号RSYX-100；实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照试剂、试剂盒及仪器制造商所建议的条件。

本发明中，抗生素GVPC由英国OXOID公司的四种抗生素配制而成，GVPC中，四种抗生素的具体种类和终浓度为：甘氨酸(glycine)3.0g/L，万古霉素(vancomycin)0.001g/L，多粘菌素B(polymyxin B)80000U/L和放线菌酮(cyclohexamide)0.08g/L。目标菌群对GVPC呈现耐药结果，添加GVPC能有效抑制部分杂菌生长，从而利于目标菌群生长。

实施例1微生物固体平板培养基

1L培养基的组分包括：marine broth 2216 35g，脑心浸液琼脂23.5g，琼脂6g，FeCl₃ 0.4g，L-半胱氨酸0.3g，GVPC 15mL，葡萄糖8g，浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞25mL，余量为水。

制备方法：

(1)取marine broth 2216，加入350mL蒸馏水，45℃-50℃水浴充分溶解，并过滤除杂质，得A液；

(2)取脑心浸液琼脂和琼脂，加入550mL蒸馏水，搅拌溶解，得B液；

(3)将A液和B液混合，调节pH至7.0(±0.2)后，进行121℃高压灭菌15min，高压灭菌结束后冷却液体至60℃-65℃备用；

(4)取FeCl₃、L-半胱氨酸和葡萄糖，分别用20mL、20mL、20mL灭菌蒸馏水进行溶解，并用0.22μm滤膜过滤除菌，然后加入GVPC和热灭活的绵羊红细胞，混合，得C液；

(5)将步骤(3)中高压灭菌后冷却至60℃-65℃的A液和B液的混合液与C液混合均匀，然后倒平板，即得。

实施例2微生物固体平板培养基

1L培养基的组分包括：marine broth 2216 40g，脑心浸液琼脂30g，琼脂4g，FeCl₃0.3g，L-半胱氨酸0.5g，GVPC 25mL，葡萄糖10g，浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞45mL，余量为水。

制备方法：

(1)取marine broth 2216，加入400mL蒸馏水，45℃-50℃水浴充分溶解，并过滤除杂质，得A液；

(2)取脑心浸液琼脂和琼脂，加入470mL蒸馏水，搅拌溶解，得B液；

(3)将A液和B液混合，调节pH至7.0(±0.2)后，进行121℃高压灭菌15min，高压灭菌结束后冷却液体至60℃-65℃备用；

(4)取FeCl₃、L-半胱氨酸和葡萄糖，分别用20mL、20mL、20mL灭菌蒸馏水进行溶解，并用0.22μm滤膜过滤除菌，然后加入GVPC和热灭活的绵羊红细胞，混合，得C液；

(5)将步骤(3)中高压灭菌后冷却至60℃-65℃的A液和B液的混合液与C液混合均匀，然后倒平板，即得。

实施例3微生物固体平板培养基

1L培养基的组分包括：marine broth 2216 37.4g，脑心浸液琼脂25g，琼脂5g，FeCl₃ 0.325g，L-半胱氨酸0.4g，GVPC 20mL，葡萄糖10g，浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞40mL，余量为水。

制备方法：

(1)取marine broth 2216，加入450mL蒸馏水，45℃-50℃水浴充分溶解，并过滤除杂质，得A液；

(2)取脑心浸液琼脂和琼脂，加入450mL蒸馏水，搅拌溶解，得B液；

(3)取FeCl₃、L-半胱氨酸和葡萄糖，分别用10mL、10mL、20mL灭菌蒸馏水进行溶解，并用0.22μm滤膜过滤除菌，然后加入GVPC和热灭活的绵羊红细胞，混合，得C液；

(4)将A液和B液混合，调节pH至7.0(±0.2)后，进行121℃高压灭菌15min，高压灭菌结束后冷却液体至60℃-65℃；与C液混合均匀，然后倒平板，即得。

实施例4从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法

具体步骤如下：

(1)酸处理液的配制：称取1.49g KCl溶解于100mL无菌注射用水中，得浓度为14.9g/L的KCl溶液，备用；称取0.167g HCl溶解于10mL蒸馏水中，用KOH调节pPH至2.2(±0.2)，得浓度为16.7g/L的HCl溶液，备用；量取KCl溶液90mL、HCl溶液5mL，充分混匀，制备成KCl:HCl比例为18:1、pH为2.2(±0.2)的酸处理液，在121℃下灭菌15min，备用；

(2)将海水环境样品均质处理后，取100mL液体，通过0.22μm纤维素滤膜针管过滤器进行浓缩，用1mL无菌生理盐水将步骤(2)的纤维素滤膜上的物质充分洗脱，收集洗脱液，得到富集后的样品；

(3)往富集后的样品中加入等体积的酸处理液，震荡摇匀后静置5min，然后根据样品菌量浓度，加入不同体积无菌生理盐水对样品进行稀释，得预处理过的样品，备用；由于目标菌耐酸，因此，可得含较少杂菌的样品，提高了目标菌的占比；

(4)取100μL预处理过的样品涂布于本发明提供的培养基，然后将培养基置于培养箱，在25℃，5％CO₂的条件下培养3-7天；

(5)在培养的第3天、第5天、第7天分别对培养基进行观察，挑选慢生长、表面及边缘光滑、湿润、扁平、圆形、灰白色、半透明的菌落进行初次分离与纯培养；

(6)对初次分离与纯培养得到的微生物进行镜下形态观察和生理生化试验，依据弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的镜下形态特征、生理生化反应特性进行筛选并挑取单个菌落进行分离与纯培养，然后将纯化后的微生物进行分类鉴定，获得最终分离的目标微生物的种类和数量。

本发明中，对海水环境样品进行浓缩，可以采用离心浓缩或过滤浓缩等现有对液体样品进行浓缩的方法中的任意一种。

本发明中，对微生物进行镜下形态观察获取其镜下形态特征的具体操作可以为：将少量弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的可疑菌落均匀涂在含有生理盐水的载玻片上，待玻片自然晾干，然后用酒精灯的外焰固定，最后放在革兰染色仪上进行染色，观察其染色结果及油镜下形态并记录。弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的目标菌革兰染色阴性，镜下形态多为小球杆菌、不定型、细砂状等。

本发明中，对微生物进行生理生化试验，具体可以包括触酶试验以及氧化酶试验。弗朗西斯菌属为严格需氧性细菌，属内仅西班牙弗朗西斯菌(F.hispaniensis)触酶阴性，其余均为弱阳性。Kovacs改良法氧化酶试验时，土拉弗朗西斯菌、蜃楼弗朗西斯菌和西班牙弗朗西斯菌呈现阳性，船城弗朗西斯菌(F.noatunensis)氧化酶阴性。

本发明中，将纯化后的微生物进行分类鉴定，具体可以是提取微生物DNA后，使用16S rRNA通用引物进行扩增和测序。

采用实施例3制得的培养基结合本实施例的方法对惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本进行弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种分离培养，在培养的第3天挑取目标菌的疑似菌进行初次分离与纯培养，分离效果如图1所示，图中半透明小菌落即为目标微生物菌落，经鉴定，分离出的微生物主要为海岸嗜半胱氨酸菌(99.4-99.7％)。

试验例1

以在广东近海浅海地区水域内，惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本作为海水环境样品，对分别以BCYEα和CHAB作为基础培养基，并在基础培养基中添加抗生素GVPC、marine broth 2216和在分离培养过程中对样品进行酸处理的作用以及培养温度(25℃和35℃)进行研究。富集分离方法参考实施例4，将样品涂布于培养基上培养3天后的结果如图2和图3所示。

图2、图3中：

标记为2216E-GVPC对应的培养基显示的结果是采用以marine broth 2216作为基础培养基，每1L培养基，添加20mL抗生素GVPC制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为2216E-GVPC酸对应的培养基显示的结果是采用以marine broth 2216作为基础培养基，每1L培养基，添加20mL抗生素GVPC制得的培养基作为富集分离培养基，且在富集分离过程中对样品进行酸处理得到的分离结果；其中，酸处理步骤具体为加入与浓缩后的样品等体积的由14.9g/L的KCl溶液和浓度为16.7g/L的HCl溶液按体积比18：1配制而成的、pH为2.0-2.4的酸处理液，静置3-10min；

标记为BCYEα对应的培养基显示的结果是采用BCYEα作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为BCYEα-2216E对应的培养基显示的结果是采用以BCYEα作为基础培养基，每1L培养基，添加37.4g marine broth 2216制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为BCYEα-2216E-GVPC对应的培养基显示的结果是采用以BCYEα作为基础培养基，每1L培养基，添加37.4g marine broth 2216和20mL抗生素GVPC制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为BCYEα-2216E-GVPC酸对应的培养基显示的结果是采用以BCYEα作为基础培养基，每1L培养基，添加37.4g marine broth 2216和20mL抗生素GVPC制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中对样品进行酸处理得到的分离结果；酸处理步骤同2216E-GVPC酸；

标记为CHAB对应的培养基显示的结果是采用CHAB作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为CHAB-2216E对应的培养基显示的结果是采用以CHAB作为基础培养基，每1L培养基，添加37.4g marine broth 2216制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为CHAB-2216E-GVPC对应的培养基显示的结果是采用以CHAB作为基础培养基，每1L培养基，添加37.4g marine broth 2216和20mL抗生素GVPC制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中不对样品进行酸处理得到的分离结果；

标记为CHAB-2216E-GVPC酸对应的培养基显示的结果是采用以CHAB作为基础培养基，每1L培养基，添加37.4g marine broth 2216和20mL抗生素GVPC制得的培养基作为富集分离培养基，且富集分离过程中对样品进行酸处理得到的分离结果；酸处理步骤同2216E-GVPC酸。

由图2和图3的结果可知：

(1)虽然添加抗生素GVPC可以在一定程度上减少杂菌，但杂菌仍几乎覆盖了整个平板，不利于目标微生物的检出，而在含有GVPC培养基的基础之上，对海水环境样品进行酸处理，杂菌数量大大减少，两者结合有利于目标微生物的检出；

(2)在基础培养基之上补充marine broth 2216后，平板上细菌数量大大增加，说明添加marine broth 2216可以为海水环境样品中的微生物的生长模拟良好的原生态环境，有利于促进目标微生物的生长；

(3)关于培养温度的选择，一般细菌在35℃的较高温度下生长较快，而目标微生物生长较一般细菌缓慢，杂菌的快速向外扩散生长容易覆盖目标微生物，不利于目标微生物的检出，25℃的培养温度能有效减缓杂菌生长，也确保了目标微生物的生长。

试验例2

以在广东近海浅海地区水域内，茂名市电白区水东湾以及惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本作为海水环境样品，对基础培养基的选择对分离效果的影响进行了比较，结果如表1和图4-5所示，图中半透明小菌落即为目标微生物菌落。其中，试验所用的培养基为：实施例3制得的以CHAB作为基础培养基的培养基，记为CHAB-2216E-GVPC；以BCYEα作为基础培养基且在每1L培养基中，添加marine broth 2216 37.4g、GVPC 20mL和浓度为5％的热灭活的绵羊红细胞40mL制得的培养基，记为BCYEα-2216E-Blood-GVPC。从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法参考实施例4，图4为采用CHAB-2216E-GVPC培养4天后的结果，图5为采用BCYEα-2216E-Blood-GVPC培养4天后的结果。

表1茂名市电白区水东湾以及惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本分离得到的目标菌群潜在新种对应的分离培养基信息

由表1的结果可知，以CHAB作为基础培养基更有利于新物种检出，适合应用于调查水样目标物种多样性研究中。由图4-5的结果结合16S rRNA序列相似度分析结果可知，CHAB培养基上的优势菌是海岸嗜半胱氨酸菌(相似度98.2-98.9％)和蜃楼弗朗西斯菌(相似度99.1-99.8％)，而对应的BCYEα培养基上却几乎不见目标菌生长。综上，相同的改良条件下，以CHAB为基础培养基，其分离效果比BCYEα好。

试验例3

以在广东近海浅海地区水域内，惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本作为海水环境样品，以组分组成不同的培养基对弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集分离培养，从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法参考实施例4，培养3天后的结果如图6-8所示。试验所用的培养基为：以marine broth 2216培养基作为基础培养基，每1L培养基中，添加20mL抗生素GVPC制得的培养基，记为2216E-GVPC；以CHAB作为基础培养基，每1L培养基中，添加20mL抗生素GVPC制得的培养基，记为CHAB-GVPC；实施例3制得的培养基，记为CHAB-2216E-GVPC。

2216E-GVPC培养基上生长的微生物，均与目标微生物的生长特性不符，选取2216E-GVPC上的部分菌落进行鉴定，均非目标微生物，故猜测目标微生物在该平板上基本不生长；原因可能是marine broth 2216培养基营养成分较少，不满足弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种等苛养性细菌的生长。

由图6-8的结果可知，本发明提供的培养基分离出的微生物，特别是目标微生物的数量明显比2216E-GVPC和CHAB-GVPC多，其中，CHAB-2216E-GVPC分离出的微生物主要为海岸嗜半胱氨酸菌(相似度99.4-99.8％)。

试验例4

以在广东近海浅海地区水域内，茂名市电白区水东湾以及惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本作为海水环境样品，采用实施例4从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种的方法对海水环境样品中的弗朗西斯菌和/或其邻近类群物种进行富集与分离，其中，采用的培养基为实施例3制得的培养基，并依据弗朗西斯菌的菌落特征，初步将可疑菌株进行分离与纯培养，并对纯培养后的可疑菌株进行传统形态特征、生理生化特征、16S rRNA分子特征等鉴定。

结果：19份水东湾水样中有14份(阳性率为73.7％)成功分离到共60株目标菌(含邻近类群物种)，29份惠州地区水样中有17份(阳性率为58.6％)成功分离到共79株目标菌(含邻近类群物种)，经菌落特征、细菌形态学检查、生化反应以及测序结果比对后，水东地区分离出弗朗西斯菌属(含潜在新种)12株(20.0％)，潜在新科2株(3.3％)，惠州地区分离出弗朗西斯菌属(含潜在新种)22株(27.8％)，潜在新科18株(22.8％)，详见表2和图9。

表2茂名市电白区水东湾以及惠州市两大湾(巽寮湾、双月湾)采集的样本分离得到的目标微生物测序结果

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.富集分离弗朗西斯菌和其邻近类群物种的培养基，所述弗朗西斯菌和其邻近类群物种为弗朗西斯菌属（Francisella）、嗜半胱氨酸菌属(Cysteiniphilum)和香港方氏菌(Fangia hongkongensis)，其特征在于，所述培养基的pH为6.8-7.2，每1L培养基中，包括以下组分：marine broth 2216 35-40 g，脑心浸液琼脂23.5-27.5 g，琼脂4-6 g，FeCl₃0.30-0.35 g，L-半胱氨酸0.35-0.45g，GVPC 18-22 mL，葡萄糖9-11 g和浓度为5%的热灭活的绵羊红细胞35-45 mL。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，每1L培养基中，包括以下组分：marinebroth 2216 37.4 g，脑心浸液琼脂25 g，琼脂5 g，FeCl₃ 0.325 g，L-半胱氨酸0.4 g，GVPC20 mL，葡萄糖10 g和浓度为5%的热灭活的绵羊红细胞40 mL。

3.权利要求1或2所述的培养基的制备方法，包括如下步骤：

取marine broth 2216，加水后加热溶解，去除杂质，得A液；

取脑心浸液琼脂和琼脂，加水溶解，得B液；

取FeCl₃、L-半胱氨酸和葡萄糖，加水溶解后，除菌，然后加入GVPC和热灭活的绵羊红细胞，混合，得C液；

将A液和B液混合，调节pH，灭菌，然后与C液混合，倒平板，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述A液、B液和C液的体积比为3-6:3-6:1。

5.从海水环境样品中富集分离弗朗西斯菌和其邻近类群物种的方法，所述弗朗西斯菌和其邻近类群物种为弗朗西斯菌属（Francisella）、嗜半胱氨酸菌属(Cysteiniphilum)和香港方氏菌(Fangia hongkongensis)，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将海水环境样品浓缩后，加入0.5-1.5倍体积、pH为2.0-2.4的酸处理液，混合后静置3-10 min，得预处理过的样品；所述酸处理液为含有KCl和HCl的溶液；

（2）取预处理过的样品涂布于权利要求1或2所述的培养基，然后将培养基置于培养箱，培养3-7天；

（3）对培养得到的微生物进行镜下形态观察和生理生化试验，依据弗朗西斯菌和其邻近类群物种的镜下形态特征和生理生化反应特性进行筛选并挑取单个菌落进行分离与纯培养，然后将纯化后的微生物进行分类鉴定，获得最终分离的目标微生物的种类和数量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酸处理液为由浓度为14.9g/L的KCl溶液和浓度为16.7g/L的HCl溶液按体积比18：1配制而成的溶液。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述培养箱培养的培养条件包括：20℃-30℃，5%CO₂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述培养箱培养的培养条件包括：25℃，5%CO₂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）还包括：在培养的第3天、第5天、第7天分别对培养基进行观察，挑选慢生长、表面及边缘光滑、湿润、扁平、圆形、灰白色、半透明的菌落进行初次分离与纯培养；所述步骤（3）是取初次分离与纯培养得到的微生物进行处理。

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