CN101372713B - 一种应用多重pcr技术检测土拉弗朗西斯菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法，属于生物战剂检测技术领域。本发明以土拉弗朗西斯菌的内毒素相关基因lpxF，lpxE和flmK为特异性靶点，通过NCBI微生物基因组全序列Blastp比对，确立上述三个基因的特异性，设计相关引物，采用多重PCR进行检测；电泳检测出现三条条带，依次为447bp，717bp，1004bp，依据三条特异性条带的出现判为阳性，否则判为阴性。本发明检测方法操作简便，容易推广应用；检验周期短，相对于传统检验方法得到结果所需要的5～7d，本方法的检验周期为3h，远快于传统方法，可以极大提高检验效率；灵敏度高，特异性好；检测限达到了0.01ng/μL和5×10⁵cfu/mL，达到并超过传统的检测方法，同时检出率更高。

Description

一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法

技术领域

本发明涉及一种检测土拉弗朗西斯菌的方法，特别是涉及一种通过多重PCR来快速检测土拉弗朗西斯菌的方法。属于生物战剂检测技术领域。 

背景技术

微生物个体微小，与人类生活密切相关。微生物在自然界中“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。由微生物引起的传染病发病快、死亡率高、传播迅速、传播范围广，不仅严重危害着人民健康而且极易引起大众的心理恐慌，因此，微生物常常被恐怖分子选择用于制造生物恐怖事件的首选目标。随着现代生物技术的飞速发展，对某些烈性病原生物进行遗传改造，使其毒力增强或在其强致病性的基础上增加各种耐药基因，使之更加难于救治已愈来愈引起各国的重视。 

据《医学假说》杂志报道，加拿大一项最新研究表明，早在3300年前，人类就曾经在战争中使用过“生化武器”，这种“生化武器”就是土拉弗朗西斯菌。土拉弗朗西斯菌通过诸如驴等啮齿类动物，感染了人类和动物，并导致他们发烧、残疾和死亡。“生化武器”的使用，使瘟疫持续了35-40年。 

生化武器包括天花、炭疽、土拉弗朗西斯菌和鼠疫等致病菌。其中，土拉弗朗西斯菌是重要的生物战剂，已被列入国际禁止生物武器公约致病微生物核查清单。 

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)能在人和其它许多温血动物中引起土拉菌病(Tularaemia，或称野兔热、鹿蝇热)，易感动物为啮齿类动物，人通过破损的皮肤、结膜感染，吸入或食入极少量(10～50个)土拉菌便可发病，临床表现为皮肤溃烂、淋巴腺肿大、肺部感染和伤寒样症状，病情严重甚至死亡。 

2001年6月美国微生物学报刊登了一篇“平民生物危害防范工作组”关于土拉菌作为生物武器进行恐怖袭击危险性评估报告，这个工作组由来自美国医学科研机队、政府有关部门的25名专家组成，通过检索1966年1月至2000年10月间的相关文献，最后得出结论，土拉菌具有用作生物武器进行恐怖袭击的潜在危险，其特点如下：(1)通过简易发酵即可大量得到；(2)易于传播，如通过空气和水传播，土拉菌具有较强的抵抗力，在水、土壤、尸体和 兽皮中可存活几周，在0℃耐受几个月，在冷冻的兔肉中存活几年，患者及病畜皮肤、腺体溃疡病灶分泌物、血、痰标本，或死亡动物肝、脾标本中，均含有大量土拉菌；(3)人和动物易感(少于10个菌即可感染)；(4)可引起致死性疾病。 

土拉菌是苛养菌，人工营养条件要求较高，尤其是初次分离培养比较困难，生长缓慢。因此，研究快速检出土拉菌的方法对于确定污染源和污染范围，及时诊断土拉菌感染，防止环境扩散和患者及时治疗十分重要，也是在突发事件中将生物危害减至最小程度的重要保证。 

土拉弗朗西斯菌常用的检测方法多为传统的生理生化试验，血清抗体检测，酶联免疫吸附试验(ELISA)和普通的PCR等，但检测时间长，灵敏度低，很显然，面对突然的生物袭击，上述方法均不能满足快速检测的需求。因此，研制开发灵敏度高，检测时间短的土拉弗朗西斯菌的检测方法显得尤为重要。 

多重PCR(multiplex PCR，MPCR)技术，是一种在一个反应体系中加入多对引物同时检测多个目的片段的技术，可以为单一模板也可以是几种不同的模板，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR在食源性致病菌的检验上已得到较好应用，可以同时检测一种致病菌的多个基因，也可以同时检测多种致病菌. 

多重PCR，只需一次反应和一次电泳即可同时检测出多个目的片段，节约昂贵试剂、PCR反应时间和电泳时间等，又由于各对引物扩增时存在竞争，可有效避免假阳性的出现而提高检测准确率。多重PCR方法与单一PCR相比，显得更加稳定、准确、高效、经济。 

综上所述，鉴于土拉弗朗西斯菌有作为生物恐怖武器进行生物恐怖袭击的潜在危害，开发一种能快速检测的方法显得尤为重要，本发明即通过多重PCR来检测土拉弗朗西斯菌，由此建立一种新的快速检测土拉弗朗西斯菌的方法。 

本发明所采用的土拉弗朗西斯菌株Francisella tularensis subsp.novicidaU112为实验室安全菌株，所有的实验均在生物安全二级实验室完成。 

发明内容

发明目的在于：克服当前检测方法的不足，提供一种检测速度快，灵敏度高，检测结果准确度高，重现性好的运用多重PCR技术快速检测土拉弗朗西斯菌的方法，以适应卫生和公安应急检测，适应疾控中心，商检，卫生，海关，公安，技术监督，科研的基层分析单位检测的需求。 

本发明的技术方案：一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法： 

(1)检测靶基因的选择及引物设计 

本发明以土拉弗朗西斯菌的内毒素相关基因lpxF(Gene ID：2827873)， lpxE(Gene ID：4547731)和flmK(Gene ID：4547523)为特异性靶点，通过NCBI微生  物  基  因  组  全  序  列  Blastp  比  对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)，确立上述三个基因的特异性，设计相关引物，其中lpxE从基因两端设计引物，lpxF和flmK均从基因内部保守区域设计引物，采用多重PCR进行检测；电泳检测出现三条条带，依次为447bp，717bp，1004bp。 

引物序列如下： 

lpxF(+):TTGGCAAGATTTCATATCATATTAGG， 

lpxF(-):CATCACCACATACAAAGGAGCAG， 

lpxE(+):ATGCTCAAACAGACATTACAAACAAA， 

lpxE(-):AATAATCTCTCTATTTCTCATCCAATA， 

flmK(+):ATGAATAAATCTAAAAACTCTTACTATTT， 

flmK(-):AGTGATAATGGCGCAAATATAGGC； 

(2)样品制备：以土拉弗朗西斯菌基因组DNA或土拉弗朗西斯菌为样品： 

基因组DNA样品的提取：取土拉弗朗西斯菌过夜培养液3mL，利用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒抽提基因组DNA，用核酸定量检测仪测定，控制基因组DNA浓度为100μg/μL； 

将所提取的DNA模板，分别以超纯水梯度稀释，反应体系中最终模板浓度为5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL； 

或菌液样品的制备：取土拉弗朗西斯菌单菌落接种于10mL TSB-C液体培养基，于37℃、200rpm/min摇床上培养至OD₆₀₀值为1，通过菌落平板计数，控制为2.0×10⁹cfu/mL； 

取OD₆₀₀＝1的菌液，进行梯度稀释，反应体系中菌体终浓度为1×10⁸cfu/mL，5×10⁷cfu/mL，1×10⁷cfu/mL，5×10⁶cfu/mL，1×10⁶cfu/mL，5×10⁵cfu/mL或1×10⁵cfu/mL； 

(3)反应条件的确立 

确定dNTP加量为2μL，Tm℃为55℃，三对引物比例lpxF:lpxE:flmK＝1:1:3； 

反应体系为20μL：10×PCR Buffer：2μL，dNTP：2μL，基因组DNA模板1μL或菌液样品1μL，Taq酶：0.1μL，引物：lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，lpxF(-)0.5μL，flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL，ddH₂O补足20μL； 

多重PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为：变性94℃、5min；变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、1min，循环30次；延伸72℃、10min；

(4)检测结果 

1％琼脂糖凝胶电泳分析，于紫外光灯下观察结果，以447bp，717bp，1004bp三条特异性条带的出现判为阳性，否则判为阴性。 

反应条件优化：将dNTP加量从1μL～3μL，以0.5μL为梯度递增，试剂盒抽提的土拉弗朗西斯菌DNA模板PCR验证，确定当dNTP加量为2μL时特异性较好。再将Tm℃从48.2℃～55℃取6个温度梯度，即48.2℃、49.2℃、51.0℃、53.2℃、54.5℃、55℃，以土拉弗朗西斯菌DNA为模板PCR验证，确定当Tm℃为55℃时特异性较好。最后将三对引物比例设为1:1:1；1:1:2；1:1:3；1:1:4四个比例做PCR验证，确定当引物比例为1:1:3时引物条带亮度最均匀，故确定引物比例lpxF:lpxE:flmK＝1:1:3。(见附图1) 

灵敏度检测 

(1)模板的制备 

以基因组DNA为模板：将所提取的DNA模板，分别以超纯水梯度稀释，反应体系中最终模板浓度为5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL。 

或以菌体为模板：取OD₆₀₀＝1的菌液，进行梯度稀释。反应体系中菌体终浓度为1×10⁸cfu/mL，5×10⁷cfu/mL，1×10⁷cfu/mL，5×10⁶cfu/mL，1×10⁶cfu/mL，5×10⁵cfu/mL或1×10⁵cfu/mL。 

PCR反应条件同上述。 

检测结果及说明 

以1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板多重PCR产物，结果见附图2。 

以1％琼脂糖凝胶电泳检测菌体模板多重PCR产物，结果见附图3。 

由电泳图可知，用DNA模板做多重PCR时最低检出限约为0.01ng/μL。用菌体做多重PCR时最低检出限约为5×105cfu/mL。 

特异性检测 

模板的制备 

实验中用于特异性检测菌株见下表，其中FOO1用于反应条件优化及相关灵敏度的实验。

表1多重PCR中用于特异性检测的菌株 

  

菌株名称	菌株编号	菌株来源	PCR反应特异性结果
				Escherichia coli	E001	本实验室保藏	—
Enterobacter Sakarakii	ES001	本实验室保藏	—
				Salmonella typhimurium	S001	本实验室保藏	—
Bacillus subtilis	BS001	本实验室保藏	—
				Francisella tularensis.novicidaU112	F001	本实验室保藏	+(447bp，717bp，1004bp)
Francisella tularensis.novicidaU112lpxE::Ωkan	F004	本实验室保藏	+(447bp，1004bp)
				Francisella tularensis.novicidaU112arnT::Ωkan	F005	本实验室保藏	+(447bp，717bp)
Francisella tularensis.novicidaU112lpxF::Ωkan	F006	本实验室保藏	+(717bp，1004bp)

注，“-”表示多重PCR反应阴性结果，电泳图中未见任何条带；“+”表示多重PCR反应阳性结果，电泳图中有目的条带出现。 

菌悬液的制备：土拉弗朗西斯菌F001、F004、F005、F006各取一单菌落接于10mL TSB液体培养基，E001，S001，ES001，BS001各取一单菌落接于10mLLB液体培养基，于37℃、200rpm/min摇床上培养至OD₆₀₀值为1。 

PCR反应条件同上述。 

检测结果及说明 

以1％琼脂糖凝胶电泳分析，于紫外光灯下观察结果，结果见附图4。 

本发明的有益效果：与传统的土拉弗朗西斯菌检测方法相比较，本发明中所建立的多重PCR方法具有以下优点： 

(1)操作简便，容易推广应用。本多重PCR检测方法对于仪器设备的要求较普通，不需要特别昂贵的仪器和试剂，因而利于基层部门推广应用，且操作方法简单方便。 

(2)检验周期短。相对于传统检验方法得到结果所需要的5～7d，本多重PCR方法的检验周期为3h，远快于传统方法，可以极大提高检验效率。 

(3)灵敏度高，特异性好。多重PCR相对于普通PCR具有更高的准确度，故特异性更好，同时亦保留了普通PCR灵敏度高的优点。本研究中所建立的多重PCR检测方法的检测限达到了0.01ng/μL和5×10⁵cfu/mL，达到并超过传统的检测方法，同时检出率更高。

附图说明

图1：反应条件优化 

1道为100bp DNA Marker，2道lpxF(+)(-)PCR结果，3道lpxE(+)(-)PCR结果，4道flmK(+)(-)PCR结果，5-8道三对引物比例分别为1:1:1，1:1:2，1:1:3，1:1:4。 

图2：灵敏度检测(DNA为模板) 

1道为1kb DNA Marker，2-8道中DNA模板浓度分别为5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL，0.005ng/μL。 

图3：灵敏度检测(菌体为模板) 

1道为1kb DNA Marker，2-8道中菌液浓度分别为1×10⁸cfu/mL，5×10⁷cfu/mL，1×10⁷cfu/mL，5×10⁶cfu/mL，1×10⁶cfu/mL，5×10⁵cfu/mL，1×10⁵cfu/mL。 

图4：特异性检测 

1道为1kb DNA Marker，2道为F001菌体模板，3道为F004菌体模板，4道为F005菌体模板，5道为F006菌体模板，6道为E001菌体模板，7道为ES001菌体模板，8道为S001菌体模板，9道为BS001菌体模板。 

图5：环境样品检测 

1道为1kb DNA Marker，2道为加入污染菌的土壤样本，3道为未污染的土壤样本，4道为加入污染菌的水样本，5道为未污染的水样本，6道为加入污染菌的空气样本，7道为未污染的空气样本。 

具体实施方式

实施例1：土壤中的土拉弗朗西斯菌的PCR检测 

1、样品前处理 

采集两份土样(1g/份)，加入30mL TSB培养基，其中一份接种土拉弗朗西斯菌F001单菌落，37℃200rpm/min培养6h进行前增菌。增菌后静置，土样沉淀后，取1μL菌悬液作为菌体模板进行多重PCR检测。 

2、PCR反应 

PCR反应体系 

反应体系(20μL)： 

10×PCR Buffer：2μL， 

d NTP：2μL， 

模板：1μL， 

Taq酶：0.1μL， 

引物：lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL， 

     lpxF(+)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，

flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL， 

ddH₂O：补足20μL。 

PCR反应过程 

多重PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为： 

①变性:94℃    5min 

②变性:94℃    30s 

③退火:55℃    30s 

④延伸:72℃    1min 

⑤延伸:72℃    10min 

②至④步循环   30cycle 

3、检测结果及说明 

以1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，加入菌的土样中扩增出相应特异条带(见附图5第2道)，而未人工加菌的样品中未出现相应条带(见附图5第3道)。 

实施例2：水中的土拉弗朗西斯菌的PCR检测 

1、样品前处理 

采集两份水样(5mL/份)，加入30mL TSB培养基，其中一份接种土拉弗朗西斯菌F001单菌落，37℃200rpm/min培养6h进行前增菌。增菌后取1μL菌悬液作为菌体模板进行多重PCR检测。 

2、PCR反应：反应条件及体系同实施例1。 

3、检测结果及说明 

以1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果见附图5。 

结果显示，加入菌的水样中扩增出相应特异条带(见附图5第4道)，而未人工加菌的样品中未出现相应条带(见附图5第5道)。 

实施例3：空气中的土拉弗朗西斯菌的PCR检测 

1、样品前处理 

用吸尘器采集两份空气中的灰尘样品(1g/份)，加入30mLTSB培养基，其中一份接种土拉弗朗西斯菌F001单菌落，37℃，200rpm/min培养6h进行前增菌。增菌后取1μl菌悬液作为模板进行多重PCR检测。 

2、PCR反应：反应条件和反应体系同实施例1。 

3、检测结果及说明 

以1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，加入菌的样品中扩增出相应特异条带(见结果见附图5第6道)，而未人工加菌的样品中未出现相应条带(见附图5第7道)。

Claims (1)

1.一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法，其特征是本方法应用于土壤、水或空气中的检测：

(1)检测靶基因的选择及引物设计

以土拉弗朗西斯菌的内毒素相关基因lpxF，lpxE和flmK为特异性靶点，通过NCBI微生物基因组全序列Blastp比对，确立上述三个基因的特异性，设计相关引物，其中lpxE从基因两端设计引物，lpxF和flmK均从基因内部保守区域设计引物，采用多重PCR进行检测；

引物序列如下：

lpxF(+)：TTGGCAAGATTTCATATCATATTAGG，

lpxF(-)：CATCACCACATACAAAGGAGCAG，

lpxE(+)：ATGCTCAAACAGACATTACAAACAAA，

lpxE(-)：AATAATCTCTCTATTTCTCATCCAATA，

flmK(+)：ATGAATAAATCTAAAAACTCTTACTATTT，

flmK(-)：AGTGATAATGGCGCAAATATAGGC，

(2)样品制备，以土拉弗朗西斯菌基因组DNA或土拉弗朗西斯菌为样品：

基因组DNA样品的提取：取土拉弗朗西斯菌过夜培养液3mL，利用TIANamp Bacteria DNAKit试剂盒抽提基因组DNA，用核酸定量检测仪测定，控制基因组DNA浓度为100μg/μL；

将所提取的DNA模板，分别以超纯水梯度稀释，反应体系中最终模板浓度为5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL；

或菌液样品的制备：取土拉弗朗西斯菌单菌落接种于10mL TSB-C液体培养基，于37℃、200rpm/min摇床上培养至OD₆₀₀值为1，通过菌落平板计数，控制为2.0×10⁹cfu/mL；

取OD₆₀₀＝1的菌液，进行梯度稀释，反应体系中菌体终浓度为1×10⁸cfu/mL，5×10⁷cfu/mL，1×10⁷cfu/mL，5×10⁶cfu/mL，1×10⁶cfu/mL，5×10⁵cfu/mL或1×10⁵cfu/mL；

(3)反应条件的确立

确定dNTP加量为2μL，Tm℃为55℃，三对引物比例lpxF∶lpxE∶flmK＝1∶1∶3；

反应体系为20μL：10×PCR Buffer：2μL，ddNTP：2μL，基因组DNA模板1μL或菌液样品1μL，Taq酶：0.1μL，引物：lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，lpxF(-)0.5μL，flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL，ddH₂O补足20μL；

多重PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为：变性94℃、5min；变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、1min，循环30次；延伸72℃、10min；

(4)检测结果

1％琼脂糖凝胶电泳分析，于紫外光灯下观察结果，以447bp，717bp，1004bp三条特异性条带的出现判为阳性，否则判为阴性。

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