CN114395511A

CN114395511A - 一株地衣芽孢杆菌fy1及其应用

Info

Publication number: CN114395511A
Application number: CN202210153160.4A
Authority: CN
Inventors: 郭伟娜; 路振香; 卫文娟; 王雨欣; 曾凡俊; 李文超; 贺绍君; 刘德义
Original assignee: Anhui University of Science and Technology
Current assignee: Anhui University of Science and Technology
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2042-02-18
Also published as: CN114395511B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一株地衣芽孢杆菌FY1及其应用，所述地衣芽孢杆菌FY1的菌株保藏编号为：CCTCC NO：M 2022016，保藏日期为2022年01月05日。本发明筛选得到的地衣芽孢杆菌FY1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常明显，同时对大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和节杆菌均有抑制作用。

Description

一株地衣芽孢杆菌FY1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株地衣芽孢杆菌FY1及其应用。

背景技术

目前，病原菌对各种抗菌药物的耐药性越来越强，甚至出现了超级细菌，耐药性致病菌株的增多及耐药谱的扩大对疾病的防治产生了巨大的阻碍。金黄色葡萄球菌是一种可感染动物和人类的重要病原菌，为球形呈葡萄串状排列的革兰阳性菌。该菌具有较强的抵抗力，在自然界中广泛分布，如空气、水、灰尘和动物排泄物中都可存在，因此，食品很容易受其污染，金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒在细菌性食物中毒所占比例较高。另外，还可引起人类化脓性感染，以及肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至发生败血症、脓毒血症等全身感染。当前，耐甲氧西林和其他抗生素的金黄色葡萄球菌广泛流行，万古霉素耐药菌株也有所增加，给临床治疗带来很大困难。安全高效的抗菌药替代品的研发与应用，既能够防控细菌性疾病为健康养殖提供良好技术基础，又能减少抗菌药物残留所带来的公共卫生安全问题。

针对细菌耐药性问题，目前解决方案有：(1)积极研发新型抗菌药物，简化、加速抗菌药物的审批程序。根据药物作用机制改进药物结构和治疗效果，新一代药物在一定时期内抑菌作用明显，效果显著，但随着时间的延长微生物也会对其产生耐药性。缺点：药物的研发在一定时间内有效，可抑制病原菌，但用药不合理不规范导致的耐药性还会出现。(2)研发中草药制剂，从中草药中提取具有低毒副作用、无抗药性、功能多样等特点的多糖等生物活性物质，发挥抗细菌、抗病毒、抗应激、提高机体免疫力、促进动物生长等作用。缺点：中草药种类太多，筛选范围太大，并且对病原菌的抑菌作用特异性针对性不强，主要是提高机体抗病力。(3)噬菌体的分离鉴定，某些耐药菌特异性的噬菌体分离纯化后可有效杀死相应病原菌，具有不产生耐药性、无残留、毒副作用校、制备相对容易、成本低等特点。缺点：不是所有的耐药性细菌都有特定的噬菌体，并且噬菌体的分离培养和应用技术还不够成熟。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供了一株地衣芽孢杆菌FY1及其应用，地衣芽孢杆菌FY1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常明显，同时对大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和节杆菌均有抑制作用。

本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)FY1，所述地衣芽孢杆菌FY1的保藏编号为：CCTCC NO：M 2022016，保藏日期为2022年01月05日。

本发明还提供了一种所述的地衣芽孢杆菌FY1制备得到的发酵上清液。

本发明还提供了一种所述的发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：将地衣芽孢杆菌FY1菌株接种至LB肉汤培养基中，于37℃，180rpm振荡培养24h，5000rpm离心15min，除去菌体，保留上清即为FY1菌株的发酵上清液。

本发明还提供了一种所述的地衣芽孢杆菌FY1制备得到的FY1菌株培养物。

本发明还提供了一种所述的FY1菌株培养物的制备方法，包括如下步骤：将地衣芽孢杆菌FY1菌株接种至LB肉汤培养基中，于37℃，180rpm振荡培养24h，即为FY1菌株的培养物。

本发明还提供了一种所述的地衣芽孢杆菌FY1产生的细菌素。

本发明还提供了一种所述的细菌素的制备方法，包括如下步骤：先制备发酵上清液，然后用浓盐酸将发酵上清液的pH值调至2.0，4℃过夜处理，再用10000rpmin离心15min，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，获得粗提细菌素。

本发明还提供了一种所述的发酵上清液、菌株培养物或细菌素在抑制病原菌中的应用。

进一步的，所述病原菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和节杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明中分离鉴定得到了一株地衣芽孢杆菌FY1菌株，发现其培养物、发酵上清液、粗提细菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常明显，特别是发酵上清液，抑制效果最好，抑菌圈直径可达36mm；同时对大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、节杆菌等其他致病菌抑菌效果相对较弱。

2、当前金黄色葡萄球菌的耐药性问题在医院和畜禽养殖业都比较严重，因此本发明对金黄色葡萄球菌致病性的防治将有很好的疗效，作为一种新发现的益生菌菌株，今后有很好的应用前景，如作为饲料添加剂调节动物肠道菌群，提高其抗病力，关键是无毒无害无残留，并且抑菌效果明显。另外，对于细菌素的提取还有改进的空间，在FY1菌株发酵上清液中抑菌效果最好。

生物材料保藏信息说明

FY1，在本申请中称作地衣芽孢杆菌FY1，已于2022年01月05日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022016，保藏单位地址是中国武汉武汉大学，邮编：430072，分类命名为地衣芽孢杆菌FY1(Bacillus Licheniformis FY1)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中地衣芽孢杆菌FY1普通营养琼脂培养特征；

图2为本发明中地衣芽孢杆菌FY1TSA琼脂培养特征；

图3为本发明中地衣芽孢杆菌FY1血琼脂培养特征；

图4为本发明中地衣芽孢杆菌FY1LB肉汤培养基培养特征；

图5为本发明中地衣芽孢杆菌FY1革兰染色镜检结果；

图6为本发明中地衣芽孢杆菌FY1的生化试验结果，其中，从左至右分别表示吲哚形成试验、甲基红试验、二乙酰试验、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖；

图7为本发明中地衣芽孢杆菌FY1和9株地衣芽孢杆菌参考菌株16S rRNA基因序列的同源性分析结果；图中seq1表示本发明中的FY1菌株序列，参考菌株均用Genbank登录号表示。

图8为本发明中基于地衣芽孢杆菌16S rRNA基因序列构建的遗传进化树；图中seq1表示本发明中的FY1菌株序列，其它菌株均用Genbank登录号表示。

图9为本发明中地衣芽孢杆菌FY1对金黄色葡萄球菌的抑菌结果；平板中的标记分别表示：1，细菌素；2，FY1菌株培养物；3，发酵上清液。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明是从实验室中一块培养金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基上偶然发现的一种细菌，表现为边缘不整齐、表面干燥、轻度隆起、中等大小的灰白色圆形菌落，该菌落周围无金黄色葡萄球菌的生长。我们对该待检菌进行了分离培养和纯化，以及染色镜检、生化试验、PCR鉴定、抑菌试验等。

一、菌株的分离鉴定

1、分离培养和纯化

将待检菌接种到普通营养琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、血琼脂等培养基上均能生长，菌落特征为灰白色、中等大小、边缘不整齐、表面干燥、轻度隆起、不透明，结果分别见图1-3。LB肉汤培养基培养后的生长表现为底部有絮状沉淀，菌液变浑浊，见图4。

LB肉汤培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，1000mL蒸馏水。

2、涂片染色镜检

挑取纯化后的单个菌落进行涂片，革兰染色，显微镜油镜观察，发现该菌体为单个或成链存在、长杆状的蓝紫色革兰阳性菌，结果见图5。

3、生化试验

分别进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖发酵试验、甲基红试验、二乙酰试验和吲哚形成试验：采用接种环或接种针将待检菌分别接种至蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水，以及糖发酵管(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖)中，37℃培养24-48h。结果表明其对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖均能分解，但不分解乳糖，其中对葡萄糖和蔗糖既产酸又产气，由紫色变为黄色，并有气泡产生，麦芽糖只产酸，由紫色变为黄色；甲基红试验和吲哚形成试验均为阴性，无颜色变化，仍为淡黄色，二乙酰试验为阳性，培养液由黄色变为红色。具体见图6。

4、分子鉴定

采用细菌16S rRNA基因的通用引物27F和1525R进行PCR扩增；

(1)核酸提取：用接种环挑取该菌的单个菌落接种于LB肉汤培养基，37℃，180rpm振荡培养24h。之后采用煮沸法提取核酸：取出菌液1mL至1.5mL离心管中，5000rpm离心5min，弃去上清，用无菌水200μL溶解菌体沉淀，100℃煮沸10min，冰浴5min，最后12000rpm离心5min，离心后取上清液即为DNA模板。

(2)16S rRNA的PCR扩增及测序分析：PCR反应体系为50μL：PCR Master Mix25μL，上引物2μL，下引物2μL，DNA模板5μL，无菌水16μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至安徽通用生物有限公司进行测序，测序结果在NCBI网站上核酸数据库中进行比对分析，发现其与地衣芽孢杆菌ML103A菌株的16S rRNA基因(GenBank登录号：KC692195)相似性为99.73％，证实待测菌为地衣芽孢杆菌。将待测菌16S rRNA基因测序结果(seq1)与GenBank中9株地衣芽孢杆菌参考菌株的16S rRNA基因序列(见表1)，用DNAStar软件中的Megalign程序进行同源性分析，发现其同源性介于97.0％-99.5％之间(见图7)，基于16S rRNA基因序列构建的遗传进化树见图8。由图8可知，本发明中待测菌与分离自意大利枸杞蜜中的地衣芽孢杆菌ML103A菌株位于同一个分支，同源性最高(如表1所示)。

表1地衣芽孢杆菌参考菌株详细信息

二、抑菌试验

1、FY1菌株培养物的制备

将地衣芽孢杆菌FY1菌株接种至含有5mL LB肉汤培养基的试管中，37℃，180rpm振荡培养24h，即为FY1菌株的培养物。

2、发酵上清液的制备

将地衣芽孢杆菌FY1菌株接种至含有100mL LB肉汤培养基的250mL锥形瓶中，37℃，180rpm振荡培养24h，5000rpm离心15min，除去菌体，保留上清即为FY1菌株的发酵上清液。

3、采用酸沉淀法粗提细菌素

用浓盐酸将上述发酵上清液的pH值慢慢调至2.0，4℃冰箱过夜处理，再用10000rpmin离心15min，弃去上清，沉淀用2mL磷酸盐缓冲液(pH为7.0)溶解，即为粗提细菌素，-20℃保存备用。

4、药敏纸片法测定抑菌效果

a.制备药敏片：用打孔器将滤纸制成直径为6mm的圆纸片，放入试管中121℃灭菌，烘干备用。将灭菌后的圆纸片分别浸泡至含有1mL FY1菌株培养物、细菌素、发酵上清液的2mL冻存管中，每管浸泡10片圆纸片，浸泡40min后取出，于37℃恒温培养箱中烘干12-24h后备用。

b.致病菌的培养：将金黄色葡萄球菌分别接种到5mL的LB肉汤培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h。

c.抑菌试验：取出50μL金黄色葡萄球菌菌液分别滴加至普通营养琼脂平板上，用灭菌后的涂布棒将菌液均匀涂布，待稍微晾干后，分别将浸泡过FY1菌株培养物、细菌素、发酵上清液的圆纸片放至琼脂平板上，并做好标记。于37℃培养24h后测定抑菌圈。结果表明，FY1菌株培养物、细菌素、发酵上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常明显，抑菌圈直径分别为18mm、22mm、36mm，具体见图9。

5、对其他致病菌的抑菌试验

地衣芽孢杆菌FY1菌株发酵上清液的制备、细菌素的提取及抑菌试验操作方法均参照上述方法5中的金黄色葡萄球菌抑菌试验。分别选取了本实验室分离保存的4株鸡源大肠杆菌、2株鸡源沙门菌、3株鹅源沙门菌、1株鹌鹑源沙门菌、1株鸽源沙门菌、1株山羊节杆菌、1株鹅源志贺菌、1株鸡源多杀性巴氏杆菌、1株猪源气球菌等分别进行了抑菌试验。结果表明，本发明中分离的地衣芽孢杆菌FY1菌株抑菌谱较广，如对禽源大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和山羊节杆菌都有一定抑制作用，但抑菌效果相对较弱；而对鸡源多杀性巴氏杆菌和猪源气球菌均没有抑制作用，具体抑菌圈大小见表2。

表2 FY1菌株对其他致病菌的抑菌试验结果(单位：mm)

如表2所示，本发明中分离鉴定得到了一株地衣芽孢杆菌FY1菌株，发现其培养物、发酵上清液、粗提细菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常明显，特别是发酵上清液，抑制效果最好，抑菌圈直径可达36mm；同时对大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、节杆菌等其他致病菌也有抑制作用，抑菌效果相对较弱。

而当前金黄色葡萄球菌的耐药性问题在医院和畜禽养殖业都比较严重，因此本发明对金黄色葡萄球菌致病性的防治将有很好的疗效，作为一种新发现的益生菌菌株，今后有很好的应用前景，如作为饲料添加剂调节动物肠道菌群，提高其抗病力，关键是无毒无害无残留，并且抑菌效果明显。另外，对于细菌素的提取还有改进的空间，在FY1菌株发酵上清液中抑菌效果最好。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)FY1，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌FY1的保藏编号为：CCTCC NO：M 2022016，保藏日期为2022年01月05日。

2.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌FY1制备得到的发酵上清液。

3.一种权利要求2所述的发酵上清液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将地衣芽孢杆菌FY1菌株接种至LB肉汤培养基中，于37℃，180rpm振荡培养24h，5000rpm离心15min，除去菌体，保留上清即为FY1菌株的发酵上清液。

4.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌FY1制备得到的FY1菌株培养物。

5.一种权利要求4所述的FY1菌株培养物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将地衣芽孢杆菌FY1菌株接种至LB肉汤培养基中，于37℃，180rpm振荡培养24h，即为FY1菌株的培养物。

6.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌FY1产生的细菌素。

7.一种权利要求6所述的细菌素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：先制备发酵上清液，然后用浓盐酸将发酵上清液的pH值调至2.0，4℃过夜处理，再用10000rpmin离心15min，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，获得粗提细菌素。

8.一种权利要求2所述的发酵上清液、权利要求4所述的菌株培养物或权利要求6所述的细菌素在抑制病原菌中的应用。

9.根据权利要求8所述的发酵上清液、菌株培养物或细菌素在抑制病原菌中的应用，其特征在于，所述病原菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和节杆菌。