CN115772531A - 一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用 - Google Patents
一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115772531A CN115772531A CN202211410687.7A CN202211410687A CN115772531A CN 115772531 A CN115772531 A CN 115772531A CN 202211410687 A CN202211410687 A CN 202211410687A CN 115772531 A CN115772531 A CN 115772531A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pectate lyase
- lyase gene
- gene mutant
- mutant
- wild
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 12
- 241001150381 Bacillus altitudinis Species 0.000 claims description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000192710 Microcystis aeruginosa Species 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 4
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000005422 algal bloom Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用，从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；通过Discovery Studio软件将野生型果胶酸裂解酶基因序列的155位的甘氨酸Gly突变成丙氨酸Ala或缬氨酸Val，并克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。与现有技术相比，本发明克隆的果胶酸裂解酶基因突变体G155A可以增加酶在30‑40℃的热稳定性，克隆的果胶酸裂解酶基因突变体G155V可增加3倍的酶活，酶活可达756U/mg，这要明显高于目前报道的细菌果胶酸裂解酶酶活性。该方法简便快捷，可有效提高酶的活性及热稳定性，有利于生产实践的应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用。
背景技术
果胶酸裂解酶(Pectate lyase)属于果胶酶的一种，可有效降解果胶类物质。果胶酸裂解酶可用于多种工业加工，如食品业的果蔬汁澄清，纺织业的植物纤维脱胶和棉织物精炼等。近年来，随着酶工程的迅猛发展，因其高效、安全、经济等优点，在能源开发，环境保护，水质净化与石油污染净化方面的应用日益扩大。其中，果胶酸裂解酶就曾被利用进行污水处理且有效地降低了环境污染。
微生物产酶是果胶酸裂解酶的主要来源方式。根据文献报道来自微生物的果胶酸裂解酶的比活力一般为45-600U/mg，野生型酶比活力相对较低且温度稳定性较差，不能有效的满足工业的要求。
发明内容
本发明是要解决现有技术中存在的不足，提供一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用，以达到改变果胶酸裂解酶基因结构达到提高酶活或热稳定性的目的。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，包括以下步骤：
S1、从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；
S2、通过Discovery Studio软件将野生型果胶酸裂解酶基因序列的155位的甘氨酸Gly突变成丙氨酸Ala或缬氨酸Val，并克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
进一步地，所述步骤S1中克隆野生型果胶酸裂解酶基因BaPel具体方法如下：
利用同源克隆的方法，将FY1菌株16Sr DNA序列与NCBI上nucleartide数据库进行比对，以同源性最高的Bacillus altitudinis果胶酸裂解酶基因为模板设计引物，F1:5’-ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT-3’，R1:5’-TTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG-3’；用FY1基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系：94℃-4min，94℃-30S，60℃-30S，72℃-2min，30个循环，72℃-10min；即得野生型果胶酸裂解酶基因BaPel。
进一步地，所述步骤S2中克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V具体包括：
通过Discovery Studio软件对蛋白进行虚拟氨基酸突变，确定突变位点后；利用野生型果胶酸裂解酶基因序列为模板进行突变，并获得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。用野生型果胶酸裂解酶BaPel基因为模板，使用设计的引物：
| 引物名称 | 引物序列(5’—3’) |
| G155A-F1 | CGGGATCCATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT |
| G155A-R1 | GTTTTTAGAGCCGCCTTCGATTGCGATGGCATCTTTATCACCGA |
| G155A-F2 | ATCGAAGGCGGCTCTAAAAAC |
| G155A-R2 | CCCAAGCTTTTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG |
| G155V-F1 | CGGGATCCATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT |
| G155V-R1 | GTTTTTAGAGCCGCCTTCGATTACGATGGCATCTTTATCACCGA |
| G155V-F2 | ATCGAAGGCGGCTCTAAAAAC |
| G155V-R2 | CCCAAGCTTTTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG |
进行重叠PCR扩增，第一轮PCR扩增体系：94℃-1min，98℃-10S，60℃-40S，72℃-1min，30个循环；产物经试剂盒回收后作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR扩增体系：94℃-4min，94℃-30S，60℃-30S，72℃-2min，30个循环，72℃-10min；即得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
本发明的第二个目的是要提供一种如权利要求1所述的克隆方法克隆得到的果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
本发明的第三个目的是要提供一种果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V在微生物产果胶酸裂解酶中的应用。
与现有技术相比，本发明本发明从一株溶藻菌基因组DNA中克隆获得果胶酸裂解酶基因，将该酶155位的甘氨酸(Gly)突变成丙氨酸(Ala)可以增加酶在30-40℃的热稳定性，而将155位的甘氨酸(Gly)突变成缬氨酸(Val)可增加3倍的酶活，酶活可达756U/mg，这要明显高于目前报道的细菌果胶酸裂解酶酶活性。该方法简便快捷，可有效提高酶的活性及热稳定性，有利于生产实践的应用。
附图说明
图1为野生型和突变体酶活比较。
图2为野生型果胶酸裂解酶基因与其突变体的热稳定性对比图。
图3为野生型果胶酸裂解酶基因、果胶酸裂解酶基因突变体G155A、果胶酸裂解酶基因突变体G155V对铜绿微囊藻培养液降解后的颜色变化图：a、铜绿微囊藻培养液；b、野生型果胶酸裂解酶基因的降解结果；c、果胶酸裂解酶基因突变体G155A的降解结果；d、果胶酸裂解酶基因突变体G155V的降解结果。
图4为野生型果胶酸裂解酶基因、果胶酸裂解酶基因突变体G155A、果胶酸裂解酶基因突变体G155V对铜绿微囊藻的降解曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；
细菌菌株FY1是从扶余地区稻田水样中分离得到的，具体地：从稻田取得水样后在LB平板上进行分离纯化，获得单一菌株，将该菌株与铜绿微囊藻进行共培养，发现在培养3d后，藻类开始死亡，到7d时死亡率可达70％以上，说明该菌具有降解有害藻类-铜绿微囊藻的作用。通过16S rDNA测序，细菌菌株FY1的16S rDNA序列为：
GCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGC。获得的序列在NCBI进行比对，结果显示该菌株与高地芽孢杆菌41KF2BT的16S rDNA相似性为100％，因此细菌菌株FY1被鉴定为高地芽孢杆菌。
利用同源克隆的方法，将FY1菌株16Sr DNA序列与NCBI上nucleartide数据库进行比对，以同源性最高的Bacillus altitudinis果胶酸裂解酶基因(CP054136.1)为模板设计引物，F1:5’-ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT-3’，R1:5’-TTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG-3’。用FY1基因组DNA作为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：94℃-4min，94℃-30S，60℃-30S，72℃-2min，30个循环，72℃-10min。通过电泳检测结果，目的条带用试剂盒(大连宝生物有限公司)回收。将目的片段与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞后，在带有氨苄抗性的平板上筛出阳性克隆，挑取单菌落进行摇菌，提取质粒进行酶切验证后送往库美生物科技有限公司(长春)进行序列测定。测序结果经NCBI比对，与目的序列同源性达100％，表明FY1的果胶酸裂解酶BaPel基因克隆成功。
野生型果胶酸裂解酶BaPel基因序列：
ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTTAGCTGGTGTGTTAGCGGTTGGTCTCGTGACTTCATTATTTGCGCCAAATGGAGAGGCAAAAGCAGCAACGAAATATCCAGAAAGCCCTTCGATTATGGCCAATTTTAATCAGCAAGGATTCTCCACATTAAATGGCGGTACAACAGGCGGTGAAGGCGGTAAAACGGTGACGGTGAAAACCGGAAATGAACTATTAGCTGCCCTCAAAAGCAAAGGAACAAATGAAAAATTGAAAATCGTGGTAGACGGAACGATTACTCCTTCTAATACTTCAGCCAATAAAATTGATGTGAAAGATACAAACAATGTCTCCATCGTCGGTAAAGGGACAAACGGCGAATTTAACGGGATTGGTATTAAAGTATGGCGCGCCAATAACGTCATCATCCGCAACCTCAAAATCCATCACAGCAAAATCGGTGATAAAGATGCCATCGGAATCGAAGGCGGCTCTAAAAACGTATGGGTCGACCATAATGAACTCTACAACACTTTGAACTCTGGGAAAGATGACTATGATGGGTTATTCGATGTGAAAAATGACTCCGATTACATTACGTTCTCATGGAACTATGTCCATGACAGCTGGAAAACAATGCTGATGGGCAGCTCCGATAACGATAACTACAACAGAAAAATCACGTTCCACAACAACCGTTTTGAAAACTTGAACTCTCGTGTACCGTCTATGCGCTTCGGGGAAGGCCATGTGTATAACAACTATTACAAAAACATCCTAACAACAGCGATTAATTCACGTATGGGCGCGAAAATGAGAATTGAGCACAACGTATTTGAAAACACGAAAAATGCCATCGGGAGCTGGGACAGCAGTAAAGTTGGTACTTGGCATGTCATCAACAACTCTTATATTAACAGCACAGGTAGCCTGCCAACGTCTTCAACAGGTACGTACAACCCTCCTTATAACTACTCTTTGCTTAACGTGAACAATGTGAAATCAGAAGTTGTATCAAATGCGGGTGTAGGAAAAGTAAATCCTTAA。
通过Discovery Studio软件对蛋白进行虚拟氨基酸突变，确定突变位点后利用野生型果胶酸裂解酶基因序列为模板进行突变，并获得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V，具体操作如下：
设计带突变位点的引物进行突变，引物序列如下表：
| 引物名称 | 引物序列(5’—3’) |
| G155A-F1 | CGGGATCCATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT |
| G155A-R1 | GTTTTTAGAGCCGCCTTCGATTGCGATGGCATCTTTATCACCGA |
| G155A-F2 | ATCGAAGGCGGCTCTAAAAAC |
| G155A-R2 | CCCAAGCTTTTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG |
| G155V-F1 | CGGGATCCATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT |
| G155V-R1 | GTTTTTAGAGCCGCCTTCGATTACGATGGCATCTTTATCACCGA |
| G155V-F2 | ATCGAAGGCGGCTCTAAAAAC |
| G155V-R2 | CCCAAGCTTTTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG |
用野生型果胶酸裂解酶BaPel基因为模板，进行重叠PCR扩增。第一轮PCR扩增体系：94℃-1min，98℃-10S，60℃-40S，72℃-1min，30个循环。产物经试剂盒回收后作为第二轮PCR的模板。第二轮PCR扩增体系：94℃-4min，94℃-30S，60℃-30S，72℃-2min，30个循环，72℃-10min。产物为完整基因序列，其他步骤同BaPel基因克隆步骤相同。结果经DNAMAN比对，突变位点位置正确。
果胶酸裂解酶基因突变体G155A基因序列为：
ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTTAGCTGGTGTGTTAGCGGTTGGTCTCGTGACTTCATTATTTGCGCCAAATGGAGAGGCAAAAGCAGCAACGAAATATCCAGAAAGCCCTTCGATTATGGCCAATTTTAATCAGCAAGGATTCTCCACATTAAATGGCGGTACAACAGGCGGTGAAGGCGGTAAAACGGTGACGGTGAAAACCGGAAATGAACTATTAGCTGCCCTCAAAAGCAAAGGAACAAATGAAAAATTGAAAATCGTGGTAGACGGAACGATTACTCCTTCTAATACTTCAGCCAATAAAATTGATGTGAAAGATACAAACAATGTCTCCATCGTCGGTAAAGGGACAAACGGCGAATTTAACGGGATTGGTATTAAAGTATGGCGCGCCAATAACGTCATCATCCGCAACCTCAAAATCCATCACAGCAAAATCGGTGATAAAGATGCCATCGCAATCGAAGGCGGCTCTAAAAACGTATGGGTCGACCATAATGAACTCTACAACACTTTGAACTCTGGGAAAGATGACTATGATGGGTTATTCGATGTGAAAAATGACTCCGATTACATTACGTTCTCATGGAACTATGTCCATGACAGCTGGAAAACAATGCTGATGGGCAGCTCCGATAACGATAACTACAACAGAAAAATCACGTTCCACAACAACCGTTTTGAAAACTTGAACTCTCGTGTACCGTCTATGCGCTTCGGGGAAGGCCATGTGTATAACAACTATTACAAAAACATCCTAACAACAGCGATTAATTCACGTATGGGCGCGAAAATGAGAATTGAGCACAACGTATTTGAAAACACGAAAAATGCCATCGGGAGCTGGGACAGCAGTAAAGTTGGTACTTGGCATGTCATCAACAACTCTTATATTAACAGCACAGGTAGCCTGCCAACGTCTTCAACAGGTACGTACAACCCTCCTTATAACTACTCTTTGCTTAACGTGAACAATGTGAAATCAGAAGTTGTATCAAATGCGGGTGTAGGAAAAGTAAATCCTTAA。
果胶酸裂解酶基因突变体G155V基因序列为：
ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTTAGCTGGTGTGTTAGCGGTTGGTCTCGTGACTTCATTATTTGCGCCAAATGGAGAGGCAAAAGCAGCAACGAAATATCCAGAAAGCCCTTCGATTATGGCCAATTTTAATCAGCAAGGATTCTCCACATTAAATGGCGGTACAACAGGCGGTGAAGGCGGTAAAACGGTGACGGTGAAAACCGGAAATGAACTATTAGCTGCCCTCAAAAGCAAAGGAACAAATGAAAAATTGAAAATCGTGGTAGACGGAACGATTACTCCTTCTAATACTTCAGCCAATAAAATTGATGTGAAAGATACAAACAATGTCTCCATCGTCGGTAAAGGGACAAACGGCGAATTTAACGGGATTGGTATTAAAGTATGGCGCGCCAATAACGTCATCATCCGCAACCTCAAAATCCATCACAGCAAAATCGGTGATAAAGATGCCATCGTAATCGAAGGCGGCTCTAAAAACGTATGGGTCGACCATAATGAACTCTACAACACTTTGAACTCTGGGAAAGATGACTATGATGGGTTATTCGATGTGAAAAATGACTCCGATTACATTACGTTCTCATGGAACTATGTCCATGACAGCTGGAAAACAATGCTGATGGGCAGCTCCGATAACGATAACTACAACAGAAAAATCACGTTCCACAACAACCGTTTTGAAAACTTGAACTCTCGTGTACCGTCTATGCGCTTCGGGGAAGGCCATGTGTATAACAACTATTACAAAAACATCCTAACAACAGCGATTAATTCACGTATGGGCGCGAAAATGAGAATTGAGCACAACGTATTTGAAAACACGAAAAATGCCATCGGGAGCTGGGACAGCAGTAAAGTTGGTACTTGGCATGTCATCAACAACTCTTATATTAACAGCACAGGTAGCCTGCCAACGTCTTCAACAGGTACGTACAACCCTCCTTATAACTACTCTTTGCTTAACGTGAACAATGTGAAATCAGAAGTTGTATCAAATGCGGGTGTAGGAAAAGTAAATCCTTAA。
实施例2
上述实施例的果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V可应用到微生物产果胶酸裂解酶，以下进行具体实验。
将果胶酸裂解酶基因突变体G155A和野生型蛋白分别连接到ΔpET-30a表达载体上，然后将重组表达质粒ΔpET-30a-BaPel转化到感受态细胞BL21中，加入0.5mM IPTG，在16℃诱导16h，进行蛋白的原核表达。表达的重组蛋白分子量约38.5KDa；进一步进行重组蛋白的分离纯化，结合SDS-PAGE和Western blot结果，确定蛋白纯化效果。以多聚半乳糖醛酸(PGA)为底物，对野生型和突变体的酶比活力进行测定，确定G155V在酶比活力方面有所提高，具体结果如表1、图1所示。
表1野生型与突变体酶活性比较
比活力值是三次测定的平均值±标准误(SE)。
以多聚半乳糖醛酸(PGA)为底物，对野生型和突变体的热稳定性进行测定，确定突变体G155A在热稳定性上有所提高，具体结果如图2所示，从图2中可以看出，在30℃和40℃条件下，突变体G155A在120min时明显高于野生型，在40℃条件下，突变体G155A的活性要显著高于野生型及其他突变体。
铜绿微囊藻是引起水华的一种有害藻类，但由于藻类细胞壁果胶含量较高，不易被裂解。利用生物降解方式解决藻华问题近年来备受关注。图3、图4为利用果胶酸裂解酶处理铜绿微囊藻的结果。从图3可以看出，与CK相比，果胶酸裂解酶处理的铜绿微囊藻培养液颜色明显变浅(b,c,d)，说明果胶酸裂解酶可以使铜绿微囊藻细胞降解并死亡。图4进一步证明了这一结果，CK的藻细胞的OD值一直升高，但果胶酸裂解酶处理的藻细胞3d内没有增加，5d或7d时明显下降。其中突变体G155A下降最为明显。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；
S2、通过Discovery Studio软件将野生型果胶酸裂解酶基因序列的155位的甘氨酸Gly突变成丙氨酸Ala或缬氨酸Val，并克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
2.根据权利要求1所述的果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，其特征在于，所述步骤S1中克隆野生型果胶酸裂解酶基因BaPel具体方法如下：
利用同源克隆的方法，将FY1菌株16Sr DNA序列与NCBI上nucleartide数据库进行比对，以同源性最高的Bacillus altitudinis果胶酸裂解酶基因为模板设计引物，F1:5’-ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT-3’，R1:5’-TTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG-3’；用FY1基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系：94℃-4min，94℃-30S，60℃-30S，72℃-2min，30个循环，72℃-10min；即得野生型果胶酸裂解酶基因BaPel。
3.根据权利要求1所述的果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，其特征在于，所述步骤S2中克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V具体包括：
通过Discovery Studio软件对蛋白进行虚拟氨基酸突变，确定突变位点后；利用野生型果胶酸裂解酶基因序列为模板进行突变，并获得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V；用野生型果胶酸裂解酶BaPel基因为模板，使用设计的引物
进行重叠PCR扩增，第一轮PCR扩增体系：94℃-1min，98℃-10S，60℃-40S，72℃-1min，30个循环；产物经试剂盒回收后作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR扩增体系：94℃-4min，94℃-30S，60℃-30S，72℃-2min，30个循环，72℃-10min；即得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
4.一种如权利要求1所述的克隆方法克隆得到的果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
5.一种如权利要求4所述的果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V在微生物产果胶酸裂解酶中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211410687.7A CN115772531A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211410687.7A CN115772531A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115772531A true CN115772531A (zh) | 2023-03-10 |
Family
ID=85388880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211410687.7A Pending CN115772531A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115772531A (zh) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001029230A2 (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-26 | Carnegie Institution Of Washington | Engineering disease resistance with pectate lyase-like genes |
| CN1662650A (zh) * | 2002-05-14 | 2005-08-31 | 诺和酶股份有限公司 | 果胶酸裂解酶变体 |
| CN1867668A (zh) * | 2003-10-10 | 2006-11-22 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
| WO2011143632A2 (en) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Codexis, Inc. | Cellobiohydrolase variants |
| CN103233032A (zh) * | 2013-04-10 | 2013-08-07 | 吉林农业大学 | 谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及l183q定点突变方法 |
| CN105368856A (zh) * | 2015-12-09 | 2016-03-02 | 吉林大学 | 一种比活提高的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、酶及其应用 |
| CN105368811A (zh) * | 2014-08-08 | 2016-03-02 | 中国科学院微生物研究所 | 果胶裂解酶及其编码基因和应用 |
| CN111254154A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种果胶酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用 |
| CN112111407A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-22 | 天津科技大学 | 一种生产碱性果胶裂解酶的集胞藻pcc6803藻株及其构建方法 |
| CN113549608A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-10-26 | 中国农业科学院麻类研究所 | 一种果胶裂解酶突变体△PelG403及其编码基因、制备方法和应用 |
| CN114395511A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-04-26 | 安徽科技学院 | 一株地衣芽孢杆菌fy1及其应用 |
-
2022
- 2022-11-11 CN CN202211410687.7A patent/CN115772531A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001029230A2 (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-26 | Carnegie Institution Of Washington | Engineering disease resistance with pectate lyase-like genes |
| CN1662650A (zh) * | 2002-05-14 | 2005-08-31 | 诺和酶股份有限公司 | 果胶酸裂解酶变体 |
| CN1867668A (zh) * | 2003-10-10 | 2006-11-22 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
| WO2011143632A2 (en) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Codexis, Inc. | Cellobiohydrolase variants |
| CN103233032A (zh) * | 2013-04-10 | 2013-08-07 | 吉林农业大学 | 谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及l183q定点突变方法 |
| CN105368811A (zh) * | 2014-08-08 | 2016-03-02 | 中国科学院微生物研究所 | 果胶裂解酶及其编码基因和应用 |
| CN105368856A (zh) * | 2015-12-09 | 2016-03-02 | 吉林大学 | 一种比活提高的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、酶及其应用 |
| CN111254154A (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种果胶酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用 |
| CN112111407A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-22 | 天津科技大学 | 一种生产碱性果胶裂解酶的集胞藻pcc6803藻株及其构建方法 |
| CN113549608A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-10-26 | 中国农业科学院麻类研究所 | 一种果胶裂解酶突变体△PelG403及其编码基因、制备方法和应用 |
| CN114395511A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-04-26 | 安徽科技学院 | 一株地衣芽孢杆菌fy1及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GENBANK: "GenBank: OP321270.1", GENBANK, 8 April 2023 (2023-04-08), pages 1 - 2 * |
| YE YUAN: "A Novel PL9 Pectate Lyase from Paenibacillus polymyxa KF-1: Cloning, Expression, and Its Application in Pectin Degradation", INT J MOL SCI, 22 June 2019 (2019-06-22), pages 1 - 17 * |
| 昂安娜;堵国成;葛飞;朱龙宝;江志超;马琪森;朱龙龙;陶玉贵;: "N-糖基化改造碱性果胶酶的热稳定性", 食品与发酵工业, no. 05, 22 January 2018 (2018-01-22), pages 26 - 32 * |
| 雷建湘;刘贤雪;沈雪亮;汪钊;: "离子注入结合紫外线及~(60)Co-γ射线诱变选育碱性果胶酸裂解酶高产菌株的研究", 工业微生物, no. 02, 22 April 2010 (2010-04-22), pages 44 - 49 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112831485B (zh) | 一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9 | |
| CN112646794B (zh) | 低温活性提高的外切菊粉酶突变体MutY119V | |
| CN112813052B (zh) | 一种低温活性提高的外切菊粉酶突变体MutDP121ET6 | |
| CN112852782B (zh) | 一种低温适应性改良的低温外切菊粉酶突变体MutDL121EK5及应用 | |
| KR20110119386A (ko) | 바실러스 벨렌첸시스 ａ-68 유래 섬유소 분해효소 유전자 및 이를 도입하여 형질전환된 에셰리키아 콜리 ａ-68 균주 및 이를 이용한 섬유소 분해효소의 생산 방법 | |
| CN112725310A (zh) | 一种不耐热的低温外切菊粉酶突变体MutG360Δ9 | |
| JP7241368B2 (ja) | アオサ多糖リアーゼおよびそのコード遺伝子と応用 | |
| CN112899258B (zh) | 一种耐热性β-甘露聚糖酶突变体ManAK-10及其编码基因和应用 | |
| CN106754825B (zh) | 提高比活的α-淀粉酶BaAmy突变体及其编码基因和应用 | |
| CN111394374A (zh) | 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用 | |
| CN115029335B (zh) | 一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN115772531A (zh) | 一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用 | |
| CN107022536B (zh) | 高催化效率的纤维素酶突变体及其基因和应用 | |
| CN110628748B (zh) | 提高比活的α-淀粉酶突变体BasAmy-2及其编码基因和应用 | |
| CN110804620B (zh) | 一种麦芽糖生产用重组异淀粉酶高效表达及应用 | |
| CN109401991B (zh) | 重组酿酒酵母及生料发酵生产乙醇的方法 | |
| CN116555156B (zh) | 一种提高l-缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌 | |
| CN110004130B (zh) | 一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用 | |
| CN113801831B (zh) | 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| Retnaningrum et al. | Molecular identification and optimization culture conditions of amylase producing bacteria isolated from green algae in the coast side of Southern Sea, Yogyakarta, Indonesia | |
| CN106834254B (zh) | 一种酸性高比活木聚糖酶xyn11a及其基因和应用 | |
| CN104560914B (zh) | 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用 | |
| CN104946608A (zh) | 一种适冷超氧化物歧化酶及其编码基因与应用 | |
| CN117925549A (zh) | 一种耐高温漆酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用 | |
| CN114438057A (zh) | 一种耐热耐碱木聚糖酶及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |