CN104560914B - 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用 - Google Patents

一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104560914B
CN104560914B CN201410833881.5A CN201410833881A CN104560914B CN 104560914 B CN104560914 B CN 104560914B CN 201410833881 A CN201410833881 A CN 201410833881A CN 104560914 B CN104560914 B CN 104560914B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amy16
amylase
alpha
gene
alpha amylase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410833881.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104560914A (zh
Inventor
曾润颖
周桂兰
金敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Institute of Oceanography SOA
Original Assignee
Third Institute of Oceanography SOA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Institute of Oceanography SOA filed Critical Third Institute of Oceanography SOA
Priority to CN201410833881.5A priority Critical patent/CN104560914B/zh
Publication of CN104560914A publication Critical patent/CN104560914A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104560914B publication Critical patent/CN104560914B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用，涉及淀粉酶。所述α‑淀粉酶Amy16分离自太平洋火色杆菌H2；α‑淀粉酶Amy16的制备：1)克隆α‑淀粉酶基因amy16，将α‑淀粉酶基因amy16插入表达载体，构建携带α‑淀粉酶基因amy16的重组表达载体；将α‑淀粉酶基因amy16的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中裂解，将裂解后的悬液离心，收集上清液；将所得上清液纯化，即得所述α‑淀粉酶Amy16。所述α‑淀粉酶Amy16可在制备淀粉降解剂中应用。

Description

一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用
技术领域
本发明涉及淀粉酶，尤其是涉及分离自太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2具有热稳定性和强碱耐受性的一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用。
背景技术
淀粉酶是一类能够水解淀粉产生糊精以及更小的多糖单位或单糖的酶类总称。根据作用方式的不同，淀粉酶可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)属于糖苷水解酶13家族，能够通过随机酶切α-1,4-糖苷键来降解长链淀粉。基于序列和底物特异性的不同，还可以将α-淀粉酶进一步地分为35个α-淀粉酶亚家族。α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，但目前应用于工业的α-淀粉酶大多来自于微生物。
对α-淀粉酶的研究已经有半个多世纪，目前，α-淀粉酶已是最重要的工业酶制剂之一，已被广泛应用在食品、洗涤剂、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。α-淀粉酶的一个重要工业应用是在食品加工行业中被用来处理降解淀粉类物质。目前在工业上大量使用的α-淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。这些酶大多具有耐高温甚至耐超高温的特性，它们的应用可以简化淀粉加工工艺，降低加工成本；另一方面，高温发酵罐的高生产成本和设备、发酵技术等瓶颈也严重限制了高温α-淀粉酶的大规模发酵以及在淀粉加工行业的进一步应用(Van Der Maarel,M.J.,B.Van Der Veen,et al.(2002)."Properties andapplications of starch-converting enzymes of theα-amylase family."Journal of Biotechnology 94(2):137-155)。因此近年来，中温淀粉酶也受到了越来越多的关注。虽然我国上世纪70年代已有了α-淀粉酶工业化生产，相继开发出多种中温淀粉酶，但大部分淀粉酶的酶学性质仍无法完全满足现代工业的需求。
中国专利CN 102925420B公开一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株，所述的α淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1。用于表达α淀粉酶的黑曲霉P15，其保藏编号为CGMCC No.6434。该发明所得到的重组菌种能够表达棒曲霉α淀粉酶AclaP15，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了AclaP15的应用领域。
中国专利CN 102827816B公开一种α-淀粉酶及其应用，所述的α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。该发明筛选出的α-淀粉酶在淀粉水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的α-淀粉酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达α-淀粉酶的重组菌。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种能够应用的具有热稳定和碱耐受性强等特性的新型α-淀粉酶Amy16。
本发明的第二目的是提供编码α-淀粉酶的基因amy16。
本发明的第三目的是提供包含基因amy16的重组载体。
本发明的第四目的是提供包含基因amy16的重组菌株。
本发明的第五目的是提供α-淀粉酶Amy16的制备方法。
本发明的第六目的是提供α-淀粉酶Amy16的应用。
所述α-淀粉酶Amy16分离自太平洋火色杆菌H2(Flammeovirga Pacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012229，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
所述α-淀粉酶Amy16的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1如下：
α-淀粉酶基因编码455个氨基酸，该酶基因表达的Amy16蛋白分子量约为52kDa。本发明的淀粉酶Amy16同时具有较好的热稳定性、中温条件下在中性和碱性范围内均具有高活性等特征。本发明筛选到的Amy16最适温度为50℃，在60℃下仍具有60％的活力，且在60℃下孵育20min后保有80％的起始活力，40min之后仍保有65％的起始活力，表明本发明的淀粉酶Amy16具有良好的热稳定性。Amy16的最适pH为6.5，在pH 5.5～9之间的范围内维持50％以上的酶活性。此外α-淀粉酶Amy16在pH 6，7，8条件下孵育1h活力基本保持不变，在pH9条件下孵育1h保有70％的起始活力，在pH 10条件下孵育1h后仍保有40％的起始活力，表明了该酶具有较强的碱耐受性。由于本发明的淀粉酶具有良好的热稳定性和碱耐受性，且可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉产生葡萄糖，因此可以广泛地用于食品加工、饲料、轻工等领域，具有良好的工业应用前景。
编码α-淀粉酶Amy16的基因amy16的基因序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2如下：
本发明通过PCR方法从太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2中获得淀粉酶基因amy16，该基因全长为1368bp。将淀粉酶基因amy16序列及推导出的氨基酸序列在NCBI中进行BLAST比对显示Amy16是一种新的淀粉酶。Amy16的基因序列与其他已知序列无高同源性，且Amy16的氨基酸序列只与小部分淀粉酶氨基酸序列有70％的同源性，但这些同源性为70％的淀粉酶的性质均未知。Amy16与已知性质的淀粉酶的氨基酸序列最高同源性仅为50％。
包含α-淀粉酶Amy16基因amy16的重组载体为pET-His-amy16。将淀粉酶基因amy16插入到表达载体pET-His的限制性酶切位点EcoR I和Hind III之间，使该基因序列位于T7启动子的下游并受其调控，从而得到重组表达质粒pET-His-amy16。
所述α-淀粉酶Amy16的制备方法，包括以下步骤：
1)克隆α-淀粉酶基因amy16，将所述α-淀粉酶基因amy16插入表达载体，构建携带所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体；
2)将所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
3)离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬所述大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解，将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；
4)将步骤3)所得上清液按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述α-淀粉酶Amy16。
在步骤2)中，所述培养基的组成可为：含有100μg/mL氨苄霉素和2g/L葡萄糖(w/v)的LB培养基；所述发酵培养的条件可为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时(OD600为发酵液在600nm处的吸光度值)，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，15℃诱导6h。
本发明从太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2中筛选得到一种新型α-淀粉酶Amy16，并发现该淀粉酶Amy16具有较好的热稳定性和碱耐受性，本发明提供一种具有热稳定性和碱耐受性特征的α-淀粉酶Amy16克隆表达、蛋白快速纯化和应用的方法。因此，所述α-淀粉酶Amy16可在制备淀粉降解剂中应用，所述应用主要应用于食品加工、啤酒发酵等工业。
本发明具有以下突出效果：
1.新型的编码基因序列，在NCBI数据库中未能匹配到高相似度完整的ORF基因序列。
2.新型α-淀粉酶Amy16能够在大肠杆菌中高效稳定表达，在制备方法步骤2)中加入葡萄糖可大幅降低本底表达并能够维持质粒在大肠杆菌中的稳定性。
3.α-淀粉酶Amy16是一种中温淀粉酶，纯化后的α-淀粉酶Amy16活力很高，在中高温条件下稳定性强，在碱性条件下仍具有高活性和稳定性，克服了现有大部分α-淀粉酶在碱性条件下失活等不足。
4.重组表达的α-淀粉酶Amy16是液化型淀粉水解内切酶，可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉产生葡萄糖。
5.在本发明中，来源于太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2的中温α-淀粉酶Amy16具有较好的热稳性和碱耐受性，且可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉制取葡萄糖，因此可以广泛地用于食品加工、饲料、轻工等领域，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为纯化的α-淀粉酶Amy16蛋白电泳图谱。泳道M为蛋白marker；泳道1为经镍柱亲和纯化所得的重组蛋白Amy16(52kDa)。
图2为α-淀粉酶Amy16重组蛋白的最适温度。横坐标为温度(℃)，纵坐标为相对酶活性(％)。
图3为α-淀粉酶Amy16重组蛋白的热稳定性。横坐标为孵育时间(T)，纵坐标为相对酶活性(％)。
图4为α-淀粉酶Amy16重组蛋白的最适pH。横坐标为pH，纵坐标为相对酶活性(％)。
图5为α-淀粉酶Amy16的pH稳定性。横坐标为pH，纵坐标为相对酶活性(％)。
图6为α-淀粉酶Amy16重组蛋白水解可溶性淀粉产物的薄层色谱分析。泳道M为麦芽寡糖的混合标准品(G1葡萄糖、G2麦芽糖、G3麦芽三塘、G4麦芽四糖，泳道1-6为酶解不同时间的反应产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
实施例1太平洋火色杆菌H2(Flammeovirga Pacifica H2)基因组DNA的提取
用接种环挑取-80℃保存的菌种，在2216E培养基平板(一种细菌培养基，配方为1％的胰蛋白胨，0.2％的酵母提取物，1.5％琼脂粉，海水100mL)上划线分离单菌落。划线后的平板置37℃培养过夜，挑取单菌落接种到5mL的2216E液体培养基中，37℃摇动培养过夜，6000g离心8min收集菌体，沉淀重新悬浮于567μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，加入30μL 10％SDS并摇匀，再加入3μL蛋白酶K(20mg/mL)，轻轻混匀，37℃水浴1h。加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)/NaCl，轻柔混匀，65℃水浴10min。用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，15000g离心10min，上清小心转移至另一个离心管中。用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次，15000g离心10min，用异丙醇沉淀DNA，再用70％乙醇洗涤两次，沉淀溶于重蒸水中，-20℃保存。
实施例2α-淀粉酶基因amy16的PCR扩增
根据Flammeovirga Pacifica H2基因组测序及基因注释结果，设计引物如下：
F：5′-CGGAATTCATGGAGGACAATGAG AGT-3′(划线为EcoR I酶切位点)(SEQ IDNO.3)；
R：5′-GCGAAGCTTTTATTTCAATGTCCAAATAG-3′(划线为HindⅢ酶切位点)(SEQ IDNO.4)。
以提取的Flammeovirga Pacifica H2基因组DNA为模板，用引物F和R扩增全长的amy16基因。PCR反应条件为：在50μL的反应体系中含有：10×PCR缓冲液5μL,dNTP 5μL，终浓度为10pmol的双向引物，PrimeStar DNA聚合酶1μL，模板DNA 1μL，用双蒸水补足体积到50μL；反应条件：94℃ 5min；95℃ 90s、58℃ 90s、72℃ 90min(30cycles)；72℃ 10min。纯化后的PCR产物进行酶切，与同种酶酶切后的pET-His载体连接构建重组载体pET-His-amy16，并通过化学转化法转化到大肠杆菌DH5α中，挑阳性克隆进行测序。
实施例3重组Amy16的表达和纯化
将上述实施例2中获得的重组载体pET-His-amy16转化大肠杆菌BL21中，选取阳性克隆在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(一种细菌培养基，配方为1％的胰蛋白胨，0.5％的酵母提取物，1％的NaCl)中37℃摇培至OD600＝0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，15℃诱导6h后将菌液收集至50mL的离心管中，12000g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在2.5mL的Tris/HCl(pH8.0)缓冲液中，超声波破碎菌体，12000g离心15min，收集上清，纯化过程按照镍离子亲和层析柱纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化的蛋白经10％的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为52kDa(图1)。
α-淀粉酶基因编码455个氨基酸，该酶基因表达的Amy16蛋白分子量约为52kDa(图1)。本发明的淀粉酶Amy16同时具有较好的热稳定性、中温条件下在中性和碱性范围内均具有高活性等特征。本发明筛选到的Amy16最适温度为50℃(图2)，在60℃下仍具有60％的活力，且在60℃下孵育20min后保有80％的起始活力，40min之后仍保有65％的起始活力，表明本发明的淀粉酶Amy16具有良好的热稳定性(图3)。Amy16的最适pH为6.5，在pH 5.5～9之间的范围内维持50％以上的酶活性(图4)。此外该淀粉酶Amy16在pH 6，7，8条件下孵育1h活力基本保持不变，在pH 9条件下孵育1h保有70％的起始活力，在pH 10条件下孵育1h后仍保有40％的起始活力，表明了该酶具有较强的碱耐受性(图5)。由于本发明的淀粉酶具有良好的热稳定性和碱耐受性，且可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉产生葡萄糖，因此可以广泛地用于食品加工、饲料、轻工等领域，具有良好的工业应用前景。
实施例4重组α-淀粉酶Amy16的酶学性质
1.重组α-淀粉酶Amy16酶活力的测定方法如下：
淀粉酶活性测定，采用DNS检测还原糖量的方法。反应体系：230μL含1％可溶性淀粉(w/v)的20mmol/L的Tris/HCl(pH8.0)与20μL稀释酶溶液混匀后，40℃条件下反应30min，于100℃水浴加热10min以终止反应。加入750μL的DNS溶液，加热5min、定容至1mL，540nm下测定样品的吸光度值。一个酶活力单位定义为50℃下1min生产lμmol还原糖所需要的酶量。采用同样的方法，用已知浓度的葡萄糖溶液构建标准曲线。通过酶活性检测，计算得到重组α-淀粉酶Amy16的酶活力为74.07U/mg。
2.重组淀粉酶Amy16最适温度和温度稳定性测序方法如下：
在反应温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的条件下，分别测定不同温度条件下Amy16的酶活力，以酶活最高为100％来计算相对酶活，来确定酶的最适反应温度。将等量酶液分别在40℃、50℃、60℃、80℃的条件下孵育5min、10min、20min、40min，待冷却后测定残余的酶活力，以未孵育酶液的酶活力为100％，计算相对酶活，以确定酶的热稳定性。
3.重组淀粉酶Amy16最适pH和pH稳定性测序方法如下：
配制pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.6、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、10.6的含有可溶性淀粉酶的缓冲液，加入等量酶液后测定相应的酶活力,以酶活最高为100％来计算相对酶活，确定酶的最适反应pH值。将等量酶液分别加入pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液中孵育60min，并测定残余的酶活力，以未孵育酶液的酶活力为100％，计算相对酶活，以确定酶的pH稳定性。
4.重组淀粉酶Amy16酶解产物分析方法如下：
在230μL的20mmol/L的Tris/HCl缓冲液中加入1％(w/v)可溶性淀粉，混匀后加入20μL的酶溶液。将反应物混匀后，40℃条件下反应，在0h、0.5h、1h、2h、3h、6h时间断分别取样，所取样品分别置100℃水浴中加热15min以终止反应。以麦芽寡糖混合物为标准品，将以上样品分别取4μL点到硅胶60薄层色谱板(Merck，Darmstadt，德国)上。用三氯甲烷-乙酸-双蒸水(18∶21∶3，v/v)扩散缓冲液扩散处理后，待板干燥后，喷上浓硫酸-乙醇(1∶9，v/v)显色液，100℃下显色20min后观察黑点出现(图6)。
实施例5重组α-淀粉酶Amy16和糖化酶协同水解马铃薯粉的正交试验
选取底物浓度、反应温度、反应时间、酶量4个主要影响因素,进行正交优化试验,以确定α-淀粉酶Amy16和糖化酶协同水解马铃薯粉的最佳工艺条件。实验结果表明：Amy16水解马铃薯粉的最佳酶解工艺条件为:反应温度50℃、pH6.5、反应时间2.5h、底物质量浓度为0.2g/mL、加酶量为底物淀粉质量的0.4％，在此条件下，Amy16和糖化酶协同水解马铃薯淀粉产生的葡萄糖量最高。
本发明提供了一种来源于太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2的淀粉酶Amy16，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述淀粉酶的编码基因amy16。本发明的淀粉酶具有以下性质：最适pH6.5，最适温度50℃，具有较好的温度和pH稳定性。本发明还提供了一种含有本发明的淀粉酶基因的基因工程菌，可用来制备本发明的淀粉酶。本发明的淀粉酶可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉产生葡萄糖，因此本发明的淀粉酶可广泛用于食品加工、饲料、轻工等领域，具有良好的工业应用前景。

Claims (6)

1.一种α-淀粉酶Amy16，分离自太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012229；
所述α-淀粉酶Amy16的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。
2.编码α-淀粉酶Amy16的基因amy16，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述α-淀粉酶Amy16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)克隆α-淀粉酶基因amy16，将所述α-淀粉酶基因amy16插入表达载体，构建携带所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体；
2)将所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
3)离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬所述大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解，将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；
4)将步骤3)所得上清液按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述α-淀粉酶Amy16。
4.如权利要求3所述α-淀粉酶Amy16的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养基的组成为：含有100μg/mL氨苄霉素和2g/L葡萄糖的LB培养基。
5.如权利要求3所述α-淀粉酶Amy16的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵培养的条件为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1mM，15℃诱导6h。
6.如权利要求1所述α-淀粉酶Amy16在制备淀粉降解剂中的应用。
CN201410833881.5A 2014-12-29 2014-12-29 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用 Active CN104560914B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410833881.5A CN104560914B (zh) 2014-12-29 2014-12-29 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410833881.5A CN104560914B (zh) 2014-12-29 2014-12-29 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104560914A CN104560914A (zh) 2015-04-29
CN104560914B true CN104560914B (zh) 2017-07-21

Family

ID=53077994

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410833881.5A Active CN104560914B (zh) 2014-12-29 2014-12-29 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104560914B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101691579A (zh) * 2009-09-16 2010-04-07 淮海工学院 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用
CN103232983B (zh) * 2013-05-09 2015-03-11 华东理工大学 用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生产淀粉酶的培养基
CN103436511B (zh) * 2013-06-28 2015-03-04 国家海洋局第三海洋研究所 一种高温碱性蛋白酶及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104560914A (zh) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102787130B (zh) 一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法
CN108660145A (zh) 耐热型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用
CN109943546B (zh) 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用
CN108753669A (zh) 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用
Khusro et al. Molecular identification of newly isolated Bacillus strains from poultry farm and optimization of process parameters for enhanced production of extracellular amylase using OFAT method
Bukhari et al. Purification and Characterization of α-Amylase from Bacillus subtilis Isolated from Local Environment.
CN105039374B (zh) 一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用
CN104726435B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株
CN114426961B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用
CN110373403B (zh) 耐高温中性普鲁兰酶及其应用
CN102660570A (zh) 一种提高酶热稳定性的方法
CN109022396B (zh) 一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用
CN116731989B (zh) 漆酶突变体、基因工程菌及其应用
Siroosi et al. Halophilic amylase production and purification from Haloarcula sp. strain D61
CN108330079A (zh) 一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用
CN104877983B (zh) 一种海藻糖合酶突变体及其制备与应用
CN114736880B (zh) 酸稳定性提高葡萄糖氧化酶GoxM10的突变体D497N及其衍生突变体和应用
CN114736881B (zh) 酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用
CN104560914B (zh) 一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用
CN101886064B (zh) 一种酸性淀粉酶amya4及其基因和应用
CN101942427B (zh) 一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法
CN108823186A (zh) 一种玉米淀粉降解能力提高的嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用
CN101280290B (zh) 一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌及其构建
CN104087604A (zh) 一种菊糖果糖转移酶基因表达序列
Wang et al. Expression and characterization of an α-glucosidase from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 with potential for industrial application

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant