CN108330079A

CN108330079A - 一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用

Info

Publication number: CN108330079A
Application number: CN201711013184.5A
Authority: CN
Inventors: 李金良; 陆兆新; 孟凡强; 吕凤霞; 杨娟
Original assignee: Nanjing Fusi Furui Biotechnology Co ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Fusi Furui Biotechnology Co ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明公开了一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用。它是从云南腾冲热泉附近的土壤样品中，通过菌体的富集、筛选得到一株产中温普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌。通过蛋白质电泳和N端测序技术分析普鲁兰酶N端组成，分析基因组数据得到中温普鲁兰酶的基因。本发明将该基因以整合到枯草芽孢杆菌基因组的方式在枯草芽孢杆菌中表达，得到较原始菌株酶活有极大提高的重组菌株，为后续的工业生产提供基础。

Description

一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用

技术领域

本发明属于微生物领域和生物技术领域，具体为一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用。

背景技术

普鲁兰酶(pullulanase)是一类淀粉脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖(pullulan，麦芽三糖以α-1，6糖苷键连接起来的聚合物)而得名，属淀粉酶类，能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉。

普鲁兰酶是一种在低pH值下应用的热稳定脱支酶，与糖化酶一起使用，可由液化淀粉浆来生产高葡萄糖浆和高麦芽糖浆。该酶在高温酸性下稳定，并可水解液化淀粉中的α-1.6-D糖苷键而产生包含(1，4-α-D)葡糖键的直链多聚糖。

淀粉水解工业过程对温度要求较高，目前的高温淀粉酶最适温度在90℃以上，为配合高温淀粉酶的使用，就需要筛选产生耐高温的普鲁兰酶的菌株。大多数嗜热菌存在环境温度较高的地方，如火山口和温泉等；嗜热菌的最适生长温度为60-80℃，是产耐热酶原始菌的主要来源。从嗜热菌富集环境中筛选产耐热普鲁兰酶的菌株是很多相关领域研究者的研究重点，与普通普鲁兰酶产生菌株相比，产耐热普鲁兰酶菌株具有很多优势，如提高转化率、改善底物溶解性、降低黏度和减少微生物污染等。例如来源于粘液硫还原球菌(Desulfurococcus mucosus)的普鲁兰酶的最适温度为85℃，在80℃酶活可以在4个小时内基本保持不变，在85℃的酶活半衰期为50分钟。

除此之外，在纺织行业，利用精制的淀粉酶作为退浆剂，在50-80℃反应退浆，适用于丝绸、化纤、棉毛织品等不耐高温的产品。在发酵工业中采用中温(50-80℃)液化淀粉，能够减少能耗。所以开发中温的普鲁兰酶配合中温淀粉酶使用，能够极大地提高淀粉液化的效率。所以中温普鲁兰酶具有广阔的应用前景。

普鲁兰酶与其他淀粉酶协同作用或单独作用，使食品质量提高，降低粮耗，节约成本，减少污染。普鲁兰酶能分解支链的特性决定了他在食品工业中的广泛应用，已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的新品种，具有广阔的开发和应用前景，其在食品工业中的应用研究也将日趋广泛和深入。目前国际上普鲁兰酶的工业化生产被丹麦垄断，我国仅局限于实验室研究,且酶活较低，所以开发普鲁兰酶对食品加工领域具有重要的工业价值。

发明内容

本发明的目的在于为了解决以上现有技术的不足而提供一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明从腾冲热泉附近土壤中分离得到一株产中温普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No.14445。

以上所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌，其最适温度为60℃，最适pH为6.0，在30-80℃，pH3.0-8.0之间能保持较高活性。

一种普鲁兰酶，其由以上所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵得到。

进一步地，以上所述的普鲁兰酶，编码该酶的基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，以上所述的普鲁兰酶，编码该酶的氨基酸包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种重组载体，包括以上所述的核苷酸序列和原始载体，具体为将以上所述的核苷酸序列插入原始载体得到。

进一步地，所述的重组载体，所述原始载体可以为pCBS或温敏型重组载体pCBS221。

进一步地，以上所述的重组载体的构建方法，通过引物扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，扩增产物经限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ酶切后与同样经过酶切的质粒pCBS221或pCBS连接，得到重组载体。

一种重组菌株，将以上所述的重组载体整合到表达菌株中得到。

进一步地，所述的重组菌株，所述表达菌株可以为枯草芽孢杆菌；

更进一步地，所述表达菌株可以为枯草芽孢杆菌B.subtilis 168、枯草芽孢杆菌衍生菌株BS001、枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800中的任意一种，其中枯草芽孢杆菌衍生菌株BS001包括aprE-、nprE-、或amyE-三种类型。

一种普鲁兰酶表达元件，包括能够在枯草芽孢杆菌中表达的启动子、能够稳定RNA的稳定序列、能在枯草芽孢杆菌中分泌蛋白的信号肽、权利要求4所述的核苷酸序列以及能够终止转录反应的终止子。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达元件，所述启动子可以为解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶Q的启动子PamyQ，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达元件，所述稳定序列为苏云金芽孢杆菌晶体蛋白cry3A，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述的普鲁兰酶表达元件，所述信号肽为地衣芽孢杆菌的几丁质酶chiA的N端信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种以上所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的发酵培养基，该发酵培养基包括以下组分：蔗糖100g，葡萄糖20g，大豆粉20g，硫酸铵3g，磷酸氢二钠10g，硫酸锰0.03g或硫酸镁0.1g，其中培养基调节pH至7.0±0.2。

一种以上所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的发酵培养方法，将产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌单菌落接种到种子培养基，37℃，220转/分钟，培养过夜，然后按照2％的接种量，接种到权利要求16所述的发酵培养基中，37℃，220转/分钟，培养48小时，离心得上清液中普鲁兰酶。

本发明筛选得到的菌株为解淀粉芽孢杆菌，相对于其它的耐热普鲁兰酶产生菌(嗜热古菌Thermococcus)，其培养条件更加简单，对温度要求低，可以在正常的37℃环境下培养，有利于大规模的发酵生产。解淀粉芽孢杆菌是公认安全性微生物，不会产生内毒素，不会对人体和动物产生毒害。

本发明提供的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵得到的普鲁兰酶具有优良的中温活性，良好的pH适应性。最适反应温度为60℃，在不加保护剂的乙酸钠缓冲液中，70℃条件下处理4小时，酶活保持77％以上。最适pH为6.0，在pH3.0-8.0范围内，在25℃保存4h后相对酶活大于70％。

附图说明

图1为本发明实施例2涉及到的产中温普鲁兰酶菌株T-10系统发育树；

图2为本发明实施例6中含有普鲁兰酶表达框的枯草芽孢杆菌重组载体整合型质粒pCBS221-pulG。

具体实施方式：

实施例1

本实施例从云南腾冲热泉附近的土壤样品中，通过菌体的富集、筛选得到一株产中温普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌，具体过程如下：

菌体富集：将少量土壤样品无菌条件下加入至100mL肉汤培养基中，37℃振荡培养48h。取1mL培养物于9mL灭菌蒸馏水中混匀，相同操作，将培养物稀释10^-6、10^-7、10^-8，涂布于分离培养基固体平板上。

平板初筛、复筛：取适当稀释浓度的培养液涂布于分离培养基，37℃恒温箱倒置培养48h，在分离平板中滴加3mL1％的碘液，挑取有透明圈者，划线分离纯化，37℃培养倒置培养24h。在分离平板中滴加3mL1％的碘液，把有透明圈的菌株转入鉴别培养基，于37℃恒温箱中培养48h。后加入10mL无水乙醇，室温放置。观察菌落周围的透明圈情况，透明圈的大小可一定程度上反映菌株产普鲁兰酶活力的高低。将初筛得到的纯化后的菌种，用接种环挑取少量菌体，接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床培养48h。测定发酵上清液中普鲁兰酶活力。

酶活测定：以葡萄糖为标准品，用DNS法测定反应液中还原糖的量。可见光分光光度计测定540nm处的吸光值，制作标准曲线。

取发酵液5000r/min离心10min后得到上清酶液，洁净试管中依次加入的0.5％普鲁兰糖溶液1ml，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释的发酵上清液1ml，60℃水浴预热30min，取出加入DN试剂3ml，沸水显色，后流水冷却，加蒸馏水10mL，测定OD₅₄₀。

酶活定义在温度60℃、pH6.0条件下作用，每分钟水解普鲁兰糖产生的相当于1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位。

编码普鲁兰酶基因确定：取发酵液5000r/min离心10min后得到上清酶液，加入硫酸铵至饱和度60％。14000r/min离心5min收集沉淀，用pH6.0的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，透析袋脱盐。样品加入蛋白电泳上样缓冲液煮沸5min，活性PAGE电泳，得到具有普鲁兰酶活性的蛋白条带。蛋白N端测序，结果显示N端氨基酸序列为：PGISRPFEAY。通过基因组数据得到编码该酶的基因序列，如SEQ ID NO.1所示；进一步得到编码该酶的氨基酸包括SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

重组载体构建：利用引物pulG-F:GAAGATCTATGCCGGGTATCAGCCGCCCCTTTG(SEQ IDNO.6)和pulG-R:CGGGATCCCTAAAAAATCCCTTTTGGTTCGTAT(SEQ ID NO.7)，PCR扩增pulG基因，经过限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ酶切后与同样经过酶切的质粒pCBS595连接，转化大肠杆菌。

重组枯草芽孢杆菌：构建的质粒pCBS595-pulG，转化枯草芽孢杆菌B.subtilis168，在红霉素抗性平板上得到转化子，42℃升温进行同源臂单交换，在红霉素和X-gal平板上得到单交换菌株。在37℃无抗生素的X-gal平板上得到双交换菌株。发酵验证普鲁兰酶活性。

实施例2

菌种鉴定

培养形状及形态观察：挑取少量单菌落分别在筛选培养基和鉴别培养基上划线，于37℃恒温箱中培养48h后观察结果。主要记录形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起和边缘的形状等性状特点，对菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，在显微镜下观察其形态。

结果显示：菌株T-10为革兰氏染色阳性菌，体形状为短杆状、染色均匀和具有运动性，有芽且呈卵圆形。在筛选培养基平板上的菌落为白色，凸起，缘不规则；表面皱褶，光泽，透明，体黏稠，拉丝。

生理生化鉴定：菌株T-10所做的生理生化特征鉴定试验过程参照了程丽娟等主编的《微生物学实验技术》、钱存柔等主编的《微生物学实验教程》以及朱旭芬主编的《现代微生物学实验技术》，研究菌株T-10在运动性、耐盐性、接触酶、淀粉水解、VP试验、甲基红、硝酸盐还原、碳源利用和硫化氢等方面的情况，结果见表1。

表1.解淀粉芽孢杆菌生理生化特征

测定项目	结果	测定项目	结果
				需氧情况	好氧	D-葡萄糖利用	+
甲基红试验	-	蔗糖利用	+
				VP实验	+	α-乳糖利用	-
淀粉水解	+	麦芽糖利用	-
				明胶水解	+	D-甘露糖利用	+
酪素水解	+	D-甘露醇利用	-
				酪氨酸水解	-	普鲁兰糖利用	+
接触酶试验	+	D-果糖利用	+
				吲哚试验	+	D-木糖利用	-
硫化氢试验	-	D-棉子糖利用	+
				硝酸盐还原实验	+	L-阿拉伯糖利用	-
硝化作用	-	耐盐性试验	≥7
				氧化酶	-

16S rDNA鉴定：以菌株T-10基因组DNA作为PCR扩增的模板，用上海生工生物工程有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的T-10基因组DNA。通用引物为F(5’-AGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.8))和R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)(SEQ IDNO.9)。PCR反应体系(25μl)：12.5μl Taq酶预混液；1μl引物F；1μl引物R；1μl模板DNA；9.5μlddH2O。PCR反应步骤：94℃热启动变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；30次循环；72℃延伸10min。PCR产物用胶回收试剂盒进行胶回收后送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。根据测序序列构建系统发育树，鉴定分离到的菌种，结果见图1。

实施例3

酶学性质

最适温度：在pH6.0条件下，不同温度(30、40、50、60、70、80和90℃)条件下测定普鲁兰酶的酶活力，酶活力最高者为100％对照，确定最适反应温度。

最适pH值：在最适温度条件下，酶液分别与pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的普鲁兰糖底物反应10min，定普鲁兰酶酶活力，酶活力最高者为100％对照，确定定最适pH值。

结果显示：菌株T-10所产普鲁兰酶在30℃-80℃之间均具有较高活性，60℃是酶反应的最适温度。该酶的温度稳定性较好，在60℃下保温4h后活力残留84.73％，在70℃下保温4h后活力残留77.59％，在温达到90℃保温4h后相对酶活依然超过40％。T-10所产普鲁兰酶在pH3.0-8.0在室温保存4h后相对酶活大于70％，pH6.0是酶反应的最适pH。

实施例4

活性PAGE及N端测序

按照使用说明书，安装胶架，配置12％的分离胶胶和5％的浓缩胶。

样品处理：直接取80μl的发酵上清液，加上20μl 5×buffer(加了B-巯基乙醇)，混匀。煮沸10分钟。

加样：用微量进样器取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内。

电泳：将电泳槽连接电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

染色：剥离分离胶，放于加有考马斯亮蓝R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约2小时。

脱色：取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约2小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

拍照：将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出(用前也可用酒精棉球擦干净文件夹)，放到扫描仪上，拍照。

活性测定：分别割取，检测普鲁兰酶活性，确定普鲁兰酶所在位置。

N端测序：采用Edman降解法，经过偶联、环化裂解、转化逐个降解N端的氨基酸，结合质谱技术，分析氨基酸的种类。

结果显示，普鲁兰酶N端的序列为PGISRPFEAY。根据氨基酸的序列，比较解淀粉芽孢杆菌T-10菌株的基因组数据，得到编码pulG的碱基序列。

实施例5

pulG基因克隆

以解淀粉芽孢杆菌T10的基因组为模板，通过引物pulG-F:GAAGATCTATGCCGGGTATCAGCCGCCCCTTTG(SEQ ID NO.10)和pulG-R:CGGGATCCCTAAAAAATCCCTTTTGGTTCGTAT(SEQ ID NO.11)，采用高保真pfu酶，扩增得到pulG基因，PCR反应条件如下：预变形95℃3min；变性95℃30S，退火55℃30S，延伸72℃2min，30个循环；最终延伸72℃10min。1％琼脂糖电泳验证条带大小，割胶回收目的条带。回收产物连接T载体pEASY-blunt，按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。

实施例6

表达元件及重组载体构建

通过引物hamyE-up-F:agatctATGTTTGCAAAACGATTCAAAACC(SEQ ID NO.12)和引物hamyE-up-R:ggtaccCGCCCGATCAGACCAGTTTTTAAT(SEQ ID NO.13)(小写字母为酶切位点BglⅡ和KpnⅠ)扩增淀粉酶基因(amyE)上游同源臂，PCR条件如下：预变性95℃5min。变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；30个循环。最终延伸72℃10min。产物通过PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收后，连接到T载体pEASY-blunt。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列。利用限制性内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切T载体和表达载体pCBS，通过T4DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落PCR验证连接情况，得到具有上游同源臂的载体。

按照同样的方法，通过hamyE-down-F:gaattcCAAGTGAACGATGGTAAACTG(SEQ IDNO.14)和引物hamyE-down-R:ggatccTCAATGGGGAAGAGAACCGCT(SEQ ID NO.15)(小写字母为酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ)扩增淀粉酶基因(amyE)下游同源臂，利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切T载体和表达载体pCBS，得到具有amyE基因上下游同源臂的整合载体pCBS221。

通过hP17-F:ggtaccTGCGTCCTTCTTTGTGCTTGGAAG(SEQ ID NO.16)和引物hP17-F-R:cccgggGGCTTTTGCAACTTCCCCATTCAC(SEQ ID NO.17)(小写字母为酶切位点KpnⅠ和SmaⅠ)扩增P17启动子序列、mRNA稳定序列及chiA信号肽。

将含有pulG基因T载体KpnⅠ和SmaⅠ酶切后，利用T4DNA ligase连接，连接体系如下：pulG片段2μl，P17启动子片段1μl，10×buffer 1μl，T4DNA ligase 1μl，ddH2O 5μl，混匀后16℃过夜。按照《分子克隆实验指南》的方法，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从氨苄青霉素的抗性平板上挑取单菌落测序验证碱基序列，得到含有启动子、mRNA稳定序列信号肽、和普鲁兰酶基因的表达元件。

将含有表达元件的T载体和重组载体pCBS221经KpnⅠ和EcoRⅠ酶切后，利用T4DNAligase连接，方法同上，得到重组载体pCBS221-pulG(见图2)。

以上表达元件包括能够在枯草芽孢杆菌中表达的启动子、能够稳定RNA的稳定序列、能在枯草芽孢杆菌中分泌蛋白的信号肽、权利要求4所述的核苷酸序列以及能够终止转录反应的终止子，其中启动子也可以为解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶Q的启动子PamyQ，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，稳定序列可以为苏云金芽孢杆菌晶体蛋白cry3A，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，信号肽可以为地衣芽孢杆菌的几丁质酶chiA的N端信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例7

枯草芽孢杆菌感受态

从平板上挑选长势良好的单菌落接种到新鲜的LB培养基中，37℃，220转/分钟，培养过夜。按照2％的接种量接种到新鲜的LB培养基中，，37℃，220转/分钟，继续培养4小时。5000rpm离心10min，收集菌体，利用洗涤缓冲液(5.8％蔗糖)洗涤3次，利用发酵液体积2％的电转化缓冲液(5.8％蔗糖，15％甘油，20％PEG6000)悬浮后分装，-70℃保存。

重组枯草芽孢杆菌筛选

质粒Pcbs595-pulG转化枯草芽孢杆菌，条件如下：质粒浓度2μg/ml，电击电压2500V，电击时间5ms。电击后孵育3小时，涂红霉素抗性平板，37℃培养24小时，得到含有重组质粒的枯草芽孢杆菌。42℃处理24小时，中间转接1次，发生同源臂的单交换，通过红霉素抗性和X-gal显色反应得到同源臂单交换菌株。在37℃的无抗生素培养基中处理24小时，中间转接1次，通过无抗生素平板和X-gal显色反应得到双交换菌株。

普鲁兰酶发酵

随机挑取平板上的单菌落，按照以下方法发酵验证：

种子培养基(/L)：麦芽糖浆10g，葡萄糖10g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾10g，硫酸锰0.03g，硫酸镁0.1g，调节pH至7.0±0.2。

发酵培养基(/L)：蔗糖100g，葡萄糖20g，大豆粉20g，硫酸铵3g，磷酸氢二钠10g，硫酸锰0.03g，硫酸镁0.1g，调节pH至7.0±0.2。

培养方法：从每种表达宿主的平板上挑取7个单菌落，接种到种子培养基(装液量50ml,250ml挡板三角瓶)，37℃，220转/分钟，培养过夜(12小时)。按照2％的接种量，接种到发酵培养基(装液量30ml,250ml挡板三角瓶)，37℃，220转/分钟，培养36小时。离心测上清普鲁兰酶活，结果见表2。中温普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌BS001中表达的酶活最高，达到110U/ml左右。

表2.重组枯草芽孢杆菌发酵酶活

序列表

<110> 南京福斯弗瑞生物科技有限公司

南京农业大学

<120> 一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2133

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

atgccgggta tcagccgccc ctttgaagct tatctcgatg aaatgagaac gatcactgtt 60

ttagttccga agagccgcgc gtcaagctgc agcccccctt ttctgcttga agatgatcaa 120

ggagggaaga tagagctttc ggtaaaagcg acggaggagc ttgaggagaa attcaagtat 180

gttctcgaaa gcagccgccc cgttccattc ggaagagttc ataaagtatg ctgtgaagaa 240

agcgtctgga cagacctgca aattggttct gttacgcgaa gtgcggcgtt tgacaaggct 300

tttttttatg acggccgtct cggtgctttt tattcaaaag agcgtacttt atttaaggta 360

tgggcgccga ccgcgagtac ggcagcgatc aagctggaga gccctgattc gcttcaaaca 420

aatacttttc aaatgatgcg cagagaaaag ggtgtttttg aggtaacggt cgaaggcgat 480

ctgaacggct ggtcctattt atataagctt tatgtaaacg ggacgccgtt attgacagtc 540

gatccttatg cgaaagctgt tacggtaaac ggggaaaagg gcgttgtaat agatcctgag 600

gaagtcaaag tgaaaaaata ccgtgcgcca agccttcaca gtccgtgtga tgcgattata 660

tatgaggttc acatccgcga tttttcgatt catgaagaca gcggtatgcg ccataaaggc 720

aaatatcttg cttttacaga ggacggaact gaaacgtccg gcggcttctc aacgggaatt 780

gcctatttga aagagctcgg cgttacccat atcgaggttc tgccctttca cgattttgcc 840

ggagttgacg agctgtctcc ggaccaatcc tataattggg gctataaccc ccttcatttt 900

aatgcgcctg aaggaagcta ttcgctcgat ccgcagaacc ccaaaagcag aatcaccgag 960

ctgaaaacga tgattcagac gctgcacaaa cacggcttct ccgtgatcat ggatgccgta 1020

tataatcatg tgtacaagag ggaaacatcc ccttttgaaa aaacggttcc cgggtatttt 1080

ttcagacata atgaatacgg ttttccagcc gacggaacag gcgtcggaaa tgacattgca 1140

tctgagcggc tgatggtgcg aaaatatatt ctcgattctg tccgctattg gcttgaagaa 1200

tatgatgtcg atggaattcg ttttgattta atgggcattc ttgatattga aaccgtccgc 1260

caaattagta agcttgccga gaatgtgaag ccggacgcgc tcctgttcgg agaaggctgg 1320

gatttaaata ccccgcttga aagcgggcaa aaagcaacat tgcaaaatgc cgggaaagtt 1380

ccggcggtcg gtttttttaa tgatcggttc agaaacgcag tcaaagggag tacatttgag 1440

ctcggtgacc gcggatatgc tttaggggac actggaaaaa aagctgagct tcaacatgga 1500

attgccggct caccgggatt cttgctgccg ccacagtcaa tcaattatgc ggagtgccat 1560

gacaatcata cgttttggga taagatggcc ttctgttcgg aagaagatgc ctgcacaaaa 1620

cggctcagac aaaggctcgc gctgtcgatc gtcctgcttt cgcaaggcgt tccatttctt 1680

catgccgggc aggaattttg ccgaacaaag aatggggaca gcaacagcta caggtcggga 1740

gatggcatca acaggctcga ttgggaaaag cgggcggagc tttgcgagga cgtcgaatat 1800

gtgcgccagc tgatcaggct gcggagaagc catcccgctt ttcgtctgca aaaagaggag 1860

gaagtcaagg aacatctttc ttttatgagc ggtacaggag aagtgacggc ctacaagctg 1920

aagaacattg cagcatttga tccctggaac gaaatcatag tggtgcattg tccgtctgca 1980

aaaaaggaaa cgcttgagct gcccgcccag aaacagtact tgctgcactg cgatcctttt 2040

acgttcttca atgggaaggt tcaagcggaa aaaaggcttc ggctgaacgg catcggaacc 2100

tatgttctat acgaaccaaa agggattttt tag 2133

<210> 2

<211> 710

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 2

Met Pro Gly Ile Ser Ala Pro Pro Gly Ala Thr Leu Ala Gly Met Ala

1 5 10 15

Thr Ile Thr Val Leu Val Pro Leu Ser Ala Ala Ser Ser Cys Ser Pro

20 25 30

Pro Pro Leu Leu Gly Ala Ala Gly Gly Gly Leu Ile Gly Leu Ser Val

35 40 45

Leu Ala Thr Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Leu Thr Val Leu Gly Ser

50 55 60

Ser Ala Pro Val Pro Pro Gly Ala Val His Leu Val Cys Cys Gly Gly

65 70 75 80

Ser Val Thr Thr Ala Leu Gly Ile Gly Ser Val Thr Ala Ser Ala Ala

85 90 95

Pro Ala Leu Ala Pro Pro Thr Ala Gly Ala Leu Gly Ala Pro Thr Ser

100 105 110

Leu Gly Ala Thr Leu Pro Leu Val Thr Ala Pro Thr Ala Ser Thr Ala

115 120 125

Ala Ile Leu Leu Gly Ser Pro Ala Ser Leu Gly Thr Ala Thr Pro Gly

130 135 140

Met Met Ala Ala Gly Leu Gly Val Pro Gly Val Thr Val Gly Gly Ala

145 150 155 160

Leu Ala Gly Thr Ser Thr Leu Thr Leu Leu Thr Val Ala Gly Thr Pro

165 170 175

Leu Leu Thr Val Ala Pro Thr Ala Leu Ala Val Thr Val Ala Gly Gly

180 185 190

Leu Gly Val Val Ile Ala Pro Gly Gly Val Leu Val Leu Leu Thr Ala

195 200 205

Ala Pro Ser Leu His Ser Pro Cys Ala Ala Ile Ile Thr Gly Val His

210 215 220

Ile Ala Ala Pro Ser Ile His Gly Ala Ser Gly Met Ala His Leu Gly

225 230 235 240

Leu Thr Leu Ala Pro Thr Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ser Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Thr Gly Ile Ala Thr Leu Leu Gly Leu Gly Val Thr His Ile Gly

260 265 270

Val Leu Pro Pro His Ala Pro Ala Gly Val Ala Gly Leu Ser Pro Ala

275 280 285

Gly Ser Thr Ala Thr Gly Thr Ala Pro Leu His Pro Ala Ala Pro Gly

290 295 300

Gly Ser Thr Ser Leu Ala Pro Gly Ala Pro Leu Ser Ala Ile Thr Gly

305 310 315 320

Leu Leu Thr Met Ile Gly Thr Leu His Leu His Gly Pro Ser Val Ile

325 330 335

Met Ala Ala Val Thr Ala His Val Thr Leu Ala Gly Thr Ser Pro Pro

340 345 350

Gly Leu Thr Val Pro Gly Thr Pro Pro Ala His Ala Gly Thr Gly Pro

355 360 365

Pro Ala Ala Gly Thr Gly Val Gly Ala Ala Ile Ala Ser Gly Ala Leu

370 375 380

Met Val Ala Leu Thr Ile Leu Ala Ser Val Ala Thr Thr Leu Gly Gly

385 390 395 400

Thr Ala Val Ala Gly Ile Ala Pro Ala Leu Met Gly Ile Leu Ala Ile

405 410 415

Gly Thr Val Ala Gly Ile Ser Leu Leu Ala Gly Ala Val Leu Pro Ala

420 425 430

Ala Leu Leu Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Ala Thr Pro Leu Gly Ser

435 440 445

Gly Gly Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Ala Val Gly

450 455 460

Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Val Leu Gly Ser Thr Pro Gly

465 470 475 480

Leu Gly Ala Ala Gly Thr Ala Leu Gly Ala Thr Gly Leu Leu Ala Gly

485 490 495

Leu Gly His Gly Ile Ala Gly Ser Pro Gly Pro Leu Leu Pro Pro Gly

500 505 510

Ser Ile Ala Thr Ala Gly Cys His Ala Ala His Thr Pro Thr Ala Leu

515 520 525

Met Ala Pro Cys Ser Gly Gly Ala Ala Cys Thr Leu Ala Leu Ala Gly

530 535 540

Ala Leu Ala Leu Ser Ile Val Leu Leu Ser Gly Gly Val Pro Pro Leu

545 550 555 560

His Ala Gly Gly Gly Pro Cys Ala Thr Leu Ala Gly Ala Ser Ala Ser

565 570 575

Thr Ala Ser Gly Ala Gly Ile Ala Ala Leu Ala Thr Gly Leu Ala Ala

580 585 590

Gly Leu Cys Gly Ala Val Gly Thr Val Ala Gly Leu Ile Ala Leu Ala

595 600 605

Ala Ser His Pro Ala Pro Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Val Leu Gly

610 615 620

His Leu Ser Pro Met Ser Gly Thr Gly Gly Val Thr Ala Thr Leu Leu

625 630 635 640

Leu Ala Ile Ala Ala Pro Ala Pro Thr Ala Gly Ile Ile Val Val His

645 650 655

Cys Pro Ser Ala Leu Leu Gly Thr Leu Gly Leu Pro Ala Gly Leu Gly

660 665 670

Thr Leu Leu His Cys Ala Pro Pro Thr Pro Pro Ala Gly Leu Val Gly

675 680 685

Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ile Gly Thr Thr Val Leu Thr

690 695 700

Gly Pro Leu Gly Ile Pro

705 710

<210> 3

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttttatgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaaaagga ataaaggggg gttgacatta 60

ttttactgat atgtataata taatttgtat aagaaaatgg agctctcgaa acgtaagatg 120

aaaccttaga taaaagtgct ttttttgttg caattgaaga attattaatg ttaagcttaa 180

ttaaagataa tatctttgaa ttgtaacgcc cctcaaaagt aagaactaca aaaaaagaat 240

acgttatata gaaatatgtt tgaaccttct tcagattaca aatatattcg gacggactct 300

acctcaaatg cttatctaac tatagaatga catacaagca caaccttgaa aatttgaaaa 360

tataactacc aatgaacttg ttcatgtgaa ttatcgcttt atttaatttt ctcaattcaa 420

tatataatat gccaatacat tgttacaagt agaaattaag acacccttga tagccttact 480

atacctaaca tgatgtagta ttaaatgaat atgtaaatat atttatgata agaagcgact 540

tatttataat cattacatat ttttctattg gaatgattaa gattccaata gaatagtgta 600

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttgatca acaaaagcaa aaagtttttc gttttttctt tcatttttgt tatgatgctg 60

agcctctcat ttgtgaatgg ggaagttgca aaagcc 96

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agggatgcct aaaaacgaag aacattaaaa acatatattt gcaccgtcta atggatttat 60

gaaaaatcat tttatcagtt tgaaaattat gtattatgaa aagtg 105

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaagatctat gccgggtatc agccgcccct ttg 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggatccct aaaaaatccc ttttggttcg tat 33

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agagagtttg atcctggctc ag 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctacggctac cttgttacga 20

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaagatctat gccgggtatc agccgcccct tt 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggatccct aaaaaatccc ttttggttcg tat 33

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agatctatgt ttgcaaaacg attcaaaacc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtacccgcc cgatcagacc agtttttaat 30

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaattccaag tgaacgatgg taaactg 27

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggatcctcaa tggggaagag aaccgct 27

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtacctgcg tccttctttg tgcttggaag 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccgggggct tttgcaactt ccccattcac 30

Claims

1.一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No. 14445。

2.根据权利要求1所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其最适温度为60℃，最适pH为6.0，在30-80℃，pH3.0-8.0之间能保持较高活性。

3.一种普鲁兰酶，其特征在于，由权利要求1所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵得到。

4.根据权利要求3所述的普鲁兰酶，其特征在于，编码该酶的基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的普鲁兰酶，其特征在于，编码该酶的氨基酸包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

6.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求4所述的核苷酸序列和原始载体，具体为将权利要求4所述的核苷酸序列插入原始载体得到。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体为pCBS或温敏型重组载体pCBS221。

8.权利要求7所述的重组载体的构建方法，其特征在于，通过引物扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，扩增产物经限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ酶切后与同样经过酶切的质粒pCBS221或pCBS连接，得到重组载体。

9.一种重组菌株，其特征在于，将权利要求6所述的重组载体整合到表达菌株中得到。

10.根据权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述表达菌株为枯草芽孢杆菌。

11.根据权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述表达菌株为枯草芽孢杆菌B. subtilis 168、枯草芽孢杆菌衍生菌株BS001、枯草芽孢杆菌WB600或枯草芽孢杆菌WB800中的任意一种，其中枯草芽孢杆菌衍生菌株BS001包括aprE-、nprE-、或amyE-三种类型。

12.一种普鲁兰酶表达元件，其特征在于，包括能够在枯草芽孢杆菌中表达的启动子、能够稳定RNA的稳定序列、能在枯草芽孢杆菌中分泌蛋白的信号肽、权利要求4所述的核苷酸序列以及能够终止转录反应的终止子。

13.根据权利要求12所述的普鲁兰酶表达元件，其特征在于，所述启动子为解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶Q的启动子PamyQ，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

14.根据权利要求12所述的普鲁兰酶表达元件，其特征在于，所述稳定序列为苏云金芽孢杆菌晶体蛋白cry3A，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

15.根据权利要求12所述的普鲁兰酶表达元件，其特征在于，所述信号肽为地衣芽孢杆菌的几丁质酶chiA的N端信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

16.一种权利要求1所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的发酵培养基，其特征在于，该发酵培养基包括以下组分：蔗糖100g，葡萄糖20g，大豆粉20g，硫酸铵3g，磷酸氢二钠10g，硫酸锰0.03g或硫酸镁0.1g，其中培养基调节pH至7.0±0.2。

17.一种权利要求1所述的产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌发酵制备普鲁兰酶的发酵培养方法，其特征在于，将产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌单菌落接种到种子培养基，37℃，220转/分钟，培养过夜，然后按照2%的接种量，接种到权利要求16所述的发酵培养基中，37℃，220转/分钟，培养48小时，离心得上清液中普鲁兰酶。