CN109988776A - 一株解淀粉芽胞杆菌生防功能基因序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株解淀粉芽胞杆菌Bs‑18的生防功能基因序列。野生生防菌株解淀粉芽胞杆菌Bs‑18防治黄瓜白粉病菌大田防治效果达79.2%，通过构建Bs‑18的突变体文库，从突变体库中筛选到一株生防功能发生明显变化的突变体T4‑7，反向PCR方法获得其插入基因片段的序列。为了验证此基因片段与生防作用相关，通过电击转化的方法获得了基因恢复株，大田防治试验结果表明基因恢复株的生防效果高于T4‑7菌株，但又略低于野生生防菌株Bs‑18。由此说明此基因片段与生防菌株Bs‑18的生防作用相关，可以达到防治黄瓜白粉病菌的目的。
Description
技术领域
本发明属于生防控制技术领域，涉及一株解淀粉芽胞杆菌菌株Bs-18的生防功能相关的基因，具体内容涉及一株优良的解淀粉芽胞杆菌菌株Bs-18的生防功能基因序列。
背景技术
随着许多微生物基因组全序列的获得，人们对微生物关注和研究的热点逐渐从结构基因组学转移到功能基因组学上。转座子随机突变技术因操作简单逐渐成为研究功能基因组（如发现新基因、克隆功能基因、发掘已知基因的新功能）的一种有效工具。目前利用转座子随机突变技术获得了枯草芽胞杆菌与芽孢形成、生物被膜形成以及植物与微生物互作等相关的基因。可见转座子突变技术已成为发现功能基因的一种有效手段。穿梭质粒载体pMarA 上携带转座子 TnYLB-1，它具有转座频率高、插入稳定、随机插入、非寄主专化性等优点，已成为人们研究细菌基因功能的首选转座子。
解淀粉芽胞杆菌具有抗菌谱广，对人畜无毒，不污染环境，抗逆能力强，稳定性好等优点，作为生防菌株应用于农业生产，在农作物病害的生物防治方面发挥着重要的作用。本实验室从黄瓜根际土壤中分离到一株解淀粉芽胞杆菌Bs-18，对黄瓜白粉病的大田防效达79.2%，从分子水平揭示生防菌株发挥生防作用的机制，获得生防作用相关的基因序列，将为生防菌株的改造、新基因的发掘及有效使用提供理论基础。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一株解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能基因序列，如SEQ ID NO.1所示，其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明进一步公开了用于解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能基因序列构建的特异性引物，其特征在于：
T4-7 Fwd GGCGGATCCGTCCGTTTCATAAGTTGACAAGACG SEQ ID NO.3；
T4-7Rev GCCGAATTCCAAAGGAAGTGGCAGCGAATG SEQ ID NO.4。
本发明更进一步公开了一株用于构建解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能突变体，菌株命名为T4-7，其特征在于该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为：CGMCC No.17316；保藏时间为：2019年3月8日。所述的突变株T4-7为解淀粉芽孢杆菌Bs-18被TnYLB-1转座子随机插入的突变株。
突变株T4-7由天津市植物保护研究所植物病害生物防治研究室筛选得到，T4-7被中国科学院微生物研究所鉴定为一株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为：CGMCC No.17316；保藏时间为：2019年3月8日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
解淀粉芽胞杆菌突变株（Bacillus amyloliquefaciens）命名为T4-7的生理生化特性如下：菌株T4-7为从土壤中分离出的野生解淀粉芽胞杆菌菌株Bs-18被转座子TnYLB-1随机插入的突变体菌株，为革兰氏阳性芽胞杆菌，具有解淀粉能力。菌株在LB培养基上菌落半透明状，在干燥情况下菌落有褶皱，边缘界限明显。生长温度30℃—36℃生长良好。
本发明同时也公开了一种采用所述的用于构建解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能突变体T4-7插入基因序列获得及其恢复株的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）突变体T4-7插入基因的测序：通过反向PCR法获得T4-7被转座子TnYLB-1随机插入的插入片段序列；
（2）插入基因的PMK4穿梭质粒表达载体的构建：应用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切T4-7的插入基因全序列和质粒PMK4，再将酶切片段连接构建重组载体；将构建的重组载体转化大肠杆菌，挑取正确的转化子进行测序，所测序列与插入基因序列、质粒PMK4进行BLAST比对分析，同源性100%说明构建的穿梭质粒表达载体构建成功；
（3）突变体插入基因功能的恢复：将构建的重组表达载体电击转化突变体T4-7；
（4）大田防治试验验证此基因的生防功能：通过防治黄瓜白粉病试验，结果表明突变体恢复株的生防效果高于突变株T4-7。
本发明同时也公开了解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能基因序列在防治黄瓜白粉病方面的应用。实验结果显示突变株T4-7的生防效果明显较野生生防菌株降低，而基因恢复株的生防效果高于其突变株，但稍低于野生生防菌株，由此说明基因恢复株参与了野生菌株发挥生防作用的某一环节，但是并不是野生生防菌株发挥生防作用的唯一因子。
本发明更加详细的描述如下：
生防解淀粉芽胞杆菌Bs-18由天津市植物保护研究所粮经病害研究室从黄瓜根际土壤中筛选得到，本研究室应用电击法构建了携带转座子TnYLB-1的穿梭质粒pMarA转化Bs-18的突变体文库，并通过室内平板筛选法筛选到了抑菌作用发生明显变化的突变体菌株T4-7。
下面事例以T4-7为研究对象，探索其发生生防作用的相关基因。基因的序列如SEQID NO.1所示。
本发明公开的解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防相关基因的序列为：
ATGGCTAAAGGCGGGCTCGGAAAAGGGATTAACGCGTTGTTTAATCAGGTTGATTTGTCTGAAGAGACAGTGGAAGAGATTAAAATCAGTGATTTGCGCCCCAATCCTTATCAGCCAAGAAAACAATTTGACGATGAGTCATTAGCTGAACTGAAGGAATCTATCATTCAGCATGGCATTCTTCAGCCCATTATCGTGAGAAAATCATTGAAGGGCTATGATATTGTAGCCGGCGAACGCCGTTACCGCGCCGCAAAACTTGCCGGTAAAGAGACAGTGCCGGCTATCGTGCGGGATTTATCTGAATCGCTGATGCGAGAAATCGCTCTTTTGGAAAACCTTCAGCGTGAAGACTTATCACCGCTTGAAGAAGCTCTGGCATATGACTCACTGCTGAAGCATTTGGATTTAACCCAGGAACAGCTCGCTAAACGGCTCGGAAAAAGCAGGCCTCATATTGCCAACCATTTAAGACTGCTGACGCTGCCGGAAAGCATCCAGAACCTCATTGCAGAAGGTACGTTATCCATGGGACACGGCAGAACCTTGCTTGGTTTGAAAAATAAAGACAAGCTTGAGCCGCTTGTGAAGAAAGTGGTTGAAGAACAGCTGAACGTCCGTCAGCTTGAGCAGCTGATTCAGCAGTTAAACAACAATGTTCCACGTGAAACAAAGAAAAAAGAACCTGTTCAAGATGTTGTGTTAAAAGAGCGGGAATCGTATTTGCAAAATTACTTCGGAACAACAGTAAATATTAAGAGACAAAAGAAAAAAGGGAAGATTGAGATTGAGTTTTTCTCAAATGAAGATCTTGAACGCATCCTAGAACTATTGTCTGAAAGAGAAGCGTAA
其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MAKGGLGKGINALFNQVDLSEETVEEIKISDLRPNPYQPRKQFD DESLAELKESIIQHGILQPIIVRKSLKGYDIVAGERRYRAAKLAGKETVPAIVRDLSESLMREIALLENLQREDLSPLEEALAYDSLLKHLDLTQEQLAKRLGKSRPHIANHLRLLTLPESIQNLIAEGTLSMGHGRTLLGLKNKNKLEPLVKKVVEEQLNVRQLEQLIQQLNN NVPRETKKKEPVQDVVLKERESYLQNYFGTTVNIKRQKKKGKIEIEFFSNEDLERILELLSEREA。
本发明主要解决了野生解淀粉芽胞杆菌Bs-18发挥生防作用的某一分子方面的机理，属于分子机制研究范畴。重点考察了野生菌株Bs-18被转座子TnYLB-1随机插入后的一个插入片段，主要的难点在于此插入片段恢复株的构建。
本发明公开的一株解淀粉芽胞杆菌生防功能基因序列与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）生防菌株生防作用机制的研究是生防菌研究的基础，是研究核心领域。
（2）分子机理研究能为今后合理使用生防菌提供理论依据。
（3）生防功能基因的研究为合理改造菌株（制备工程菌株）提供理论依据。
附图说明
图1：突变体基因组酶切凝胶图；其中1：TaqⅠ65℃酶切3 h；2:DNAMarker2000；
图2：pcr扩增突变体T4-7的插入片段；其中1、2：突变体T4-7的插入片段；
3：DNAMarker2000；
图3：突变体T4-7与PMK4的双酶切；左图：1、2、3孔道：突变体T4-7与T载体连接后的双酶切；4孔道：1kb的Marker；右图1 2 3孔道：质粒PMK4双酶切；4孔道：1kb的Marker；
图4：重组载体的双酶切验证；其中1：1kbMarker 2、3:突变体与PMK4重组载体双酶切4:突变体与T载体的重组载体双酶切(CK)；
图5：黄瓜白粉病的防治效果图；其中左图为Wt防治；中间为突变株防治；右图为基因恢复株防治。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。本发明所用试剂均由市售。
实施例1
生防功能相关基因的初步鉴定
（1）采用DNA提取试剂盒对筛选的突变体T4-7进行基因组DNA的提取；
（2）突变体T4-7基因组DNA完全酶切：采用限制性内切酶TaqⅠ在65℃条件下酶切3 h。可将基因组DNA切割完全，呈弥散状条带。酶切体系为20 μL：内切酶1μL，10×buffer 2 μL，0.1%BSA 2μL，DNA 1 μL，ddH2O 14 μL。酶切产物利用PCR纯化试剂盒进行回收纯化（图1）。
（3）酶切产物分子内自连：连接体系为300 μL：10×T4 DNA buffer 30 μL，T4 DNALigase 2 μL，酶切产物50 μL，ddH2O 218 μL。在16℃条件下进行过夜连接反应。反应产物利用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。
（5）反向PCR]扩增：反应体系为20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，oIPCR1 0.5 μL，oIPCR2 0.5 μL，DNA 5 μL，ddH2O 4 μL。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 2 min，35 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever。对PCR产物进行纯化回收。
通过反向PCR法，扩增出突变体T4-7被转座子TnYLB随机插入位点的侧翼序列（图2）。
（6）反向PCR扩增产物与T载体连接，转化大肠杆菌。反应体系为10×Enhancer 1 μL，pTopo-Vecter 1 μL，纯化的PCR产物5 μL，distilled water 3 μL。室温连接5 min，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的抗性平板，过夜培养，第二天挑取阳性克隆子。经菌落PCR验证为阳性的克隆子送检测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析。
比对结果表明，突变体T4-7被随机插入的片段编码产物为“染色体分配蛋白ParB”，基因前端为染色体分配蛋白ParA, ParA是一个ATP酶，具有ATP酶活性，ParA和ParB这两种蛋白相互结合，即可调节操纵子表达。此基因片段包含一个SpoOJ基因，在枯草芽孢杆菌中，spo0J是正常染色体分离和产生孢子所必需的，SpoOJ基因的突变，使菌株在营养生长中产生大量的无核细胞，由此可能造成生防菌株的生防效果丧失或减弱。
表1 本研究所用引物
实施例2
插入基因的PMK4穿梭质粒表达载体的构建
（1）PCR扩增插入片段的全基因序列
根据反向PCR扩增测序的插入片段序列，设计引物扩增全基因序列，并分别在上游和下游加上BamH1和EcoR1的酶切位点（质粒PMK4带有这两个酶切位点）。20μL PCR反应体系为：2×TaqPCR Mix 10μL ；引物各1ul；DNA 3μL ；水 5μL 。 PCR扩增程序：94℃，4min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，30cycles；72℃，5min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并进行纯化。
表2引物的设计
（2） 插入基因与T载体连接，转化大肠杆菌
10μL 连接体系为：PCR纯化产物 0.5-8μL ；pTOPO-TA 1μL ；10×Eenhancer 1μL ；补足灭菌蒸馏水10μL 。以上体系进行5min的连接反应。
40μL 感受态细胞加入5μL 连接产物，轻轻混匀，室温放置5min，加入300μL LB液体培养基，37℃，180rpm震荡培养10min，取200ul均匀涂在含氨苄青霉素(50μg/ml)的抗性LB平板上，37℃过夜培养。
第二天早上，挑取单克隆，至加有氨苄青霉素的抗性LB液体培养基中，培养成菌液，进行菌落PCR验证。验证体系为2×TaqPCR Mix 10μL ；引物 各1μL ；菌液 1μL ；水7μL 。PCR扩增程序：94℃，4min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，30cycles；72℃，5min。凝胶电泳检测正确的转化子扩增出900bp左右的条带，将正确的转化子送检测序。
（3）正确的转化子抽提质粒：使用质粒提取试剂盒对正确的转化子进行质粒的提取。
（4）质粒PMK4和带有插入片段的质粒分别双酶切
用BamHⅠ和EcoRⅠ分别对带有插入片段的质粒和PMK4质粒进行双酶切。20μL 酶切体系为：buffer 2μL ；BamHⅠ 0.5μL ；EcoRⅠ 0.5μL ；质粒 10μL ；蒸馏水7μL ，37℃酶切反应15min。
酶切产物凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行回收纯化。（按说明书进行）
质粒PMK4酶切后成直线型DNA，大小为5585bp，带有插入片段的质粒双酶切后成约850bp的插入片段和1865bp的T载体片段(图3)。
（5）酶切片段进行连接：利用T4DNA Ligase将插入基因片段连接到PMK4载体上，构建重组载体。连接体系为20μL ：T4DNA Ligase 1μL ；10×T4DNA Ligase buffer 2.5μL ；PMK4 5μL ；插入片段11.5μL 。16℃，过夜连接。
重组载体转化大肠杆菌，第二天挑取阳性转化子，PCR菌落验证。将验证正确的转化子送检测序。
实施例3
基因恢复株的获得
（1）重组载体电击转化突变体T4-7
挑取单菌落突变体T4-7接种于5 mL试管中，37℃、160 r/min摇床过夜培养。将培养液按1%接种量接种于20 mL LB液体培养基中摇床培养至OD600为0.65左右。将培养好的菌液冰浴20 min。4℃、8 000 r/min离心2 min，收集菌体。加入10 mL预冷的 ddH2O清洗菌体细胞3次。再加入ddH2O重悬菌体，制得感受态细胞。在100 μL感受态细胞中加入1 μL重组载体质粒，均匀混合，将混合物移至预冷的电击杯中，以1.1 kv电压，电穿孔仪BIO-RAD进行脉冲电击（电阻200Ω，电容25 μF）,电击后迅速加入400 μL复苏培养基中，37℃温浴60 min，涂布含氨苄青霉素（50 μg/mL）的抗性平板，37℃培养过夜，第二天挑取平板上的转化子。
(2) 转化子的验证
使用质粒抽提试剂盒对转化子进行质粒的抽提。
双酶切验证： 20ul酶切体系为：buffer 2μL ；BamHⅠ 0.5μL ；EcoRⅠ 0.5μL ；质粒10μL ；蒸馏水7μL ，37℃酶切反应15min。
凝胶电泳检测：转化子被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切成插入片段约800bp的片段和5585bp大小的PMK4直线DNA。
实施例4
黄瓜白粉病防治试验
将野生菌株Bs-18、突变体T4-7、基因恢复株的LB液体发酵100×稀释液同时喷雾黄瓜白粉病发生初期的叶片上，喷施一周后调查结果。防效结果表明，野生菌株Bs-18的防效为72.43%，突变体T4-7的防效为30.96%，基因恢复株的防效为60.3%。试验结果表明，突变体T4-7由于被TnYLB-1转座子随机插入，导致其生防功能发生了变化。基因恢复株的生防效果高于突变体T4-7而又稍低于野生菌株，研究结果表明突变体T4-7被随机插入的基因参与了生防的某一过程或是影响了其他生防功能基因发挥作用或是影响了发挥生防作用的相关能量信息传递途径，从而影响了整个生防菌株的生防效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市植物保护研究所
<120> 一株解淀粉芽胞杆菌生防功能基因序列及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctaaag gcgggctcgg aaaagggatt aacgcgttgt ttaatcaggt tgatttgtct 60
gaagagacag tggaagagat taaaatcagt gatttgcgcc ccaatcctta tcagccaaga 120
aaacaatttg acgatgagtc attagctgaa ctgaaggaat ctatcattca gcatggcatt 180
cttcagccca ttatcgtgag aaaatcattg aagggctatg atattgtagc cggcgaacgc 240
cgttaccgcg ccgcaaaact tgccggtaaa gagacagtgc cggctatcgt gcgggattta 300
tctgaatcgc tgatgcgaga aatcgctctt ttggaaaacc ttcagcgtga agacttatca 360
ccgcttgaag aagctctggc atatgactca ctgctgaagc atttggattt aacccaggaa 420
cagctcgcta aacggctcgg aaaaagcagg cctcatattg ccaaccattt aagactgctg 480
acgctgccgg aaagcatcca gaacctcatt gcagaaggta cgttatccat gggacacggc 540
agaaccttgc ttggtttgaa aaataaagac aagcttgagc cgcttgtgaa gaaagtggtt 600
gaagaacagc tgaacgtccg tcagcttgag cagctgattc agcagttaaa caacaatgtt 660
ccacgtgaaa caaagaaaaa agaacctgtt caagatgttg tgttaaaaga gcgggaatcg 720
tatttgcaaa attacttcgg aacaacagta aatattaaga gacaaaagaa aaaagggaag 780
attgagattg agtttttctc aaatgaagat cttgaacgca tcctagaact attgtctgaa 840
agagaagcgt aa 852
<210> 2
<211> 283
<212> PRT
<213> 解淀粉芽胞杆菌
<400> 2
Met Ala Lys Gly Gly Leu Gly Lys Gly Ile Asn Ala Leu Phe Asn Gln
1 5 10 15
Val Asp Leu Ser Glu Glu Thr Val Glu Glu Ile Lys Ile Ser Asp Leu
20 25 30
Arg Pro Asn Pro Tyr Gln Pro Arg Lys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Leu
35 40 45
Ala Glu Leu Lys Glu Ser Ile Ile Gln His Gly Ile Leu Gln Pro Ile
50 55 60
Ile Val Arg Lys Ser Leu Lys Gly Tyr Asp Ile Val Ala Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Tyr Arg Ala Ala Lys Leu Ala Gly Lys Glu Thr Val Pro Ala Ile
85 90 95
Val Arg Asp Leu Ser Glu Ser Leu Met Arg Glu Ile Ala Leu Leu Glu
100 105 110
Asn Leu Gln Arg Glu Asp Leu Ser Pro Leu Glu Glu Ala Leu Ala Tyr
115 120 125
Asp Ser Leu Leu Lys His Leu Asp Leu Thr Gln Glu Gln Leu Ala Lys
130 135 140
Arg Leu Gly Lys Ser Arg Pro His Ile Ala Asn His Leu Arg Leu Leu
145 150 155 160
Thr Leu Pro Glu Ser Ile Gln Asn Leu Ile Ala Glu Gly Thr Leu Ser
165 170 175
Met Gly His Gly Arg Thr Leu Leu Gly Leu Lys Asn Lys Asn Lys Leu
180 185 190
Glu Pro Leu Val Lys Lys Val Val Glu Glu Gln Leu Asn Val Arg Gln
195 200 205
Leu Glu Gln Leu Ile Gln Gln Leu Asn Asn Asn Val Pro Arg Glu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Glu Pro Val Gln Asp Val Val Leu Lys Glu Arg Glu Ser
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Asn Tyr Phe Gly Thr Thr Val Asn Ile Lys Arg Gln Lys
245 250 255
Lys Lys Gly Lys Ile Glu Ile Glu Phe Phe Ser Asn Glu Asp Leu Glu
260 265 270
Arg Ile Leu Glu Leu Leu Ser Glu Arg Glu Ala
275 280
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcggatccg tccgtttcat aagttgacaa gacg 34
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccgaattcc aaaggaagtg gcagcgaatg 30
Claims (6)
1.一株解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能基因序列，如SEQ ID NO.1所示，其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能基因序列构建的特异性引物，其特征在于：
T4-7 Fwd GGCGGATCCGTCCGTTTCATAAGTTGACAAGACG SEQ ID NO.3；
T4-7Rev GCCGAATTCCAAAGGAAGTGGCAGCGAATG SEQ ID NO.4。
3.一株用于构建解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能突变体，菌株命名为T4-7，其特征在于该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为：CGMCCNo.17316；保藏时间为：2019年3月8日。
4.一种采用权利要求3所述的用于构建解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能突变体T4-7进行构建的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）突变体T4-7插入基因的测序：通过反向PCR法获得T4-7被转座子TnYLB-1随机插入的插入片段序列；
（2）插入基因的PMK4穿梭质粒表达载体的构建：应用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切T4-7的插入基因全序列和质粒PMK4，再将酶切片段连接构建重组载体；将构建的重组载体转化大肠杆菌，挑取正确的转化子进行测序，所测序列与插入基因序列、质粒PMK4进行BLAST比对分析，同源性100%说明构建的穿梭质粒表达载体构建成功；
（3）突变体插入基因功能的恢复：将构建的重组表达载体电击转化突变体T4-7；
（4）大田防治试验验证此基因的生防功能：通过防治黄瓜白粉病试验，结果表明突变体恢复株的生防效果高于突变株T4-7。
5.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌Bs-18的生防功能基因序列在防治黄瓜白粉病方面的应用。
6.权利要求3所述的突变株T4-7为解淀粉芽孢杆菌Bs-18被TnYLB-1转座子随机插入的突变株。
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