CN109022474A - 通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS‑LPSpo0AR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组Spo0A基因的方法构建了一个高产bacillomycin D菌株fmbJspo0A。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产bacillomycin D的能力提高1.82倍。

Description

通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的 方法
一、技术领域
本发明涉及通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。
二、背景技术
作为促进植物生长的根际微生物，芽孢杆菌属在可持续农业方面显示出光明的前景。它们不仅能分泌促进植物生长的物质，还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ是一种可以分泌bacillomycin D、surfactin、fengycin等抗菌脂肽物质的芽孢杆菌。其中，bacillomycin D属于iturin家族成员，是通过非核糖体多肽合成酶催化形成的由一个14-17个C的β-氨基脂肪酸和7个氨基酸缩合而成的环状脂肽结构。它对黄曲霉、赭曲霉以及禾谷镰刀菌等具有很强的抑制作用。其中，真菌毒素是霉变食品的最大危害，严重威胁人类健康。而化学合成防腐剂具有食品安全的风险，研究和开发新的天然安全的农产品保鲜剂在保障粮食和食品安全以及防治真菌污染等方面具有重要的意义。但实际中，其并未在可持续农业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是由于它的生产成本高，因此，提高其产量便成为降低其生产成本的关键问题。
目前，国内外研究成果显示，提高bacillomycin D产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化其发酵条件，而很少采用分子生物学手段对菌种进行改良的方法来提高bacillomycin D产量。但随着对抗菌肽合成分泌机制研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。
Spo0A基因(Gene ID:5462336)的表达产物Spo0A是一种调控芽胞形成的十分重要的蛋白。它不仅促使芽胞杆菌形成芽胞，还能影响芽胞杆菌的生理活动，与抗菌物质的分泌有关。相关研究表明，芽孢的形成对于抗菌物质的合成分泌具有一定的促进作用。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建spo0A基因过表达载体，经过电转化通过同源重组在淀粉酶位点将枯草芽孢杆菌fmbJ基因组中spo0A基因敲入，从而构建一种高产抗菌肽bacillomycin D的枯草芽孢杆菌菌株fmbJspo0A的方法。
技术方案
1、通过过表达spo0A基因提高枯草芽孢杆菌抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，其特征在于：
(1)spo0A基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR的构建
根据枯草芽孢杆菌spo0A基因设计引物Spo0A-F和Spo0A-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和BglII的完整的spo0A基因(813bp)；根据枯草芽孢杆菌淀粉酶的启动子设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段(349bp)；根据枯草芽孢杆菌淀粉酶基因设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段(1012bp)；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5a，经酶切验证、测序正确后，分别命名为pSpo0A-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；
PCR扩增体系如下：
PCR程序为95℃3min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min；
pSpo0A-T用KpnI和BglII双酶切后获得spo0A片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-Spo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-Spo0A载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-PSpo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PSpo0A载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-LPSpo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段(952bp)以及pCBS-LPSpo0A载体的部分片段(30bp)，与经过BglII单酶切处理的pCBS-LPSpo0A载体，用同源重组酶连接，构建pCBS-LPSpo0AR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110，用于进一步的电转化。
(2)spo0A基因过表达菌株的构建
以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的spo0A基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+spo0A的基因片段，此时获得的菌株即为过表达spo0A的菌株，命名为fmbJspo0A；该菌株既包括的原本基因组上的spo0A基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的spo0A基因，成为过表达spo0A基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
过表达spo0A基因的枯草芽孢杆菌菌株fmbJspo0A可以在生产抗菌脂肽中应用，生产抗真菌肽bacillomycin D产品。
有益效果
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)不仅能分泌促进植物生长的物质，还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物，其中抗菌肽占主导地位。由于它具有广泛的抗菌活性、生物可降解性以及毒性低等特点,因此,愈来愈受到人们的重视。特别针对目前农药残留、化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响，研究天然的抗菌物质对农产品安全生产具有重要的现实意义。
国内外针对抗菌肽的发酵工艺和分离技术开展了大量的研究。虽然通过发酵工艺的优化能够在一定程度上提高抗菌肽的生产水平，但发酵产量仍然是大规模工业化生产的难题。因此，在分子生物学水平上，采用基因工程技术对菌种进行定向改造将成为一种提高抗菌肽产量的新手段。
本方法首先以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组spo0A基因的方法构建了一个高产bacillomycin D菌株fmbJspo0A。
本发明通过分子生物学技术，成功构建一株高产bacillomycin D菌株fmbJspo0A。与原始菌株fmbJ相比，经过菌种改良的菌株fmbJspo0A合成分泌bacillomycin D能力大幅度提高，产量从218.3±21.8mg/L提高到397.4±25.1mg/L，提高了1.82倍。此外，该发明还揭示了芽孢形成关键蛋白Spo0A对bacillomycin D合成分泌有促进作用，可以通过这种方法，利用pCBS-LPSpo0AR载体对任何枯草芽孢杆菌进行基因改良，以获得相应的改良菌种，达到提高抗菌肽产量的目的。
四、附图说明
图1.技术方案；
图2.spo0A基因过表达载体的构建；
图3.spo0A基因过表达菌株的构建；
图4.spo0A基因过表达菌株的PCR验证。
五、具体实施方式
本发明首先构建spo0A基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR，经过电转化将pCBS-LPSpo0AR载体转化入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ(公知公用，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.0943)，经过同源重组双交换过程在其基因组内淀粉酶基因位点插入带有启动子的spo0A基因，达到过表达spo0A基因的目的，从而构建一株高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株fmbJspo0A。通过PCR方法对突变菌株进行鉴定；利用高效液相色谱(HPLC)分析改良菌株bacillomycin D的产量。具体实施方式如下：
(1)spo0A基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR的构建
根据枯草芽孢杆菌spo0A基因(Gene ID:5462336)设计引物Spo0A-F和Spo0A-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和BglII的完整的spo0A基因(813bp)；根据枯草芽孢杆菌淀粉酶的启动子设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段(349bp)；根据枯草芽孢杆菌淀粉酶基因设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因(GeneID:5462160)片段(1012bp)；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T载体(购自Takara公司)，转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，经酶切验证、测序正确后，分别命名为pSpo0A-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；
PCR扩增体系如下：
PCR程序为95℃3min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min；
pSpo0A-T用KpnI和BglII双酶切后获得spo0A片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体(Rita Kamar,Agnès Réjasse,Isabelle Jéhanno,Zaynoun Attieh,Pascal Courtin,Marie-Pierre Chapot-Chartier,Christina Nielsen-Leroux,Didier Lereclus,Laureel Chamy,Mireille Kallassy and Vincent Sanchis-Borja,DltX of Bacillusthuringiensis Is Essential for D-Alanylation of Teichoic Acids and Resistanceto Antimicrobial Response in Insects,Frontier in Microbiology,2017,8:doi:10.3389/fmicb.2017.01437)，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-Spo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-Spo0A载体，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-PSpo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PSpo0A载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-LPSpo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BgIII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因(Gene ID：5462160)片段(952bp)以及pCBS-LPSpo0A载体的部分片段(30bp)，与经过BgIII单酶切处理的pCBS-LPSpo0A载体，用同源重组酶(购自南京诺唯赞生物科技有限公司，产品编号C112)连接，构建pCBS-LPSpo0AR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110(购自北京全式金生物技术有限公司)，用于进一步的电转化。
(2)spoOA基因过表达菌株的构建
以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的spoOA基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+spoOA的基因片段，此时获得的菌株即为过表达spoOA的菌株，命名为fmbJspo0A；该菌株既包括的原本基因组上的spoOA基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的spoOA基因，成为过表达spoOA基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
(3)过表达spoOA基因菌株的分子验证
对枯草芽孢杆菌fmbJspo0A突变菌是否过表达spoOA基因进行分子验证。由于在菌株的淀粉酶基因位点插入淀粉酶的启动子以及spoOA基因，所以我们采用已设计的淀粉酶启动子的上游引物PamyJ-F以及spoOA基因的下游引物Spo0A-R，以经抗性平板与非抗性平板共同筛选得到的枯草芽孢杆菌fmbJspo0A基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增出与预期结果大小一致的产物(图4，第1，2泳道)。经过分子生物学验证，我们确实得到了过表达spoOA基因的改良枯草芽孢杆菌菌株fmbJspo0A。
(4)改良枯草芽孢杆菌菌株fmbJspoOA抗真菌肽bacillomycin D产量HPLC分析
将枯草芽孢杆菌fmbJspo0A种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在33℃，180rpm下培养72h，得抗菌物质发酵液。发酵液5000g离心20min去除菌体，用6MHCl将上清液调节到pH 2，然后-4℃静置过夜，8000g离心收集沉淀，加入甲醇后用NaOH中和至pH 7，获得抗菌肽粗提物。
经过HPLC的分析，与原始菌株fmbJ相比，改良菌株fmbJspo0A中bacillomycin D产量从218.3mg/L提高到397.4mg/L，提高了1.82倍。
序列表
<110> 南京农业大学
南京福斯弗瑞生物科技有限公司
<120> 通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法
<141> 2018-08-29
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ggtaccgtgg agaaaattaa agtttg 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
agatctttac gaagctttat gctcc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gtcgactggt ggtttctttt tttg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ggtaccagtt tcagcgtttg ca 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
gtcgactcgt ttaggctggg cagt 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
agatctttaa tgcggaagat aaccat 26
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
acacattaac tagacagatc tatgtttaaa aaacgattca aaacctc 47
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
cataaagctt cgtaaagatc ttggcatacg tatcatgtga ttcc 44

Claims (5)

1.通过过表达spo0A基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，其特征在于：
(1)spo0A基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR的构建
设计引物Spo0A-F和Spo0A-R，以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和BglII的完整的spo0A基因片段813bp；设计引物PamyJ-F和PamyJ-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp；设计引物L-amy-F和L-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp；扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，经酶切验证、测序正确后，分别命名为pSpo0A-T、pPamyJ-T、pLamy-T，于-20℃条件下保存备用；
pSpo0A-T用KpnI和BglII双酶切后获得spo0A片段，与经过相同双酶切处理的pMAD载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS-Spo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段，与经过相同双酶切处理的pCBS-Spo0A载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pCBS-PSpo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段，与经过SalI和BamHI双酶切处理的pCBS-PSpo0A载体，利用BglII和BamHI为同尾酶的原因，消除载体上的BamHI酶切位点，用T4DNA连接酶连接，构建pCBS-LPSpo0A载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R，以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段952bp以及pCBS-LPSpo0A载体的部分片段30bp，与经过BglII酶切处理的pCBS-LPSpo0A载体，用同源重组酶连接，构建pCBS-LPSpo0AR载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌JM110，用于进一步的电转化；
(2)spo0A基因过表达菌株的构建
以枯草芽孢杆菌fmbJ制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的spo0A基因过表达载体pCBS-LPSpo0AR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ，在基因组淀粉酶位点发生双交换，在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长，且PCR验证出现PamyJ+spo0A的基因片段，此时获得的菌株即为过表达spo0A的菌株，命名为fmbJspo0A；该菌株既包括的原本基因组上的spo0A基因，且在淀粉酶位点处插入了同样的spo0A基因，成为过表达spo0A基因的突变菌株，即为所得到的提高抗真菌肽bacillomycin D产量的菌株。
2.权利要求1所述方法获得的过表达spo0A基因菌株fmbJspo0A。
3.权利要求2所述过表达spo0A基因菌株fmbJspo0A的应用。
4.权利要求2所述过表达spo0A基因菌株fmbJspo0A在生产枯草芽孢杆菌抗真菌肽bacillomycin D中的应用。
5.权利要求2所述过表达spo0A基因菌株fmbJspo0A生产的枯草芽孢杆菌抗真菌肽bacillomycin D产品。
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