CN102220367A - 通过超量表达yerP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过超量达yerP基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pHCMC04为骨架构建一个基因超量表达载体pHCMC-YerP，通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC9943中使yerP基因超量表达，构建了一个高产抗菌肽菌株FMB45。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。
Description
一、技术领域
本发明涉及通过超量表达yerP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。
二、背景技术
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943是一种可以分泌 surfactin，fengycin等抗菌肽物质的枯草芽孢杆菌（Valérie Leclère, Romain Marti, Max Béchet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their
目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件，而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。
yerP基因（Gene ID: 154684518），其表达产物YerP蛋白是枯草杆菌中surfactin抗菌肽的免疫蛋白，可以免疫surfactin对细胞自身的伤害，相关研究表明，YerP蛋白可以免除枯草杆菌分泌的surfactin对自身的伤害。
本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以枯草杆菌表达载体pHCMC04为骨架构建一个yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP，通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC9943中使yerP基因超量表达，构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 45。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建yerP基因超量表达载体，通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC 9943中，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 45。
技术方案
1、通过超量表达yerP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：
（1） yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP的构建
根据枯草芽孢杆菌P43启动子基因设计引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增P43启动子基因，获得300 bp基因片段；设计引物YerP-F和YerP-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增YerP基因，获得3195 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pP43-T、pYerP-T，于-20℃条件下保存备用；
| 名称 | 序列 | 酶切位点 |
| YerP-F | 5’GCGGGATCCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3’ | BamHI |
| YerP-R | 5’CGGCCCGGGTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3’ | SmaI |
| P43-F | 5’CGCGAGCTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’ | SacI |
| P43-R | 5’GCGGGATCCCATGTGTACATTCCTCTCTT3’ | BamHI |
PCR扩增体系如下：
10x Pfu PCR buffer 10μl
10μΜ 上游引物 10μl
10μM 下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
枯草芽孢杆菌基因组DNA 1μl
Pfu DNA聚合酶 1μl
ddH2O 60μl
PCR程序为94℃ 2min；34个循环：94℃ 45s，58℃ 50s，72℃ 4min；72℃ 10min；
pP43-T用BamHI/SacI双酶切后获得P43启动子基因片段，与经过相同双酶切处理的pHCMC04载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pHCMC-P43载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pYerP-T用BamH/SmaI双酶切后获得YerP片段，与经过相同双酶切处理的pHCMC-P43载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pHCMC-YerP载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；
（2）FMB 45菌株的构建
以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，CM抗性平板上筛选得到氯霉素抗性菌株，命名为FMB 45；质粒pHCMC-YerP可以在枯草杆菌ATCC 9943中过量表达yerP基因，成为超量表达yerP基因的突变菌株，即为所得到的菌株。所述超量表达yerP基因的枯草芽孢杆菌菌株FMB 45可以在生产枯草杆菌抗菌肽中应用，生产枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
有益效果
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质，其中抗菌肽占主导地位。由于它广谱的抗菌活性、生物降解和毒性低的特点,因此愈来愈受到人们的重视，在植物病害生物控制、食品防腐以及饲料添加剂等方面具有潜在的应用前景。特别针对目前农药残留、化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响，探索天然的抗菌物质对于农产品安全生产有重要的现实意义。
国内外针对实验室条件下抗菌肽的发酵工艺和分离技术已经开展大量研究。虽然通过发酵工艺的优化能够提高抗菌肽生产水平，但是发酵产量依然难于大规模工业化生产。因此从分子生物学水平，利用基因工程技术对菌种进行定向改良将成为一种新的提高抗菌肽产量的手段。
本发明通过分子生物学技术，成功构建一株高产抗菌肽菌株FMB 45。与原始菌株ATCC 9943相比，经过菌种改良的菌株FMB 45合成分泌抗菌肽能力大大提高，其中surfactin产量从777 mg/L提高到1266 mg/L，提高了1.6倍；fengycin的产量从646 mg/L提高到1160mg/L，提高了1.8倍。此外，此发明还揭示了YerP蛋白对抗菌肽物质都具有一定的免疫作用，可以通过这种方法，利用pHCMC-YerP载体对任何枯草芽孢杆菌进行基因改良，以获得相应的改良菌种，达到提高抗菌肽产量的目的。
四、附图说明
图1.技术方案；
图2. yerP基因超量表达载体的构建；
图3. yerP基因超量表达菌株PCR验证；
表1. P43启动子基因序列
五、具体实施方式
本发明首先构建yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP，经过电转化将pHCMC-YerP载体转化入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943（购自The Global Bioresource Center），通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC 9943中，达到过量表达yerP基因的目的，从而构建一株高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 45。通过提取质粒的方法对突变菌株进行鉴定；利用高效液相色谱（HPLC）分析改良菌株surfactin和fengycin的产量。具体实施方式如下：
（1）yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP的构建
根据枯草芽孢杆菌P43启动子基因设计引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增P43启动子基因，获得300 bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌yerP基因（Gene ID: 154684518）设计引物YerP-F和YerP-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增YerP基因表达框，获得3195 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19-T载体（购自Takara公司），转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a (购自宝生物工程有限公司)，经验证、测序正确后，分别命名为pP43-T、pYerP-T，于-20℃条件下保存备用；
| 名称 | 序列 | 酶切位点 |
| YerP-F | 5’GCGGGATCCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3’ | BamHI |
| YerP-R | 5’CGGCCCGGGTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3’ | SmaI |
| P43-F | 5’CGCGAGCTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’ | SacI |
| P43-R | 5’GCGGGATCCCATGTGTACATTCCTCTCTT3’ | BamHI |
PCR扩增体系如下：
10x Pfu PCR buffer 10μl
10μΜ 上游引物 10μl
10μM 下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
枯草芽孢杆菌基因组DNA 1μl
Pfu DNA聚合酶 1μl
ddH2O 60μl
PCR程序为94℃ 2min；34×(94℃ 45s；58℃ 50s；72℃ 4min)；72℃ 10min。
pP43-T用BamHI/SacI双酶切后获得P43启动子基因片段，与经过相同双酶切处理的pHCMC04载体（购自 Bacillus genetic stock center，ECE189P），用T4 DNA连接酶连接，构建pHCMC-P43载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pYerP-T用BamH/SmaI双酶切后获得YerP片段，与经过相同双酶切处理的pHCMC-P43载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pHCMC-YerP载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；
（2）FMB 45突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌ATCC 9943（购自The Global Bioresource Center）制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，氯霉素平板上筛选得到氯霉素抗性菌株5株，命名为FMB 45；质粒pHCMC-YerP可以在枯草杆菌ATCC 9943中过量表达yerP基因，成为超量表达yerP基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
（3）FMB 45菌株的分子验证
对枯草芽孢杆菌FMB 45突变菌是否超量表达yerP基因进行分子验证。由于菌株内含有pHCMC-YerP质粒，所以我们从改良菌株FMB 45中提取质粒pHCMC-YerP来验证其是否被成功转化入枯草杆菌中。经过提取质粒，电泳检测后，发现枯草杆菌FMB 45中确实含有pHCMC-YerP质粒（图3 第1泳道）。经过分子生物学验证，我们确实得到了超量表达yerP基因的改良枯草芽孢杆菌菌株FMB 45。
（4）改良枯草芽孢杆菌菌株FMB 45抗菌肽产量HPLC分析
将枯草芽孢杆菌FMB 45种子液以5%浓度接种于Landy发酵培养基中，在33°C，180 rpm下培养36 h，得抗菌物质发酵液。发酵液11000g离心15 min除去菌体，用6 M HCl将上清液调节到pH 2，然后静止过夜，11000g离心收集沉淀，加入甲醇后用NaOH中和至pH 7，获得抗菌肽粗提物。
经过HPLC（Agilent 1100 Series）的分析，与原始菌株ATCC9943相比，改良菌株FMB 45 中surfactin产量从777 mg/L提高到1266 mg/L，提高了1.6倍；fengycin的产量从646 mg/L提高到1160 mg/L，提高了1.8倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京农业大学
<120> 通过超量表达yerP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
<130> 说明书
<160> 5
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> YerP-F
<222> (1)..(34)
<223>
<400> 1
gcgggatcca tgaccagtca gtcaataaaa aatg 34
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> YerP-R
<222> (1)..(30)
<223>
<400> 2
cggcccgggt tactcttctt ccgttcccgg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> P43-F
<222> (1)..(30)
<223>
<400> 3
cgcgagctct gataggtggt atgttttcgc 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> P43-R
<222> (1)..(29)
<223>
<400> 4
gcgggatccc atgtgtacat tcctctctt 29
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> P43启动子基因序列
<222> (1)..(300)
<223>
<400> 5
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
Claims (4)
1.通过超量表达yerP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：
（1）yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP的构建
设计引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增P43启动子基因，获得300 bp基因片段；设计引物YerP-F和YerP-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增YerP基因表达框，获得3195 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pP43-T、pYerP-T，于-20℃条件下保存备用；
pP43-T用BamHI/SacI双酶切后获得P43启动子基因片段，与经过相同双酶切处理的pHCMC04载体，用T4DNA连接酶连接，构建pHCMC-P43载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pYerP-T用BamH/SmaI双酶切后获得YerP片段，与经过相同双酶切处理的pHCMC-P43载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pHCMC-YerP载体，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；
（2）FMB 45菌株的构建
以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的yerP基因超量表达载体pHCMC-YerP转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，氯霉素平板上筛选得到氯霉素抗性菌株，命名为FMB 45；质粒pHCMC-YerP可以在枯草杆菌ATCC 9943中过量表达yerP基因，成为超量表达yerP基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
2.权利要求1所述方法获得的超量表达yerP基因菌株FMB 45。
3.权利要求2所述超量表达yerP基因菌株FMB 45在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应用。
4.权利要求2所述超量表达yerP基因菌株FMB 45生产的枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
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| CN107236751A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-10-10 | 华中农业大学 | 一种利用枯草芽孢杆菌表达系统快速、高效筛选抗菌基因的方法 |
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-
2011
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