CN102162003B - 一种提高阿维菌素产量的方法及其生产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高阿维菌素产量的方法及生产菌株，其是将阿维链霉菌中编码细胞质外功能亚家族RNA聚合酶σ因子(ECFsubfamily RNA polymerase sigma factor)的sig6基因通过基因缺失载体引入阿维链霉菌中，获得缺失sig6基因的重组菌，使其不再合成σ6，从而提高阿维菌素的产量。本发明的基因工程菌可直接用于阿维菌素的发酵生产，提高阿维菌素的发酵单位，降低生产成本。

Description

一种提高阿维菌素产量的方法及其生产菌株

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种提高阿维菌素产量的基因工程方法。

背景技术

阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的一组高效杀虫的十六元环大环内酯类抗生素，它的天然产物共有八个组分(A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b)，其中B1组分的杀虫活性最强，几乎抗所有与农业有关的线虫和节肢动物，被广泛应用于农业生产上。伊维菌素(ivermectin)是以阿维菌素B1为原料在C22-C23位加氢还原而成，与阿维菌素B1具有相同的杀虫活性，但毒性比阿维菌素低2-3倍，更适用于动物体内外寄生虫的防治，是一类广谱有效的新型抗寄生虫抗生素。阿维菌素和伊维菌素具有独特的作用机制，不易使害虫产生抗性，且易降解、无残留，对作物、牲畜、人类和环境高度安全，被我国农业部推荐为无公害农药，具有非常广阔的市场前景和应用价值。阿维菌素和伊维菌素已在国内实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但我国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。提高阿维菌素的产量，降低生产成本，具有重要的现实意义。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，具有重要的意义和应用价值。

σ因子是RNA聚合酶的辅助因子，其功能是引导RNA聚合酶稳定地结合到DNA启动子上。细菌中的σ因子分为“管家”σ因子和一系列选择性σ因子。前者主要用于启动快速生长必需基因的表达，后者负责启动特定生长条件下的相关基因表达或关闭，以对抗环境胁迫和满足自身生理需求。细胞质外功能亚家族RNA聚合酶σ因子(ECFσ因子)按照其序列保守性和功能可归为σ⁷⁰家族，ECFσ因子所识别的启动子序列也是相当保守的。ECFσ因子能够在特定情况下控制特定基因的转录。通常情况下，这些ECFσ因子受到一些内膜蛋白的调节，这些内膜蛋白可以作为一种感受器或一种信号分子，通过感受外界环境的变化来调节ECFσ因子的活性，从而起始相应基因的转录。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高阿维菌素产量的方法。

本发明的另一目的是提供高产阿维菌素的基因工程菌。

为了实现本发明目的，本发明首先提供sig6基因在提高菌种的阿维菌素产量中的应用。

前述的应用，即通过在菌种中缺失sig6基因，以提高阿维菌素产量。所述菌种可以是任何能够产生阿维菌素的链霉菌，例如阿维链霉菌野生菌，或者经常规诱变和基因工程改造后能够产生阿维菌素的菌种，例如阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ATCC 31267。

基于此，本发明提供一种缺失sig6基因的产阿维菌素的基因工程菌。如前所述，其出发菌可以是任何能够产生阿维菌素的链霉菌，例如阿维链霉菌野生菌，或者经基因工程改造后能够产生阿维菌素的菌种。

本发明还提供一种制备上述基因工程菌的方法，包括如下步骤：构建sig6基因的缺失载体，并将该缺失载体引入产阿维菌素的菌种中获得sig6缺失的重组菌。

具体可通过如下方法构建基因工程菌：用PCR扩增阿维链霉菌中sig6基因的上、下游序列，构建sig6基因的缺失载体，并将构建好的重组载体转化产阿维菌素菌株，筛选获得阳性重组菌。将含有上述重组载体的菌株先在39℃高温下培养，诱导质粒丢失获得单交换菌株，再将其在28℃、无安普霉素的培养基下传代进行培养获得sig6基因缺失突变株。在本发明实施例中，获得了缺失sig6的阿维链霉菌野生菌的基因工程菌。

前述的方法，其中构建sig6基因缺失载体的出发载体为任意一种含有链霉菌温度敏感型复制子的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。优选载体如pKC1139、pGM160、pHZ132或pCZA185等。

在本发明实施例中，以pKC1139为出发载体构建了sig6基因缺失载体pLB11。

前述的方法，其中所述将sig6基因缺失载体引入产阿维菌素的菌种中，可以采用生物工程领域中常用的方法，例如PEG介导的原生质体转化法、电转化法、接合转移法等，优选PEG介导的原生质体转化法。

前述的方法，为提高转化效率，可先将sig6基因缺失载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567中，从中提取质粒再转化到产阿维菌素的菌种中。

本发明提供一种提高阿维菌素产量的方法，其利用缺失sig6基因的产阿维菌素的基因工程菌来提高阿维菌素的产量。

本发明是将阿维链霉菌中编码ECF RNA聚合酶σ因子的sig6基因通过缺失载体引入阿维链霉菌中，获得sig6基因缺失的重组菌，使其不再合成σ6，从而提高阿维菌素的产量。本发明的基因工程菌可直接用于阿维菌素的发酵生产，提高阿维菌素的发酵单位，降低生产成本。

附图说明

图1为本发明较佳实施例sig6基因缺失载体pLB11的质粒图谱。

图2为本发明较佳实施例sig6缺失载体pLB11与阿维链霉菌野生型菌株ATCC 31267染色体的同源双交换示意图。

图3为本发明较佳实施例阿维链霉菌野生型菌株ATCC 31267及其sig6缺失突变株的阿维菌素发酵单位。

图4为在不同的发酵培养基中，阿维链霉菌野生型菌株ATCC731267及其sig6缺失突变株的阿维菌素发酵单位。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1sig6基因缺失载体的构建

一、阿维链霉菌sig6基因的克隆

根据Genebank公布的阿维链霉菌野生型菌株ATCC 31267中sig6基因[NC_003155.4(820435..821349)]的序列及其上、下游的序列设计PCR引物：

Primer sig6_1：5′-CCCAAGCTTACCGAGGCAAGTACGAGG-3′

Primer sig6_2：5′-GGAGTTCGAGCCCAGGAGTCACCGAACCGA

GCAACC-3′

Primer sig6_3：5′-GGTTGCTCGGTTCGGTGACTCCTGGGCTC

GAACTCC-3′

Primer sig6_4：5′-CGGAATTCGTCGATGCCGGTGACAAC-3′

引物sig6_1和sig6_4两端分别引入HindIII和EcoRI酶切位点(下划线部分)。以阿维链霉菌ATCC 31267基因组DNA为模板，分别以sig6_1和sig6_2，sig6_3和sig6_4进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃，5min；(95℃，1min；60℃，1min；72℃，0.5min)×25个循环；72℃，5min。电泳检测PCR产物，分别在490bp(sig6_1和sig6_2)和493bp(sig6_3和sig6_4)处有特异性的扩增条带。然后以所获的扩增条带以1∶1的摩尔比加入到PCR扩增体系中作为模板，以sig6_1和sig6_4进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃，5min；(95℃，1min；60℃，1min；72℃，1min)×25个循环；72℃，5min。将PCR产物电泳检测，在947bp处有特异性的扩增条带。

二、sig6缺失载体的构建

电泳回收上述947bp片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，经HindIII和EcoRI酶切连接于经HindIII和EcoRI双酶切的载体pKC1139(Bierman M，Logan R，O’Brien K，等.用于从大肠杆菌到链霉菌DNA接合转移的质粒克隆载体.基因，1992，116：43-49)得质粒pLB11。测序表明所扩增的片段确实为sig6基因的上下游序列，且与所公布的序列一致。pLB11的质粒图谱如图1所示。

实施例2重组质粒的转化

通过实施例1构建了sig6基因的缺失质粒载体pLB11，作为对照的原始质粒为pKC1139。

由于阿维链霉菌中存在很强的限制修饰作用，用提取自E.coliDH5α的质粒直接转化阿维链霉菌，转化效率极低，有时甚至得不到转化子。而用来自没有限制修饰作用的受体菌E.coliET12567的质粒，其转化效率明显提高。因此，将构建好的重组质粒转化到E.coliET12567(Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，等.实用链霉菌遗传手册，2000，Norwich：约翰英纳斯基金会)中以获得非甲基化的DNA，然后再用非甲基化的质粒DNA转化阿维链霉菌的原生质体。

本实施例选用阿维链霉菌菌株ATCC 31267作为出发菌株。ATCC 31267是阿维链霉菌野生型菌株，产灰色孢子。制备这种阿维链霉菌菌株的原生质体，用从E.coliET12567中提取的质粒转化原生质体，涂于已吹干的不加抗生素的RM14平板上，28℃培养16-20h后，在平板上涂1mL含1000μg安普霉素的水溶液，在28℃继续培养7-10天，长出的菌落即为转化子。由于阿维链霉菌的转化子在RM14再生培养基上不产孢，故各挑取三个转化子，接种于含10-15μg/mL安普霉素的YMS平板上，28℃培养7-10天恢复产孢。转化子经质粒提取及PCR验证正确。

本实施例中大肠杆菌的转化、阿维链霉菌原生质体的制备及转化方法、RM14及YMS培养基的配制参见蔡玉娟的硕士论文(蔡玉娟.产绿孢子阿维链霉菌遗传改造和发酵条件的研究.硕士学位论文，2006，北京：中国农业大学)。

实施例3sig6基因缺失突变株的获得

分别收集以上经验证正确的含有pLB11质粒和对照质粒pKC1139转化子的孢子，以每培养皿约100个孢子涂布于含有安普霉素的YMS平板上，置于28℃培养48-72h，当菌落直径约2mm左右，即将形成气生菌丝时，将平板转移至39℃高温培养7天后，含有pLB11的一些菌落上出现扇形生长，而含有pKC1139的菌落移至39℃后不再生长。这是由于pKC1139为温敏型的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，当温度高于34℃时不能自我复制，因此在含有安普霉素的YMS培养基上无法生长；只有当重组质粒pLB11所携带的sig6基因上、下游序列与阿维链霉菌染色体上同源区段发生同源重组，并通过单交换整合到染色体上的菌株才能表达安普霉素的抗性基因，从而在含有安普霉素的YMS培养基上生长。将39℃长出的抗安普霉素的单交换突变株在不添加抗生素的YMS平板上传代，共转接2-4次后，筛选安普霉素敏感的双交换重组体。挑取其中的10株菌，与阿维链霉菌ATCC 31267一起在YEME中28℃振荡培养48h，均未能从中提取出质粒，说明重组质粒pLB11已被消除。利用PCR对Apr^s突变株加以验证。分别获得多株ATCC 31267的sig6缺失突变株。sig6缺失载体pLB11与阿维链霉菌ATCC 31267染色体的同源双交换示意图如图2所示。

实施例4阿维链霉菌野生型菌株ATCC 31267及sig6缺失突变株发酵生产阿维菌素

一、阿维链霉菌的摇瓶发酵

种子培养基：可溶性淀粉30g，麦芽膏2g，大豆蛋白胨2g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

发酵培养基I：可溶性淀粉50g，酵母粉12g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，KCl 4g，CaCO₃2g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

发酵培养基II：可溶性淀粉70g，花生蛋白粉20g，麦芽糖30g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，KCl 3g，(NH4)₂SO₄0.1g，CaCO₃1g，CoCl₂·6H₂O 7.5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

二、发酵产物的HPLC分析

1.样品处理：取1.0mL发酵液，加入4.0mL甲醇，浸泡30分钟以上，每隔10分钟振荡一次，4000rpm离心10分钟，取上清液进样分析；

2.HPLC分析条件：C₁₈反相柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱温40℃，流动相为甲醇∶水(85∶15)，流速1.0mL/min，进样体积20μL，波长为246nm。

三、ATCC 31267及其不同sig6缺失突变株的发酵结果

阿维链霉菌野生型菌株ATCC 31267及其sig6缺失突变株在YMS培养基上长出丰富的孢子后接种于种子培养基(装量为50mL/250mL三角瓶)中，28℃摇床培养24小时(转速180rpm，偏心距2.5em)。按5％接种量接种于发酵培养基(装量为50mL/250mL三角瓶)中，28℃培养10天(转速250rpm，偏心距2.5em)，放瓶，用甲醇提取-HPLC法测定阿维菌素的发酵单位，结果如图3所示。

图3的发酵结果显示，sig6基因的缺失突变株与出发菌株相比，阿维菌素发酵单位与出发菌株相比均明显增加，缺失突变株的阿维菌素B1组分产量是出发菌株的2.11倍。sig6基因缺失对阿维菌素合成有显著促进作用。

四、ATCC 31267及其不同sig6缺失突变株在发酵培养基II中的发酵结果

图4的发酵结果显示，在发酵培养基II中，sig6基因的缺失突变株与出发菌株相比，阿维菌素发酵单位与出发菌株相比也明显增加，缺失突变株的阿维菌素B1组分产量是出发菌株的2.21倍。sig6基因缺失在发酵培养基II中对阿维菌素合成也有显著促进作用。

实施例5工程菌株的稳定性考察

将实施例3中构建的sig6基因缺失的基因工程菌株分别在YMS斜面上连续转接五次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好，性状稳定。经转接五次后的各个工程菌株再进行摇瓶发酵，HPLC检验阿维菌素产量均未发生明显变化，说明所构建的工程菌是稳定的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.sig6基因在提高菌种的阿维菌素产量中的应用，其特征在于，所述菌种为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在菌种中缺失sig6基因，以提高阿维菌素产量。

3.一种缺失sig6基因的产阿维菌素的基因工程菌，其特征在于，其出发菌为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，其出发菌为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ATCC 31267。

5.一种制备权利要求3或4所述基因工程菌的方法，其包括如下步骤：构建sig6基因的缺失载体，并将该缺失载体引入阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)中获得sig6的缺失重组菌。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于构建sig6基因缺失载体的出发载体为任意一种含有链霉菌温度敏感型复制子的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述穿梭载体为：pKC1139、pGM160、pHZ132或pCZA185。

8.一种提高阿维菌素产量的方法，其是利用权利要求3或4所述的基因工程菌生产阿维菌素，从而提高阿维菌素的产量。

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