CN102250923B - 对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因及其在甘蔗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和生物防治领域，具体涉及人工合成的Bt基因及其转基因植株抗虫性的应用。本发明提供了一种DNA分子，它编码对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因mcry IAc，该DNA分子具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本发明还提供了相应的蛋白质及植物表达载体。本发明对cry IAc基因进行完全改造，选用植物偏爱的密码子，去除了原序列中干扰基因在植物中表达的元件，由此获得的高表达量的转基因甘蔗品系，在温室和田间实验证明对鳞翅目害虫具有天然的抗性。抗螟甘蔗品种选育将有助于减少螟虫对甘蔗生产的威胁，减少化学农药施用，保护生态环境，促进蔗糖业的可持续发展。

Description

对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因及其在甘蔗中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物防治领域，具体涉及到根据植物偏爱密码子设计人工合成的Bt基因在甘蔗中的表达及转基因植株抗虫性的研究。

背景技术

甘蔗是我国的重要经济作物，近年来种植面积约120万公顷，年产甘蔗糖920万吨，占我国食糖总产量的90％以上。国家已把发展生物质能源作物为主要原料的生物质液体燃料列为可再生能源中长期发展规划的重要内容，并确定了到2020年达到年替代石油1000万吨的能力的目标，其中甘蔗是最重要的能源作物之一。我国糖蔗产区主要分布在广东、广西、云南和海南等省区的经济相对不发达地区，蔗糖业是这些地区的重要经济支柱。稳定和发展甘蔗产业对满足国民的食糖消费需求、繁荣贫困蔗区地方经济和促进绿色能源工业的发展有着重要的意义。

在甘蔗生产中，虫害一直是最大威胁因素之一，其中危害最严重的是甘蔗螟虫(鳞翅目害虫)。几乎所有蔗区都受着不同程度的螟虫危害。我国蔗区发生的甘蔗螟虫主要有二点螟、条螟、黄螟、大螟、白螟和台湾稻螟等，不同蔗区，种类的分布有差异。螟虫危害可导致枯心苗、虫蛀节、枯稍、长侧芽、蔗株停止生长、茎数减少、糖分下降等，从而造成产量、糖分损失，同时还由于蔗茎组织受伤害，导致病菌(如赤腐病菌等)易入侵和易受风折。螟害造成的损失一般达5％～20％，严重的可达40％以上。特别是发展能源甘蔗时，一年四季各生长期的甘蔗都有，更有利于害虫的生长、繁殖，害虫的发生为害将更加严重。

目前我国蔗区主要以施用杀虫剂防治甘蔗害虫。长期大量施用杀虫剂，不但使生产成本增加，而且还导致严重的环境污染和生态平衡破坏、害虫天敌数量和种群减少，进而形成需要继续依赖杀虫剂的局面和虫害再猖獗现象。抗虫育种是防治农作物害虫最经济、最有效的措施之一。但甘蔗自身缺乏抗源。随着分子育种研究的进展，基因工程打破了抗性基因来源的限制。近年来，Bt等抗虫基因已被广泛应用于多种作物的抗虫育种，取得了可喜的成就。

80年代以来，随着生物技术的迅速发展和以苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)δ-内毒素基因(Bt基因)为主的各种杀虫蛋白基因的发现和克隆，抗虫基因转移研究已取得了可喜的成就。Bt基因在作物的虫害防治方面具有重要的应用价值。Bt作物田间试验的报道首见于1986年，但直至20世纪90年代中期，Bt作物才被应用于商业化生产。甘蔗转基因抗虫育种的进展相对较慢。目前尚未见转基因抗虫品种商品化种植的报道。古巴科学家1997年报道将Bt基因导入甘蔗品种但基因表达水平过低(少于总蛋白的0.0002％)而失去商品化价值。澳大利亚BSES的科学家将从马铃薯中克隆的抗虫基因导入甘蔗Q117品种，获得了转基因植株。1998年已通过温室盆栽试验证明转基因植株对金龟子有良好的抑制生长作用。我国科技工作者已将抗线虫基因Hslpro-1(2004)、调控花组织分化的基因LEAFY(2003)、抗病毒基因ScMV-CP(2004)、抗旱基因Tsase(2000，2003)及抗虫基因Bt转入甘蔗中，但均处于试验阶段。

苏云金杆菌能产生蛋白性质的伴孢晶体，对多种昆虫，线虫，螨类等原生动物具有特异的杀虫活性，对人畜无害，不污染环境，因而被广泛应用于害虫的生物防治。其中CryI系列的δ-内毒素对鳞翅目(Lepidoptera)害虫特别有效，因而cryI中的许多基因已被广泛用于植物的抗虫基因工程。但由于微生物与动植物的密码子的使用差别使翻译效率降低；野生型Bt基因中富含AT序列，在植物中表达的野生型Bt基因的mRNA通常不稳定易被降解等问题造成Bt基因在植物中表达量很低。因此，要使得Bt基因在转基因植物中高效表达，必须对野生型Bt基因进行有效的改造。

发明内容

本发明的目的是提供一种对甘蔗条螟等鳞翅目重要害虫具有极高毒力的适用于单子叶植物中表达的合成基因mcryIAc。

本发明的另一个目的是提供一种使植物产生对鳞翅目害虫抗性的方法。

具体技术方案构思为：针对苏云金杆菌的野生型cryIAc基因片段较长(3534bp)，难以在甘蔗中表达的特点，采用5′端活性片段序列(1845bp)，根据单子叶植物偏爱密码子设计了可以在甘蔗中高效表达的具有持久生物活性的Bt蛋白及其编码序列。采用用递归的PCR的方法进行扩增，分三段合成了苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因cryIAc的活性区序列，经克隆将其组装成完整的mcryIAc基因片断(1845bp)，与原始cryIAc DNA序列比较，该DNA序列编码蛋白质的氨基酸组成和序列不变，甘蔗偏爱性密码子的使用频率很高，消除了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA序列内含子序列，G+C含量由37.4％提高到56.3％，所用密码子中，第三位碱基的GC含量由23.1％提高到65.8％，使其能在甘蔗中稳定高表达。构建了高效启动子控制该目的基因表达的转化质粒，采用基因枪法转化甘蔗愈伤组织，利用Southern blot和Western blot检测该基因在转基因甘蔗植株中的插入和表达情况，发现mcryIAc基因已插入甘蔗染色体中，在蔗茎和叶中的表达量为5-50ng/mg。无性繁殖第7代还很稳定表达CryIAc晶体蛋白，保持良好的抗虫性，是已知的转基因抗虫甘蔗中，对甘蔗螟虫抗性最好的材料。

本发明的提供了一种DNA分子，它编码对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因mcryIAc，该DNA分子具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。

本发明的提供了一种具备对鳞翅目害虫高抗性的的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该蛋白质的核苷酸序列编码序列如SEQ ID NO1所示。

本发明提供了一种植物表达载体，该植物表达载体含有在大肠杆菌和甘蔗中穿梭的双元载体序列和具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。例如，该载体由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列和大肠杆菌和甘蔗中穿梭的双元载体序列构成。

本发明提供了一种使单子叶植物产生对鳞翅目害虫抗性的方法，即用上述植物表达载体转化单子叶植物。单子叶植物例如实施例中所述的甘蔗。

本发明提供了植物表达载体的应用，即将含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的大肠杆菌-甘蔗穿梭载体转化甘蔗，从而使甘蔗产生对鳞翅目害虫的抗性。

本发明提供了所述的人工合成对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因mcryIAc的应用，将相应的蛋白质应用于抗鳞翅目害虫。较好的，所述的鳞翅目害虫是螟虫。

本发明还提供了检测转化植株的方法：即以mcryIAc基因为探针与样品进行杂交，利用southern blot检测是否存在mcryIAc基因并插入植物染色体中。

具体而言，检测在植物中表达的具有Bt晶体蛋白活性的方法，其步骤如下：

(1)将cryIAc基因连于表达载体pGEX-4T中形成cryIAc的晶体蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入E.coli，形成可表达CryIAc晶体蛋白的原核宿主细胞；

(3)在适合表达CryIAc晶体蛋白的条件下，提取纯化该蛋白；

(4)将获得的纯CryIAc晶体蛋白免疫兔子；

(5)以免疫后的兔血清为第一抗体，利用western blot检测转基因植株中CryIAc晶体蛋白的表达。

本发明中，基因合成、装载体、转化植株都采用本领域的常规方法和操作。

本发明在不改变晶体蛋白氨基酸序列的情况下，对cryIAc基因通过人工合成进行完全改造，选用植物偏爱的密码子，去除了原序列中干扰基因在植物中表达的元件使转基因植物的目标蛋白表达量获得提高。根据单子叶植物偏爱性密码子设计多条长链寡聚核苷酸，进行人工改造和全合成，利用基因枪法转化甘蔗的重要栽培品种，并且能够稳定表达，获得了一批高表达量的转基因甘蔗品系，温室和田间实验证明对鳞翅目害虫具有天然的抗性。抗螟甘蔗品种选育将有助于减少螟虫对甘蔗生产的威胁，减少化学农药施用，保护生态环境，促进蔗糖业的可持续发展。

附图说明

图1是人工合成目的基因mcryIAc的设计。先将cryIAc基因的前1845bps序列设计成适合在甘蔗中表达的假想基因mcryIAc，保持氨基酸顺序不变，分析单一酶切位点后选择其中DraIII(616)和BamHI(1364)为分界点。将mcryIAc分成三个片段I，II，III。在片段I 5’端引入SmaI，在分别在三个片段的两边的外引物中引入EcoRI和SacI以用于克隆和测序。

图2是三个递归PCR(Recursive PCR)后得到的产物片段I：650bps。

图3是三个递归PCR(Recursive PCR)后得到的产物片段II：780bps。

图4是三个递归PCR(Recursive PCR)后得到的产物片段III：520bps。

图5是yIAc基因核苷酸碱基G+C含量的变化。合成基因mcryIAc中核苷酸碱基G+C总含量由37.4％提高到56.3％，第三位碱基GC含量由23.1％提高到65.8％。

图6是转化质粒pUbimBt的构建示意图。限制性酶切位点：H，HindIII；B，BamHI；S，SmaI；A，AvaI；K，KpnI；Sc，SacI；E，EcoRI.基因片段：Amp，ampicilin resistance gene；NPTII，G418和卡那霉素抗性基因；Pubi，玉米泛激素启动子；mcryIAc，Bt基因的插入片段；Tnos，胭脂碱氧化酶的3’终止区域。

图7是质粒pEmukn的意图。Sc，SacI；E，EcoRI.基因片段。nos，胭脂碱氧化酶的3’终止区域。

图8是Western blot检测。分析结果表明改造后的Bt基因mcryIA表达量明显提高。81.来源于细菌的CryIAc蛋白，82-87.转基因甘蔗叶片中的总蛋白提取物。

图9是抗虫性效果分析。横坐标是甘蔗株号，纵坐标是死亡率。1和7为未转基因的对照株，蔗螟不死亡。3，4，6，10，11，12，13，15均为高表达转基因植株，蔗螟全部死亡。2，5，8，14转基因植株的CryIAc蛋白表达量不高，抗虫效果就略差。转基因甘蔗的抗虫性随着CryIAc蛋白表达量的增多而提高。

具体实施方式

实施例1 目的基因的合成过程

(1)设计寡聚核苷酸合成目的基因

依据甘蔗偏好使用密码子，先将1845bps的cryIAc基因序列设计成适合在甘蔗中表达的假想基因mcryIAc，保持其氨基酸顺序和原天然的一样，分析单一酶切位点后选择其中DraIII(616)和BamHI(1364)为分界点(如图1)。将mcryIAc分成三个片段(I，II，III)来设计，我们引入SmaI在片段I5’端(它可用于mcryIAc基因安插在Ubi-1启动子下)，EcoRI和SacI在三个片段(I，II，III)的两边的外引物中以用于克隆和测序，对于片段I，我们还设计了10个内引物(80bps到100bps)，片段II10个内引物，片段III8个内引物。每个内引物设计时有15-20个核苷酸序列是重叠的。所有引物的退火温度是从50℃到54℃之间，以确保其PCR的专一性。

(2)递归的PCR反应(Recursive PCR)。cryIAc基因合成采用递归的PCR的方法，结合高保真的pfu耐高温DNA聚合酶进行PCR扩增。分别合成I，II，III三个片段。第一段从ATG起始密码到616DraIII位点，共有616bp核苷酸(见图2)；第二段从616DraIII位点到1364BamHI，共有748bp核苷酸(见图3)。第三段从1364BamHI位点到终子密码TGA，共有481bp核苷酸(见图4)。片段I的两个外引物(5’端含EcoRI/SmaI位点，3’端含DraIII/SacI位点)，片段II的两个外引物(5’端含EcoRI/DraIII位点，3’端含BamHI/SacI位点)，片段III的两个外引物(5’端含EcoRI/BamHI位点，3’端含SacI位点)，这三个片段的3对外引物的浓度分别是10个内引物的20到100倍。反应体积50μl，反应条件为94℃，4分钟，然后30个循环(92℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，1分钟)，最后72℃延伸10分钟。

(3)组装3个片段：三个Recursive PCR后得到的三个产物均含5’端EcoRI位点和3’端SacI位点。将I，II，III片段以EcoRI/SacI位点分别插入pBluescript SK载体中得到pBluescript SK I，II，III三个质粒，进行测序，检测其中pBluescript SK II和pBluescriptSK III中分别有一个碱基与设计的不符。用定点突变的方法(stratagene定点突变试剂盒)进行纠正，序列正确的片段II和III分别通过DraIII/BamHI，BamHI/SacI相连进入pBluescript SK I质粒得到重组质粒pBluescript SK I+II+III，连接成完整的m-cryIAc基因。合成基因与野生型基因相比，整个基因的核苷酸组成发生了变化，增加了结构稳定的碱基含量，mRNA不稳定的AT核苷酸集聚区域序列全部替换，并改动了5个易形成二级发夹结构区域核苷酸序列。其中核苷酸碱基G+C总含量由37.4％提高到56.3％，第三位碱基GC含量由23.1％提高到65.8％(见图5)。

实施例2 转化质粒pUbimBt的构建：

质粒pBI121(Clontech，USA)中nos终止片段(胭脂碱氧化酶的3’终止区域)和2.1kbGUS基因片段克隆到pGEM-4Z(Promega，USA)并插入2kb含玉米泛激素启动子Pubi及其增强子(来源于质粒pAHC18，Christensen AH，Transgenic Research 5：213-8，1996，在甘蔗中可提高基因的转录水平从而增加基因产物的表达量。)，得到质粒pUbiGUS。将质粒pUbiGUS中的GUS基因去除，连入多克隆位点片段(来源于质粒pGEM-3Z Promega)得到质粒pU3Z.将合成基因mcryIAc通过SmaI/SacI而克隆插入pU3Z植物表达载体的多克隆位点就得到得到适合在甘蔗中高效表达的质粒pUbimBt(如图6)。

实施例3.甘蔗的转化

采用基因枪法(Bio-Rad 1000/He Biolistic gun)将两个质粒(pEmuKN和pUbimBt)导入甘蔗的胚性愈伤组织，质粒pEmuKN由David Last(CSIRO Division of Plant Industry，Canberra，Australia)提供，卡那霉素抗性基因(或G418抗性基因)aphA来源于质粒pEmukn(如图7)。获得了转化植株，经PCR和southern检测表明甘蔗的染色体中存在mcryIAc基因。

实施例4.转基因产物的鉴定

蛋白免疫分析基因表达量：利用Western blot，根据标准CryIAc蛋白的情况推算出转基因甘蔗的叶片和茎中Bt毒素蛋白的含量。利用Western blot检测mcryIAc基因在转基因甘蔗中的表达。以往的数据显示Bt基因在叶和茎上的表达程度是一致。我们只针对甘蔗叶上的蛋白表达量进行测定。部分植株的定量Western blot分析结果(见图8)，表明改造后的Bt基因mcryIA表达量明显提高，在蔗茎和叶中的表达量为5-50ng/mg总蛋白。特异免疫反应的蛋白分子量与该基因片段在大肠杆菌中表达产物(泳道1)大小一致。表明人工合成的mcryIA基因能在植物中正确地表达毒素蛋白CryIAc。

实施例5.转基因植株抗虫性的检测

将mcryIA基因转入甘蔗，筛选毒素蛋白CryIAc高表达量的转基因植株，获得一批抗性良好的Bt甘蔗品系。分别在玻璃温室和大田进行抗虫性的筛选鉴定。转基因甘蔗的杀虫活性变化趋势与CryIAc蛋白表达量有关，即随着CryIAc蛋白表达量的由少到多，杀虫活性也由低变高。抗虫性效果如图9。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因及其在甘蔗中的应用

<130>1040

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1848

<212>DNA

<213>Artificial

<400>1

atggacaaca acccaaacat caacgagtgc atcccataca actgcctgag caacccagag

60

gtggaggtgc tgggtggcga gcgcatcgag accggttaca cccccatcga catctccctg

120

tccttgaccc agttcctgct cagcgagttc gtgccaggtg ctggcttcgt gctcggcctg  180

gtggacatca tctggggtat cttcggtcca tcccaatggg acgccttcct ggtgcaaatc  240

gagcagctga tcaaccagag gatcgaagag ttcgccagga accaggccat ctccaggctg

300

gagggcctga gcaacctcta ccaaatctac gccgagagct tcagggagtg ggaggccgac

360

ccgaccaacc cagctctccg cgaggaaatg cgcattcaat tcaacgacat gaacagcgcc

420

ctgaccaccg ctatcccact gttcgccgtc cagaactacc aagtgccgct cctgtccgtg

480

tacgtgcaag ccgctaacct gcacctcagc gtgctgcgcg acgtgagcgt gttcggccaa

540

aggtggggct tcgatgctgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac caggctgatt

600

ggcaactaca ccgaccacgc tgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtctggggt

660

ccggactcca gggactggat caggtacaac cagttcagga gggagttgac cctcaccgtg

720

ctggacattg tgtccctctt cccgaactac gactccagga cctacccgat ccgcaccgtg

780

tcccaactca ccagggagat ctacaccaac ccagtgctgg agaacttcga cggtagcttc

840

cgcggttccg cccagggtat cgagggctcc atcaggagcc cacacctgat ggacatcctg

900

aacagcatca ccatctacac cgacgctcac aggggcgagt actactggtc cggccaccag

960

atcatggcct ccccagtggg cttcagcggc cccgagttca ccttcccgct ctacggcacc

1020

atgggcaacg ccgctccaca gcaacgcatc gtggctcaac tgggtcaggg tgtctacagg

1080

accctgtcct ccaccctgta caggaggccc ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcaactg

1140

tccgtgctcg acggcaccga gttcgcctac ggcacctcct ccaacctgcc atccgctgtc

1200

tacaggaaga gcggcaccgt ggactccctg gacgagatcc caccacagaa caacaacgtg

1260

ccacccaggc aaggcttctc ccacaggctg agccacgtgt ccatgttccg ctccggcttc

1320

agcaacagct ccgtgagcat catcagggct ccgatgttct cctggatcca ccgcagcgct

1380

gagttcaaca acatcatcgc ctccgacagc atcacccaaa tcccggccgt gaagggcaac

1440

ttcctcttca acggttccgt catttccggc ccaggcttca ccggtggcga cctcgtgagg

1500

ctcaacagca gcggcaacaa catccagaac aggggctaca tcgaggtgcc aatccacttc

1560

ccatccacct ccaccaggta cagggtgcgc gtgaggtacg cttccgtgac cccgatccac

1620

ctcaacgtga actggggtaa ctcctccatc ttctccaaca ccgtgccagc taccgctacc

1680

tccctggaca acctccaatc cagcgacttc ggttacttcg agagcgccaa cgctttcacc

1740

tcctccctcg gtaacatcgt gggcgtgagg aacttcagcg gcaccgccgg cgtgatcatc

1800

gacaggttcg agttcatccc agtgaccgcc accctcgagg ctgagtga         1848

<210>2

<211>615

<212>PRT

<213>Artificial

<400>2

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1               5                   10                  15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

            20                  25                  30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

        35                  40                  45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

    50                  55                  60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65                  70                  75                  80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

            85                  90                  95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

        100                 105                 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

    115                 120                 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

    130                 135                 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145                 150                 155                 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

                165                 170                 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

            180                 185                 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

        195                 200                 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

    210                 215                 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225                 230                 235                 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

                245                 250                 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

            260                 265                 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

        275                 280                 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

    290                 295                 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305                 310                 315                 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

                325                 330                 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

            340                 345                 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

        355                 360                 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

    370                 375                 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385                 390                 395                 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

                405                 410                 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

            420                 425                 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

        435                 440                 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

    450                 455                 460

Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn

465                 470                 475                 480

Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly

                485                 490                 495

Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly

            500                 505                 510

Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg

        515                 520                 525

Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn

    530                 535                 540

Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr

545                 550                 555                 560

Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala

                565                 570                 575

Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe

        580                 585                 590

Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val

    595                 600                 605

Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu

610             615

Claims (7)

1.一种DNA分子，其特征是它编码对鳞翅目害虫高抗性的cryIAc基因mcryIAc，该DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

2.一种植物表达载体，其特征是该植物表达载体含有在大肠杆菌和甘蔗中穿梭的双元载体序列和权利要求1中的基因序列。

3.如权利要求2所述的植物表达载体，其特征是，该载体由权利要求1中的基因序列和大肠杆菌和甘蔗中穿梭的双元载体序列构成。

4.一种使单子叶植物产生对鳞翅目害虫抗性的方法，其特征是用权利要求3所述的植物表达载体转化单子叶植物，所述的单子叶植物是甘蔗。

5.权利要求2所述的植物表达载体的应用，其特征是，将权利要求2所述的植物表达载体转化甘蔗。

6.权利要求1所述的DNA分子的应用，其特征是，将权利要求1所述的DNA分子应用于抗鳞翅目害虫，随着CryIAc蛋白表达量的由少到多，杀虫活性也由低变高。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，所述的鳞翅目害虫是螟虫。

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