CN111826390B

CN111826390B - 蛋白质wrky78在调控植物生物胁迫抗性中的应用

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Publication number: CN111826390B
Application number: CN201910247561.4A
Authority: CN
Inventors: 叶健; 徐爽
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN111826390A

Abstract

本发明公开了蛋白质WRKY78在调控植物生物胁迫抗性中的应用。蛋白质WRKY78的氨基酸序列如序列表中序列2所示。提高日本晴中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性，得到转基因水稻甲；与日本晴相比，转基因水稻甲的水稻条纹叶枯病抗性和稻瘟病抗性均显著提高。抑制日本晴中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性，得到转基因水稻乙；与日本晴相比，转基因水稻乙的水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性均显著降低。由此可见，蛋白质WRKY78可以调控植物生物胁迫抗性。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质WRKY78在调控植物生物胁迫抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质WRKY78在调控植物生物胁迫抗性中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，是全世界半数以上人口的主粮。在人类数千年的育种过程中，高产、稳产和优产一直是水稻品种选育的三个重要目标，也是农业生产追求的主要目标。在水稻生产过程中，由于种植方式单一，水稻很容易受到生物胁迫的影响，严重影响水稻的产量与品质。

生物胁迫是指对植物生存与发育不利的各种生物因素的总称，通常是因为感染和竞争所引起，如病害、虫害、杂草危害等。在水稻生产中，病害与虫害是主要农业灾害，它们具有种类多、影响大、时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济，特别是农业生产常造成重大损失。病害与虫害除了各自直接危害农作物，还通过相互影响相互促进造成多种病虫害的共同流行，如一些介体昆虫携带病原物或寄生虫等，造成病毒病害爆发；地下线虫的危害促进植物地上部分真菌病害的流行等。病与虫的双重危害，严重威胁农业生产，严重影响关系国计民生的粮食安全。我国主要的水稻害虫有稻纵卷叶螟、稻飞虱、稻螟虫、稻叶蝉、稻蓟马等，我国重要的水稻病害包括稻瘟病、稻曲病、纹枯病、水稻黑条矮缩病、条纹叶枯病等。水稻多种病虫害频繁爆发，加之化肥、农药的不合理施用与滥用带来的系列农业问题加剧，水稻生产迫切需要更加环保可持续的方法来实现绿色植保的目标，其中提高植物自身的抗性是最根本也是最经济有效的方法。目前提高植物自身的抗性的方法包括以下几种：采用生物工程技术培育抗性品种，如稳定表达苏云金芽孢杆菌的毒素蛋白Bt、各种植物的凝集素等用于抗咀嚼式昆虫；稳定表达病虫必须基因的dsRNA；提高农艺手段，控制栽培密度，控制氮肥使用，保证田间作物健壮成长；根据病害的流行爆发时期，适当早播或迟播来提高植物的生态抗性；利用天敌控制害虫或病毒介体昆虫的种群密度等等。如在农业害虫中，刺吸式口器害虫如粉虱、飞虱、蚜虫、蚧虫、叶螨、蓟马等繁殖快、基数大、传播迅速且危害严重，且大量重要病毒病害通过昆虫媒介远距离快速传播扩散，成为农业生产中的重要限制作用，但目前尚未发现有效的抗刺吸式昆虫的方法。

水稻条纹叶枯病是中国甚至整个东南亚地区水稻所面临的极其重要的病害之一，严重影响水稻的产量，其主要经介体昆虫灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)传播，灰飞虱是危害多种农作物的一种重要迁飞性害虫。日本于20世纪60年代发生水稻条纹叶枯病以来，主要致力于选育抗病毒植株并作推广种植，取得了良好的效果，有效控制了该病的蔓延(陈丹等(2006)上海农业科技：42-44)。从1998年开始，江苏省等地也开始着手选育抗病毒水稻植株；从2005年开始，江苏省、浙江省等地研发推广使用抗病品种水稻，使得水稻条纹病毒的侵害性有所下降(Sun等(2016)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 126:127-139)，但是，这些抗病毒水稻的稻米质量有所下降，品质不够理想，出米率较低(Sasaya等(2014)Frontiers in microbiology 4:409)。目前，部分地区还有不同程度的灾害发生。

稻瘟病是一种严重威胁水稻生产的真菌病害，每年造成生产上损失高达10％-30％(Ebbole等(2007)Annu Rev Phytopathol 45：437-456)。目前控制稻瘟病的主要方式是使用农药和培育稻瘟病抗性品种。在农药使用方面，过多的使用不仅增加了水稻生产的成本，还对环境造成较大的污染。培育稻瘟病抗性品种方面，在提高水稻病害抗性方面做出了重要贡献，然而抗性品种相对质量不高，优质品质一般较感病的现状仍未解决，其次稻瘟病菌生理小种变异快，也说明挖掘新的抗性基因具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提高水稻的生物胁迫抗性，例如水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性、灰飞虱抗性。

本发明首先保护蛋白质WRKY78的应用，可为X1)-X7)中的至少一种：

X1)调控植物生物胁迫抗性；

X2)调控植物植保素的合成；

X3)培育具有生物胁迫抗性的植物；

X4)杀虫和/或杀病毒和/或抑菌；

X5)制备用于杀虫和/或杀病毒和/或抑菌的产品；

X6)防治植物病虫害；

X7)制备用于防治植物病虫害的产品。

本发明还保护编码蛋白质WRKY78的核酸分子的应用，可为X1)-X7)中的至少一种：

X1)调控植物生物胁迫抗性；

X2)调控植物植保素的合成；

X3)培育具有生物胁迫抗性的植物；

X4)杀虫和/或杀病毒和/或抑菌；

X5)制备用于杀虫和/或杀病毒和/或抑菌的产品；

X6)防治植物病虫害；

X7)制备用于防治植物病虫害的产品。

上述应用中，所述调控植物生物胁迫抗性可为提高植物生物胁迫抗性或降低植物生物胁迫抗性。所述调控植物植保素的合成可为促进植物植保素的合成或减少植物植保素的合成。

本发明还保护一种培育转基因植物甲的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物相比，转基因植物甲的生物胁迫抗性提高和/或植保素的合成增加。

上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质WRKY78表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入编码所述蛋白质WRKY78的核酸分子实现。

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码蛋白质WRKY78的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码蛋白质WRKY78的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体可为实施例提及的重组质粒35S:WRKY78-YFP。

所述重组质粒35S:WRKY78-YFP的制备方法如下：(1)人工合成序列表中序列1所示的DNA双链分子并以其作为模板，采用上游引物F：5’-CAAGGGATCCATGGCCGATTCGCCAAACCCTAGCT-3’和下游引物R：5’-CAAGGCGGCCGCCACGGACCCATGACTAAAT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(2)取PCR扩增产物，回收约1880bp的DNA片段；(3)将DNA片段和pENTR-3C克隆载体通过T4DNA连接酶进行连接，得到中间载体；(4)将中间载体和pH7-WG2Y载体进行LR反应，得到重组质粒35S:WRKY78-YFP。重组质粒35S:WRKY78-YFP含有序列表中序列1所示的DNA双链分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质WRKY78。

所述转基因植物甲具体可为实施例提及的WRKY78-OX1和WRKY78-OX2。

本发明还保护一种培育转基因植物乙的方法，可包括如下步骤：抑制出发植物中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物相比，转基因植物乙的生物胁迫抗性降低和/或植保素的合成减少。

上述方法中，所述“抑制出发植物中蛋白质WRKY78的表达量和/或活性”可通过基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除等本领域熟知的方法，达到抑制蛋白质WRKY78的表达量和/或活性的目的。

所述转基因植物乙具体可为实施例提及的水稻敲低WRKY78基因的突变体wrky78#6和wrky78#8。wrky78#6和wrky78#8是OsWRKY78-RNAi植株(记载于如下文献中：Chang-QuanZhang，Yong Xu，YanLu，Heng-Xiu Yu，Ming-Hong Gu，Qiao-QuanLiu.The WRKYtranscription factor OsWRKY78regulates stem elongation and seed developmentin rice.Planta 234：541-554.，在文献中的名称为“OsWRKY78-RNAi plants”)自交一代获得的。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中蛋白质WRKY78的含量和/或活性，从而提高植物生物胁迫抗性和/或促进植物植保素的合成。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：降低植物中蛋白质WRKY78的含量和/或活性，从而降低植物生物胁迫抗性和/或减少植物植保素的合成。

上述任一所述蛋白质WRKY78可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物生物胁迫抗性和/或植物植保素合成相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由618个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述任一所述编码蛋白质WRKY78的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码蛋白质WRKY78的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码蛋白质WRKY78的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1857个核苷酸组成，序列表中序列1所示的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质WRKY78的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质WRKY78的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质WRKY78，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质WRKY78的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一植物病虫害可为植物病毒病害、植物菌病害和植物虫害中的至少一种。

上述任一所述病毒具体可为水稻条纹叶枯病毒。

上述任一所述菌具体可为真菌。所述真菌具体可为稻瘟菌。

上述任一所述虫具体可为灰飞虱。

上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴。

上述任一所述水稻病毒病害具体可为水稻条纹叶枯病。

上述任一所述水稻菌病害具体可为水稻稻瘟病。

上述任一所述水稻虫害具体可为由灰飞虱引起的虫害(如水稻条纹叶枯病)。

上述任一所述生物胁迫抗性为水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性中的至少一种。

上述任一所述水稻植保素的合成是通过检测OsKS4基因的表达量实现的。如果与出发植物相比，转基因植物中OsKS4基因的表达量提高，则植保素的合成增加，即促进植保素的合成。如果与出发植物相比，转基因植物中OsKS4基因的表达量降低，则植保素的合成减少。

实验证明，向水稻品种日本晴中导入重组质粒35S:WRKY78-YFP，得到T₂代纯合转WRKY78基因水稻；与水稻品种日本晴相比，T₂代纯合转WRKY78基因水稻的稻瘟病抗性和水稻条纹叶枯病抗性均显著提高。与水稻品种日本晴相比，水稻敲低WRKY78基因的突变体wrky78#6和wrky78#8的稻瘟病抗性、水稻条纹叶枯病抗性和灰飞虱的抗性均显著降低，水稻敲低WRKY78基因的突变体wrky78#6和wrky78#8的cDNA中OsKS4基因的相对表达量均显著降低。由此可见，蛋白质WRKY78可以调控植保素的合成，进而调控植物生物胁迫抗性。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测T₂代转WRKY78基因水稻的cDNA中WRKY78基因的相对表达量。

图2为T₂代转WRKY78基因水稻对水稻条纹叶枯病毒的抗性检测结果。

图3为T₂代转WRKY78基因水稻对水稻稻瘟病的抗性检测结果。

图4为实时荧光定量PCR检测水稻敲低WRKY78基因的突变体的cDNA中WRKY78基因的相对表达量。

图5为水稻敲低WRKY78基因的突变体对水稻条纹叶枯病毒的抗性检测结果。

图6为水稻敲低WRKY78基因的突变体对水稻稻瘟病的抗性检测结果。

图7为水稻敲低WRKY78基因的突变体的灰飞虱选择偏好性实验结果。

图8为实时荧光定量PCR检测水稻敲低WRKY78基因的突变体的cDNA中OsKS4基因的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pENTR-3C克隆载体为invitrogen公司的产品。根癌农杆菌EHA105为博迈德(Biomed)生物公司的产品。潮霉素为Inolco公司的产品。

pH7-WG2Y载体为向pH7-WG2载体(Invitrogen公司)的限制性内切酶PstⅠ和BamHⅠ的识别位点之间插入序列表中序列3所示的DNA双链分子(即YFP标签序列)，得到的重组质粒。pH7-WG2Y载体所带的筛选抗性基因为潮霉素基因。

WRKY78基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列表中序列2所示的蛋白质WRKY78。

下述实施例中所用的灰飞虱最初捕获于江苏地区田间，收集第一代若虫扩大繁殖作为无毒灰飞虱。参照霍等(2016)方法(Huo等(2016)Journal of virological methods235：139-143)进行人工饲毒使无毒灰飞虱携带RSV，获得带毒灰飞虱。将带毒灰飞虱饲养在养虫瓶中，以水稻为寄主植物进行人工养殖。养殖室内温度25℃，相对湿度65％，光照周期为16h光照/8h黑暗。

实施例1、转WRKY78基因水稻的水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性提高

一、重组质粒35S:WRKY78-YFP的构建

1、人工合成序列表中序列1所示的DNA双链分子并以其作为模板，采用上游引物F：5’-CAAGGGATCCATGGCCGATTCGCCAAACCCTAGCT-3’和下游引物R：5’-CAAGGCGGCCGCCACGGACCCATGACTAAAT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、完成步骤1后，取所述PCR扩增产物，回收约1880bp的DNA片段。

3、将步骤2回收的DNA片段和pENTR-3C克隆载体通过T4DNA连接酶进行连接，得到中间载体。

4、完成步骤3后，将中间载体和pH7-WG2Y载体进行LR反应，得到重组质粒35S:WRKY78-YFP。

将重组质粒35S:WRKY78-YFP进行测序。测序结果表明，重组质粒35S:WRKY78-YFP含有序列表中序列1所示的DNA双链分子(WRKY78基因)。重组质粒35S:WRKY78-YFP表达序列表中序列2所示的蛋白质WRKY78。

二、T₂代纯合转WRKY78基因水稻的获得

1、采用电激转化法，将重组质粒35S:WRKY78-YFP导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/35S:WRKY78-YFP。

2、通过农杆菌介导的遗传转化方法(Qu等(2008)J Exp Bot59(9):2417-2424)将EHA105/35S:WRKY78-YFP转化至水稻品种日本晴(水稻品种日本晴以下简称日本晴)(以潮霉素作为筛选剂)，得到T₀代拟转WRKY78基因水稻植株。

3、完成步骤2后，将T₀代拟转WRKY78基因水稻植株进行单株收种，得到T₁代拟转WRKY78基因水稻种子。

4、将T₁代拟转WRKY78基因水稻种子播种于含50mg/mL潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的水稻(抗性苗)的数目与不能够正常生长的水稻(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为WRKY78基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₂代转WRKY78基因水稻种子。

5、将T₂代转WRKY78基因水稻种子播种于含50mg/mL潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₂代纯合转WRKY78基因水稻。将其中2个T₂代纯合转WRKY78基因水稻株系分别命名为WRKY78-OX1和WRKY78-OX2。

三、实时荧光定量PCR检测WRKY78基因的相对表达量

待测水稻种子为WRKY78-OX1的T2代种子、WRKY78-OX2的T2代种子或日本晴的种子。

1、将待测水稻种子播种于MS固体培养基上，28℃光暗交替培养2周，得到待测水稻植株。

2、提取待测水稻植株叶片的RNA，然后反转录，得到待测水稻植株的cDNA。

3、以待测水稻植株的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测WRKY78基因的相对表达量(以OsACTIN2基因为内参基因)。

鉴定WRKY78基因的引物为5’-CGTGAGTCAACTCTCGCAGT-3’和5’-CTTCAGCAGGTGAGCTGTCA-3’。

鉴定OsACTIN2基因的引物为5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’和5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。

将日本晴的cDNA中WRKY78基因的相对表达量作为1，WRKY78-OX1的cDNA和WRKY78-OX2的cDNA中WRKY78基因的相对表达量见图1。结果表明，日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株的cDNA中WRKY78基因的相对表达量均显著提高。

四、T₂代纯合转WRKY78基因水稻对水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)的抗性检测

1、将待测水稻种子播种于装有营养土的小盆中，28℃光暗交替培养，得到生长至三叶期的待测水稻植株。每个小盆种4粒种子，共种6盆。

2、完成步骤1后，采用罩笼法进行水稻抗病毒实验。具体步骤如下：

(1)用直径为6.5cm、高度为30cm的透明笼罩于小盆中待测水稻植株周围，再放入12头3-4龄带毒灰飞虱若虫，将透明笼上面用纱布封口。

(2)完成步骤(1)5天后，去除待测水稻植株上的灰飞虱；在去除灰飞虱的9天后提取待测水稻植株叶片的RNA，然后反转录，得到待测水稻植株的cDNA；以待测水稻植株的cDNA为模板，通过荧光定量PCR分别检测RSV的CP基因和SP基因的相对表达量(以OsACTIN2基因为内参基因)。RSV中，CP基因和SP基因的表达量较高，分别编码衣壳蛋白和病害特异蛋白。

鉴定RSV的CP基因的引物为5’-GACAAGAAGAAGGAAGAag-3’和5’-ATCGTATTGACAGACATA-3’。

鉴定RSV的SP基因的引物为5’-CTGCCTGAGACTGTTAGCGA-3’和5’-GTGTCAGTCTCCAAGGGGTG-3’。

RSV的CP基因的相对表达量检测结果见图2中A：与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株上CP基因的相对表达量显著降低。RSV的SP基因的相对表达量检测结果见图2中B：与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株上SP基因的相对表达量显著降低。由此可见，与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株体内含有的RSV滴度更低。

上述结果表明，与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株对RSV的抗性均显著提高。

五、T₂代纯合转WRKY78基因水稻对稻瘟病的抗性检测

2、完成步骤1后，采用温箱法进行水稻抗稻瘟病实验。具体步骤如下：

(1)将所有小盆置于透明箱(长65cm，宽38cm，高50cm)，然后在叶片表面均匀喷施稻瘟菌孢子悬浮液(稻瘟菌孢子悬浮液中稻瘟菌孢子的浓度约为10⁵-10⁶个/ml，所有小盆的喷施总量约为30mL)，用保鲜膜覆盖透明箱(目的为维持箱内高湿环境)。

(2)完成步骤(1)后，取所述透明箱，先置于28℃黑暗处理1天，然后28℃光暗交替培养(光照周期为16h光照/8h黑暗)5天。

(3)完成步骤(2)后，观察稻瘟病发病情况。

实验结果见图3中A(标尺为20mm)。结果表明，与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株上的叶片病斑较小且数量较少，稻瘟病发病症状较轻。

(4)完成步骤(2)后，提取待测水稻植株叶片的RNA，然后反转录，得到待测水稻植株的cDNA；以待测水稻植株的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测MoPot基因(稻瘟菌管家基因)的相对表达量(以OsACTIN2基因为内参基因)。用MoPot基因的相对表达量表征稻瘟菌生物量。

鉴定MoPot基因的引物为MoPot-q-F：5’-ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG-3’和MoPot-q-R：5’-AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT-3’。

稻瘟菌生物量的检测结果见图3中B：与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株上含有的稻瘟菌生物量均显著降低。结果表明，与日本晴相比，WRKY78-OX1的T2代植株和WRKY78-OX2的T2代植株对稻瘟病的抗性均显著提高。

实施例2、水稻敲低WRKY78基因的突变体的水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性降低

wrky78#6和wrky78#8是OsWRKY78-RNAi植株自交一代获得的水稻敲低WRKY78基因的突变体。OsWRKY78-RNAi植株记载于如下文献中：Chang-Quan Zhang，Yong Xu，YanLu，Heng-Xiu Yu，Ming-Hong Gu，Qiao-QuanLiu.The WRKY transcription factorOsWRKY78regulates stem elongation and seed development in rice.Planta 234：541-554.，在文献中的名称为“OsWRKY78-RNAi plants”。wrky78#6和wrky78#8均由扬州大学刘巧泉教授提供。

一、实时荧光定量PCR检测WRKY78基因的相对表达量

待测水稻种子为wrky78#6的种子、wrky78#8的种子或日本晴的种子。

1、同实施例1步骤三中1。

2、同实施例1步骤三中2。

3、同实施例1步骤三中3。

统计日本晴的cDNA、wrky78#6的cDNA和wrky78#8的cDNA中WRKY78基因的相对表达量。实验结果见图4。结果表明，与日本晴相比，wrky78#6和wrky78#8的cDNA中WRKY78基因的相对表达量均显著降低。

二、水稻敲低WRKY78基因的突变体对水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)的抗性检测

1、同实施例1步骤四中1。

(2)完成步骤(1)5天后，观察待测水稻植株的地上部分表型和叶片表型。

地上部分表型见图5中A(标尺为3cm)。叶片表型见图5中B(标尺为20mm)。结果表明，与日本晴相比，wrky78#6和wrky78#8的株高显著降低，叶片发病情况明显加重。

3、同实施例1步骤四中2。

RSV的SP基因的相对表达量检测结果见图5中C：与日本晴相比，wrky78#6的植株和wrky78#8的植株上SP基因的相对表达量显著增加。RSV的CP基因的相对表达量检测结果见图5中D：与日本晴相比，wrky78#6的植株和wrky78#8的植株上CP基因的相对表达量显著增加。由此可见，与日本晴相比，wrky78#6的植株和wrky78#8的植株体内含有的RSV滴度更高。

上述结果表明，与日本晴相比，wrky78#6的植株和wrky78#8的植株对RSV的抗性均显著降低。

三、水稻敲低WRKY78基因的突变体对稻瘟病的抗性检测

(3)完成步骤(2)后，提取待测水稻植株叶片的RNA，然后反转录，得到待测水稻植株的cDNA；以待测水稻植株的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测MoPot基因(稻瘟菌管家基因)的相对表达量(以OsACTIN2基因为内参基因)。用MoPot基因的相对表达量表征稻瘟菌生物量。

鉴定OsACTIN2基因的引物为5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’和5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。稻瘟菌生物量的检测结果见图6：与日本晴相比，wrky78#6的植株和wrky78#8的植株上含有的稻瘟菌生物量均显著增加。

上述结果表明，与日本晴相比，wrky78#6的植株和wrky78#8的植株对稻瘟病的抗性均显著降低。

四、水稻敲低WRKY78基因的突变体对水稻条纹叶枯病毒媒介昆虫灰飞虱的抗性检测

1、取装有营养土的小盆，分为两侧，一侧播种3粒日本晴的种子，另一侧播种3粒wrky78#6的种子或wrky78#8的种子；然后28℃光暗交替培养，得到生长至三叶期的水稻植株。共种6盆。

2、完成步骤1后，采用罩笼法进行灰飞虱取食偏好性实验。具体步骤如下：

(1)用直径为6.5cm、高度为30cm的透明笼罩于小盆中水稻植株周围，再将60头3-4龄带毒灰飞虱若虫随机放在水稻植株上(每株水稻植株上放10头)，将透明笼上面用纱布封口。

(2)完成步骤(1)24h后，统计各株水稻植株上灰飞虱的头数，并按组取平均值。

实验装置图见图7中A。实验结果见图7中B和C。结果表明，放虫24h后，与日本晴相比，wrky78#6或wrky78#8上停留灰飞虱头数均较多。这说明灰飞虱在放入装置24h后更偏好取食wrky78#6或wrky78#8，即WRKY78基因对灰飞虱的取食产生不利影响。目前，多数昆虫学家认为植物的抗虫性包括三种类型：抗生性、趋避性和耐害性。趋避性是指某些作物品种本身具有某些物理性形态或化学性生理特性，表现出对某些害虫具有拒降落、拒取食、拒产卵、拒栖息等特性。本实验说明了WRKY78基因能够降低媒介昆虫灰飞虱的取食，初步表明WRKY78基因对灰飞虱产生趋避性作用。WRKY78基因的抗虫作用也从一方面解释了T2代转WRKY78基因水稻具有抗水稻条纹叶枯病毒的效果。

五、实时荧光定量PCR检测OsKS4基因的相对表达量

2、完成步骤1后，采用罩笼法用无毒灰飞虱处理水稻。具体步骤如下：

(1)用直径为6.5cm、高度为30cm的透明笼罩于小盆中待测水稻植株周围，再放入12头3-4龄无毒灰飞虱若虫，将透明笼上面用纱布封口。

(2)完成步骤(1)1天后，提取待测水稻植株叶片的RNA，然后反转录，得到待测水稻植株的cDNA；以待测水稻植株的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测OsKS4基因的相对表达量(以OsACTIN2基因为内参基因)。

鉴定OsKS4基因的引物为5’-GGTTGCTGGTCAGGTAGCTT-3’和5’-AGGTTCCAGCGTGGCATAAA-3’。

将日本晴的cDNA中OsKS4基因的相对表达量作为1，wrky78#6的cDNA和wrky78#8的cDNA中OsKS4基因的相对表达量见图8。结果表明，与日本晴相比，wrky78#6和wrky78#8的cDNA中OsKS4基因的相对表达量均显著降低。已有研究表明OsKS4基因是水稻植保素合成的重要基因，且合成的植保素具有多种生物抗性作用。由此可见，水稻WRKY78基因可能响应无毒灰飞虱取食，激活OSKS4的表达，从而正调控植保素的合成，起到多种抗性的作用。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 蛋白质WRKY78在调控植物生物胁迫抗性中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1857

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

atggccgatt cgccaaaccc tagctccggt gaccaccccg cgggcgtcgg cgggtcgccg 60

gagaagcagc ccccggtgga tcggcgcgtc gcggcgctcg ccgcgggcgc ggcgggcgcg 120

ggggcgaggt acaaggcgat gtcccccgcg cggctgccga tctcgcggga gccctgcctc 180

accatccccg cgggcttcag cccctcggct ctcctcgagt cccccgtcct cctcaccaac 240

ttcaaggttg aaccctctcc gacaactggt actctgagca tggctgcaat tatgaacaag 300

agtgcaaatc cagacatact tccttcgcct agggataaaa catctggtag cacccatgaa 360

gatggtggct ctcgagattt tgaattcaag cctcatctga attcatcctc tcaatcgacg 420

gcttctgcta tcaatgatcc caaaaagcat gaaacttcta tgaaaaatga aagcctgaat 480

actgccctgt catctgacga tatgatgatc gacaatatac ctctatgttc tcgtgagtca 540

actctcgcag tcaatatttc aagtgccccg agccaactgg ttggaatggt tggtttaact 600

gacagctcac ctgctgaagt tggtacatct gagttgcatc agatgaatag ctctggaaat 660

gctatgcagg agtcacagcc tgaaagtgtg gctgaaaagt ctgcagagga tggttataac 720

tggcgcaaat atgggcaaaa gcatgttaag ggaagtgaga acccgagaag ctattacaag 780

tgcacacatc ctaactgtga tgtaaaaaag ctattggagc gttcgcttga tggtcagatt 840

actgaagtgg tttataaagg gcgtcacaat caccctaagc cccaacccaa taggaggctg 900

tctgccggtg cagttcctcc aatccagggt gaagaaagat atgatggtgt ggcaactact 960

gatgacaaat cttcaaatgt tcttagcatt cttggtaatg cagtacatac agctggtatg 1020

attgagcctg ttccaggctc agctagtgat gatgacaatg atgccggagg agggagacct 1080

taccctggag atgatgctgt tgaggatgat gatttagagt caaaacgaag gaaaatggaa 1140

tctgctgcta ttgatgctgc tttgatgggc aagcctaacc gtgagcctcg tgttgtagta 1200

caaacggtta gtgaggttga catcttggat gatgggtacc gctggcgcaa gtatggccag 1260

aaagtagtta aaggaaaccc caatccacgg agttactaca agtgcacaaa tacaggatgc 1320

ccagtcagga agcatgttga gagagcatca catgatccaa aatcagtcat aacaacatat 1380

gaaggaaaac ataaccatga agtccctgcg tcgaggaatg cgagccatga gatgtccact 1440

ccccccatga agcctgttgt ccatccaatt aacagcaata tgcagggcct tggtggcatg 1500

atgagagcat gtgaacctag gacatttcca aaccaatatt ctcaagcagc tgaaagtgac 1560

accatcagcc ttgatcttgg tgttggaatc agcccgaacc acagcgatgc cacaaaccaa 1620

ttgcagtcct cagtttctga tcagatgcag tatcaaatgc agcccatggg ttcagtatac 1680

agtaatatgg gacttccagc aatggcaatg ccgactatgg ctggcaatgc agctagcaat 1740

atatatggtt cgagagaaga aaaacctagt gaaggtttta ctttcaaagc cacaccgatg 1800

gaccattcgg ctaacttatg ctacagtacc gccggcaatt tagtcatggg tccgtga 1857

<210> 2

<211> 618

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

Met Ala Asp Ser Pro Asn Pro Ser Ser Gly Asp His Pro Ala Gly Val

1 5 10 15

Gly Gly Ser Pro Glu Lys Gln Pro Pro Val Asp Arg Arg Val Ala Ala

20 25 30

Leu Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Arg Tyr Lys Ala Met Ser

35 40 45

Pro Ala Arg Leu Pro Ile Ser Arg Glu Pro Cys Leu Thr Ile Pro Ala

50 55 60

Gly Phe Ser Pro Ser Ala Leu Leu Glu Ser Pro Val Leu Leu Thr Asn

65 70 75 80

Phe Lys Val Glu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Thr Leu Ser Met Ala Ala

85 90 95

Ile Met Asn Lys Ser Ala Asn Pro Asp Ile Leu Pro Ser Pro Arg Asp

100 105 110

Lys Thr Ser Gly Ser Thr His Glu Asp Gly Gly Ser Arg Asp Phe Glu

115 120 125

Phe Lys Pro His Leu Asn Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ala Ile

130 135 140

Asn Asp Pro Lys Lys His Glu Thr Ser Met Lys Asn Glu Ser Leu Asn

145 150 155 160

Thr Ala Leu Ser Ser Asp Asp Met Met Ile Asp Asn Ile Pro Leu Cys

165 170 175

Ser Arg Glu Ser Thr Leu Ala Val Asn Ile Ser Ser Ala Pro Ser Gln

180 185 190

Leu Val Gly Met Val Gly Leu Thr Asp Ser Ser Pro Ala Glu Val Gly

195 200 205

Thr Ser Glu Leu His Gln Met Asn Ser Ser Gly Asn Ala Met Gln Glu

210 215 220

Ser Gln Pro Glu Ser Val Ala Glu Lys Ser Ala Glu Asp Gly Tyr Asn

225 230 235 240

Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys His Val Lys Gly Ser Glu Asn Pro Arg

245 250 255

Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Pro Asn Cys Asp Val Lys Lys Leu Leu

260 265 270

Glu Arg Ser Leu Asp Gly Gln Ile Thr Glu Val Val Tyr Lys Gly Arg

275 280 285

His Asn His Pro Lys Pro Gln Pro Asn Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ala

290 295 300

Val Pro Pro Ile Gln Gly Glu Glu Arg Tyr Asp Gly Val Ala Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asp Lys Ser Ser Asn Val Leu Ser Ile Leu Gly Asn Ala Val His

325 330 335

Thr Ala Gly Met Ile Glu Pro Val Pro Gly Ser Ala Ser Asp Asp Asp

340 345 350

Asn Asp Ala Gly Gly Gly Arg Pro Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Val Glu

355 360 365

Asp Asp Asp Leu Glu Ser Lys Arg Arg Lys Met Glu Ser Ala Ala Ile

370 375 380

Asp Ala Ala Leu Met Gly Lys Pro Asn Arg Glu Pro Arg Val Val Val

385 390 395 400

Gln Thr Val Ser Glu Val Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg

405 410 415

Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr

420 425 430

Tyr Lys Cys Thr Asn Thr Gly Cys Pro Val Arg Lys His Val Glu Arg

435 440 445

Ala Ser His Asp Pro Lys Ser Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His

450 455 460

Asn His Glu Val Pro Ala Ser Arg Asn Ala Ser His Glu Met Ser Thr

465 470 475 480

Pro Pro Met Lys Pro Val Val His Pro Ile Asn Ser Asn Met Gln Gly

485 490 495

Leu Gly Gly Met Met Arg Ala Cys Glu Pro Arg Thr Phe Pro Asn Gln

500 505 510

Tyr Ser Gln Ala Ala Glu Ser Asp Thr Ile Ser Leu Asp Leu Gly Val

515 520 525

Gly Ile Ser Pro Asn His Ser Asp Ala Thr Asn Gln Leu Gln Ser Ser

530 535 540

Val Ser Asp Gln Met Gln Tyr Gln Met Gln Pro Met Gly Ser Val Tyr

545 550 555 560

Ser Asn Met Gly Leu Pro Ala Met Ala Met Pro Thr Met Ala Gly Asn

565 570 575

Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Gly Ser Arg Glu Glu Lys Pro Ser Glu Gly

580 585 590

Phe Thr Phe Lys Ala Thr Pro Met Asp His Ser Ala Asn Leu Cys Tyr

595 600 605

Ser Thr Ala Gly Asn Leu Val Met Gly Pro

610 615

<210> 3

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

Claims

1.蛋白质WRKY78的应用，为X1)-X3)中的至少一种：

X1)提高水稻生物胁迫抗性；

X2)促进水稻植保素的合成；

X3)培育具有生物胁迫抗性的水稻；

所述生物胁迫抗性为水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性中的至少一种；

所述蛋白质WRKY78为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1中所述蛋白质WRKY78的核酸分子的应用，为X1)-X3)中的至少一种：

X1)提高水稻生物胁迫抗性；

X2)促进水稻植保素的合成；

X3)培育具有生物胁迫抗性的水稻；

所述生物胁迫抗性为水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性中的至少一种。

3.一种培育转基因水稻甲的方法，包括如下步骤：提高水稻中权利要求1中所述蛋白质WRKY78的表达量和/或活性，得到转基因水稻甲；与出发水稻相比，转基因水稻甲的生物胁迫抗性提高和/或植保素的合成增加；

4.一种培育转基因水稻乙的方法，包括如下步骤：抑制水稻中权利要求1中所述蛋白质WRKY78的表达量和/或活性，得到转基因水稻乙；与出发水稻相比，转基因水稻乙的生物胁迫抗性降低和/或植保素的合成减少；

5.一种水稻育种方法，包括如下步骤：增加水稻中权利要求1中所述蛋白质WRKY78的含量和/或活性，从而提高水稻生物胁迫抗性和/或促进水稻植保素的合成；

6.一种水稻育种方法，包括如下步骤：降低水稻中权利要求1中所述蛋白质WRKY78的含量和/或活性，从而降低水稻生物胁迫抗性和/或减少水稻植保素的合成；所述生物胁迫抗性为水稻条纹叶枯病抗性、稻瘟病抗性和灰飞虱抗性中的至少一种。