CN106906167A

CN106906167A - 一株生防用解淀粉芽胞杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106906167A
Application number: CN201710280411.4A
Authority: CN
Inventors: 任争光; 魏艳敏; 陈勇; 张伟; 孔兵兵; 赵晓燕; 尚巧霞; 李永强
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing Jingxin Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2037-04-26
Also published as: CN106906167B

Abstract

本发明提供了一株生防用解淀粉芽胞杆菌及其应用。本发明的解淀粉芽胞杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12742。本发明的解淀粉芽胞杆菌可用于制备针对植物病原真菌和病原细菌的生防菌剂和微生物菌肥。本发明的解淀粉芽胞杆菌对植物病原真菌和病原细菌具有较强的抑菌活性，并且具有较宽的抑菌谱。

Description

一株生防用解淀粉芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株生防用解淀粉芽胞杆菌及其应用。

背景技术

近年来，化学农药的大量使用，造成3R问题(抗药性，农药残留和有害生物再猖獗)突出。特别是随着人们生活水平的提高，对农产品的品质要求越来越高，高毒的化学农药在农业生产中的应用也越来越受到限制。因此人们迫切需要一种绿色，安全，高效的防治植物病虫害的方式，而生物防治将是解决这一问题的重要途径。

芽胞杆菌(Bacillus sp.)是一种革兰氏阳性细菌。因其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌生长的代谢物，又能够产生抗逆性强(如耐热、耐旱、抗紫外线等)的芽胞，成为了理想的生防菌筛选对象。研究表明，目前应用于防治植物病害的芽胞杆菌属细菌主要有解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)和多粘芽胞杆菌(B.polymyxa)等。其中，解淀粉芽胞杆菌是生防菌中研究最多的一类，其特点是在自然界中分布广泛，产生的次生代谢产物种类多，抑菌活性强、抑菌谱广等，在植物病害的田间防治中也得到了应用和重视。另外解淀粉芽孢杆菌还具有诱导植物产生抗性、促进植物生长的功能，生防潜力巨大。生防解淀粉芽孢杆菌资源丰富，但不同株系间的生防能力具有一定差异，需要深入挖掘和充分开发利用。

发明内容

本发明提供了一株生防用解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其应用。

本发明的解淀粉芽胞杆菌分离于北京市平谷区桃树根围土壤中，命名为X1-b，已于2016年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.12742。X1-b在NA培养基上培养48h后形成乳白色圆形菌落，不透明，边缘不整齐，菌落上褶皱状突起，内部呈环状凹陷。油镜下观察为杆状细胞，细胞为1.07～1.25μm×2.37～3.09μm。

本发明的解淀粉芽胞杆菌具有针对植物病原真菌和植物病原细菌的抑菌活性。所述植物病原真菌为芸苔链格孢Alternaria brassicae、细极链格孢Alternariatenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、白腐盾壳霉菌Coniothyriumdiplodiella、大斑凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、围小丛壳菌Glomerella cingulata、棒形拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、意大利青霉Penicillium italicum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、藤仓镰刀菌Fusarium fujikuroi、茎点霉属Phoma sp.和苹果黑腐皮壳菌Valsa mali；所述植物病原细菌为醋酸杆菌Acetobacter malorum、西瓜食酸菌Acidovorax citrulli、葡糖杆菌Gluconobacter oxydans、胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、丁香假单胞杆菌斑生致病变种Pseudomonas syringae pv maculicola。

本发明的解淀粉芽胞杆菌可用于制备针对植物病原真菌和植物病原细菌的生防菌剂或微生物菌肥。

其中，所述植物病原真菌为芸苔链格孢Alternaria brassicae、细极链格孢Alternaria tenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、白腐盾壳霉菌Coniothyrium diplodiella、大斑凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、围小丛壳菌Glomerella cingulata、棒形拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、意大利青霉Penicillium italicum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、藤仓镰刀菌Fusarium fujikuroi、茎点霉属Phoma sp.和苹果黑腐皮壳菌Valsa mali；所述植物病原细菌为醋酸杆菌Acetobacter malorum、西瓜食酸菌Acidovorax citrulli、葡糖杆菌Gluconobacter oxydans、胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、丁香假单胞杆菌斑生致病变种Pseudomonas syringae pv maculicola。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCC No.12742在制备抗生素中的应用也属于本发明的保护范围。

所述抗生素为合成表面活性素(surfactin)、杆菌霉素(bacillomycin)、丰原素(fengycin)和/或抗霉枯草菌素(mycosubtilin)。

本发明还提供了针对植物病原真菌和植物病原细菌的生防菌剂微生物菌肥，其中所述生防菌剂的活性成分为本发明的解淀粉芽胞杆菌。

本发明的解淀粉芽胞杆菌具有对植物病原真菌和植物病原细菌的抑菌活性并且具有较宽的抑菌谱。

附图说明

图1为X1-b的革兰氏染色(图a)和芽胞染色结果(图b)(100倍油镜下观察)。

图2为拮抗菌X1-b鞭毛染色。

图3 X1-b的16S rDNA扩增电泳图；

图注：图中M为marker,1分别为X1-b。

图4、细菌X1-b gyrB基因扩增电泳图

图注：图中M为marker,1分别为X1-b。

图5为生防菌液对黄瓜绵腐病的防治效果。

图6为生防菌液对柑橘青霉病的防治效果。

图7为解淀粉芽胞杆菌X1-b合成的4种抗菌肽基因簇示意图；

图注：A：表面活性素；B：杆菌霉素；C：丰原素；D：抗霉枯草菌素。

具体实施方式

实施例1.拮抗细菌X1-b的分离及鉴定

一、菌株X1-b的分离

拮抗细菌X1-b菌株分离自北京市平谷区桃树根围土壤，

分离方法：土壤溶液梯度稀释法

称取0.5g桃树根围土壤溶于50mL的灭菌水中，用灭菌水梯度稀释，最后涂在NA(牛肉膏蛋白胨)培养基上。28℃培养2d(天)。

用灭菌牙签挑取上诉培养的菌落，置于放有靶标病原真菌—苹果树皮腐烂病菌(Valsa mali)的PDA培养基上。25℃培养3～5d，检查各细菌对病原真菌的抑菌带宽度。结果筛选到苹果树皮腐烂病菌有较强活性的生防菌命名为菌株X1-b。

二、菌株X1-b的鉴定

1、芽胞杆菌X1-b的形态观察及部分生理生化鉴定

1)菌落形态观察

将纯化的X1-b菌株划线接种于NA培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，琼脂条17g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃高压灭菌15min。)上，28℃培养48h。观察平板菌落特征，包括色泽、平滑或有褶皱、致密或疏松、质地、边缘沟纹等形态。

2)革兰氏染色

A、染色试剂

(1)草酸铵结晶紫染液

甲液：结晶紫2.0g，乙醇(95％)20mL

乙液：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL

将甲、乙两液相混合，静置48h后使用

(2)卢哥尔氏碘液

碘片1g,KI 2g，蒸馏水300mL；

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘单质溶于浓碘化钾溶液中，待碘完全溶解后再加水稀释至300mL。

(3)脱色剂：95％的乙醇

(4)复染剂：0.5％的蕃红水溶液：蕃红O乙醇液(2.5％)20m1，蒸馏水80m1，可将2.5％蕃红O乙醇液作为母液，贮存在棕色瓶中，使用时再稀释。

B、染色方法

取X1-b菌株接种于NB培养基(NB(营养肉汤培养基)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃高压灭菌15min。)中，28℃培养过夜，取0.1mL，在载玻片上涂片、干燥和固定。

(1)初染：用结晶紫覆盖载玻片1min，水洗。

(2)媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖1min，水洗。

(3)脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95％乙醇滴洗至流出乙醇刚刚不出现紫色为止，约20～30s，立即用水冲净乙醇。

(4)复染：用蕃红液染1～2min，水洗。

(5)镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

3)芽胞染色

A、芽胞染色液

(1)孔雀绿染液：孔雀绿5g，蒸馏水100mL。

(2)蕃红水溶液：蕃红0.5g，蒸馏水100m1。

B、染色方法

分别取培养48h的X1-b菌株培养液0.l mL在载玻片上涂片，干燥，固定。滴加3-5滴孔雀绿染液于己固定的涂片上。用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿使沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4～5min。倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用蕃红水溶液复染1min，水洗。待干燥后，置油镜下观察，芽胞呈绿色，菌体呈红色。

4)鞭毛染色与夹馍染色

A、鞭毛染色液

A液：丹宁酸5.0g，FeCl₃ 1.5g，福尔马林(15％)2.0mL，氨水5mL，NaOH(1％)1.0mL,蒸馏水100mL。

B液：AgNO₃ 2g，蒸馏水100mL。

将AgNO₃溶解后，取出10mL备用，向其余的90mL AgNO₃溶液中慢慢滴入浓氢氧化铵，则形成很浑厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵并不断摇动试液到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再用备用的硝酸银慢慢回滴，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。

将X1-b菌株接种于NA平板上培养过夜。挑取平板菌种培养物于盛有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余的菌液，室温自然干燥。涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再用B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂片出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。干燥后用油镜观察，观察时，可从玻片的一段逐渐移至另一端，油镜下观察鞭毛。

夹馍染色：使用培养2d的X1-b NA平板培养物，取菌落溶于无菌水中并涂片，在空气中自然干燥，注意不可加热干燥固定。用1％的结晶紫水溶液染色2min，以20％的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液，干后用油镜观察。

5)运动性检测

用接种针穿刺接种，将菌种接种到检测培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂6g，蒸馏水1000mL，pH＝7.2，121℃高压灭菌15min)上，28℃培养4d，接种后每24h目测观察生长情况。若生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，则表示试验菌株有运动性，为阳性。

6)好气性检测

将X1-b NA斜面培养物中加入无菌水约2mL，制成菌悬液。将装有NA的试管加热融化并保温5～10min。将试管取出置室温静置冷却至45～50℃时，用移液器向每个试管中加300μL菌悬液，之后双手快速搓动试管，避免振荡使过多空气混入培养基，待菌体均匀分布于培养基内后，将试管至于冰浴中，使琼脂迅速凝固。最后将试管之于28℃温室中静置保温48h后开始连续进行观察，直至结果清晰为止。

7)V-P测定

将X1-b菌种接种于V-P测定培养基(蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 5g，水1000mL，pH7.0～7.2，每管分装4～5mL，121℃高压灭菌15min)中，28℃培养2d后向试管中加1mL 40％NaOH和1mL 5％α-萘酚，充分混匀，10min后变红者为V-P反应阳性。

8)过氧化氢酶的测定

从NA斜面上挑取少量X1-b培养物，涂在干净的载玻片上，滴加10％的过氧化氢，有气泡产生者为阳性。

9)糖醇发酵检测

用培养18h X1-b菌种，用针穿刺接种于培养基((NH₄)₂HPO₄ 1g，酵母膏0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，糖(碳源)10g，0.4％溴甲酚紫乙醇液2mL，KCl 5g，琼脂5～6g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0，分装试管，培养基高度约为4～5Cm,121℃高压灭菌15min；碳源：D-甘露醇、D-葡萄糖)中，培养1d～7d甚至14d，检查结果。指示剂由紫色变黄表示糖类发酵产酸，为阳性。

10)淀粉水解检测

将X1-b的新鲜斜面培养物点种于淀粉水解培养基(普通肉汤培养基中加入0.2％可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，倒平板备用)中，28℃恒温培养2d～5d，形成明显的菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。

11)丙二酸利用检测

以幼龄(10h)X1-b菌种接种于培养基(酵母膏1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，K₂HPO₄ 0.6g，KH₂PO₄ 0.4g，NaCl 2g，丙二酸钠3g，溴百里酚兰0.025g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.4，分装试管，约4Cm高度，同时以不加丙二酸钠为空白对照，121℃灭菌15min)中，28℃培养2d～5d，若培养液由绿色变为蓝色为阳性，不变色为阴性。

12)酪蛋白水解检测

以幼龄(10h)X1-b菌种接种牛奶试管(脱脂牛奶100mL，2.5％石蕊水溶液(过夜后过滤使用)4mL，混合后的颜色为丁香或紫色适度，分装试管，牛奶高度4cm，121℃高压灭菌15min)中，分别于第1d、3d、5d、7d、14d观察，牛奶变清者为阳性。

13)苯丙氨酸脱氨酶检测

幼龄(10h)X1-b菌种划线接种培养基(酵母膏3g，NaCl 5g，K₂HPO₄ 1g，L-Phe 1g，琼脂12g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，分装试管，121℃灭菌15min，摆斜面)中，37℃培养8h～24h，向试管加4～5滴10％(g/mL)FeCl₃溶液，在培养基表面上若产生绿色为阳性，不变为阴性。

14)卵磷脂酶检测

取X1-b菌种点种于卵黄培养基平板上，室温培养18h～24h，若在菌落四周和下面出现白色不透明区，表明卵磷脂酶被分解为脂肪酸，为阳性反应。

卵黄培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，琼脂19g，121℃高压灭15min。

无菌取一定体积的新鲜蛋黄与等体积的无菌生理盐水充分混匀，按5％的量加到50～55℃的上述培养基中，混匀倒入培养皿内，制成卵黄平板过夜后使用。

15)吲哚产生检测

把幼龄(10h)X1-b菌种接种于培养基(1％胰胨水溶液，调pH 7.2～7.6，分装1/3～1/4试管，121℃高压灭菌15min)中，28℃培养1d、2d、4d、7d，沿管壁缓慢加入3～5mL的吲哚试剂(对二甲氨基苯甲醛8g，95％乙醇760mL，浓HCl 160mL)于表面，液层界面产生红色者，为阳性反应，若不明显，可先加4～5滴乙醚到培养液中，振动，静置，再加吲哚试剂，观察颜色反应。

16)耐盐性检测

选择NB培养基，分别加入NaCl至浓度2％，5％和7％，取幼龄菌种接种培养3d和7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况，有混浊出现即为阳性。

17)生长pH检测

把幼龄(10h)X1-b菌种分别接种于pH为6.8和5.7的NB培养基中，28℃，120r/min，培养48h后观察菌体生长情况，有菌体形成或培养基变浑浊则为阳性。

上述形态观察及生理生化测定结果：

X1-b在NA培养基上培养48h后形成乳白色圆形菌落，不透明，边缘不整齐，菌落上褶皱状突起，内部呈环状凹陷。油镜下观察为杆状细胞，细胞为1.07～1.25μm×2.37～3.09μm。革兰氏、芽胞、鞭毛和荚膜染色结果表明X1-b菌株为革兰氏阳性细菌(图1中a)，芽胞位于菌体中部(图1中b)，短杆状或球状，大小0.86～1.03μm×1.01～1.07μm，具有数根鞭毛，鞭毛为周生(图2)，无荚膜。另外，好气性检测显示X1-b为好氧性细菌，该菌运动性良好、V-P测定和接触酶反应阳性、遇葡萄糖和甘露醇产酸、能水解淀粉、不能利用丙酸盐和酪蛋白、苯丙氨酸脱氨酶和卵磷脂酶检测结果为阴性、不能产生吲哚、能在含7％的NaCl培养基上生长，在pH为6.8和5.7的营养肉汤培养基中生长良好(详见表1)。

表1X1-b部分生理生化特征结果

特征	X1-b
		运动性	+
接触酶	+
		厌氧生长	-
V-P测定	+
		产酸：D-葡萄糖	+
D-甘露醇	+
		淀粉水解	+
丙酸盐利用	-
		酪蛋白水解	-
苯丙氨酸脱氨酶	-
		卵黄卵磷脂酶	-
吲哚产生	-
		生长NaCl：2％	+
5％	+
		7％	+
生长pH：6.8营养肉汤	+
		5.7营养肉汤	+

注：+阳性反应；-阴性反应

2、拮抗细菌X1-b的16S rDNA和gyrB基因序列分析法鉴定

1)基因组DNA提取与纯化

(1)将X1-b菌种接种于NA平板上，28℃培养16h，用0.15mol/L NaCl与0.1mol/LEDTA(pH 8.0)缓冲液洗平板，收集菌体。

(2)将上述细胞悬液置于1.5mL离心管中12000rpm离心1min收集细胞，沉淀悬浮于500μL TE(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 8.0)缓冲液中。

(3)加溶菌酶0.5～1mg/mL(终浓度)，置37℃水浴30～60min。

(4)加SDS(20％)至终浓度2％，37℃水浴30～60min。

(5)加CTAB溶液100uL，5mol/L NaCl 80uL，65℃水浴10min。

(6)加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1，v/v)混合液，振荡混匀。

(7)12000r/min离心10min，将上清液转入2mL离心管中。

(8)加入1/10体积的5mol/L乙酸钠(NaAc)，2倍体积-20℃存放的无水乙醇轻轻混匀，-20℃沉淀1h左右。

(9)4℃下12000rpm离心15min，70﹪乙醇洗涤沉淀2～3次。

(10)在超净工作台中，无菌风吹干，用TE(pH 8.0)缓冲液溶解细菌的总DNA，-20℃冰箱保存待用。

2)拮抗细菌X1-b的16S rDNA序列PCR扩增

以拮抗细菌总DNA为模版，采用细菌16S rDNA区通用引物27f和1492r进行PCR扩增。27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492r：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'由上海生工合成。PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，总DNA模版1μL，引物27f 1μL，引物1492r1μL，ddH₂O9.5μL，反应总体积为25μL。

PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，54℃退火30s；72℃延伸1min 30s，34个循环；72℃延伸10min，4℃保存，备用。

3)拮抗细菌X1-b的gyrB基因序列PCR扩增

以细菌X1-b的总DNA为模版，采用细菌gyrB基因保守区序列引物gyrb-up1f和gyrb-up2r进行PCR扩增。gyrB-up1f GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，gyrB-up2r AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT由上海生工合成。PCR反应体系为(30μL)：2×Taq PCR Master Mix 15μL，ddH₂O 12μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板1μL。

PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，34个循环；72℃延伸10min，4℃保存，备用。

4)PCR产物的检测

采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测X1-b的16S rDNA和gyrB基因PCR扩增产物。检测正确后将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测得的供试菌株16SrDNA、gyrB区段的双向序列，用DNAMAN 5.2软件进行拼接和整理，在GenBank中进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析，得出与X1-b菌株的相近的已鉴定的菌株名称。

5)16S rDNA，gyrB基因序列分析结果

以芽胞杆菌X1-b基因组DNA为模板，用通用引物进行PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示16S rDNA，gyrB基因均扩增出大小约为1.4kb的DNA片段(见图3和图4)。

根据测序结果获得菌株X1-b的16S rDNA序列(16S ribosomal RNA gene，partialsequence)(序列表中序列1所示)和gyrB基因序列(DNA gyrase subunit B gene,partialsequence)(序列表中序列2所示)。与GenBank中基因序列进行同源性比较结果表明与X1-b菌株16S rDNA序列与芽孢杆菌属不同种如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)YS52和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)S499等菌株的16S rDNA基因序列相似率均达99％。可以初步确定芽胞杆菌X1-b的分类地位属于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)。

X1-b菌株gyrB基因序列的Blast比对分析结果显示其同B.amyloliquefacienssubsp.plantarum UCMB5036、B.amyloliquefaciens CC178和B.amyloliquefaciens Y2等解淀粉芽胞杆菌菌株相似率达99％，确定X1-b菌株为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期2016年7月6日，保藏编号为CGMCC No.12742。

实施例2.解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCC No.12742的抑菌活性测定

靶标植物病原真菌和病原细菌由北京农学院植物病理学实验室提供(见表2，表3)，分别测定菌株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b对以上病原真菌和细菌的拮抗活性。同时，以苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)BT(由中国农业大学植病生防实验室提供)，本发明的发明人分离的另一株枯草芽胞杆菌(B.subtilis)X1-a，以及不接任何拮抗细菌的培养为对照，每处理重复3次，观察细菌对不同病原菌生长的抑制情况，并测量抑菌带宽度。表2和表3中的病原真菌和病原细菌按照本领域已知的常规方法从自然界分离并鉴定。

表2.靶标植物病原真菌

表3.靶标植物病原细菌

一、病原菌活化

真菌活化：将4℃保存的病原菌菌种，用灭菌接种针挑取菌丝到新的PDA培养基平板中，25℃恒温培养箱中培养3-5d，备用。

细菌活化：取出细菌菌种，用接种针划线接种到新鲜的NA固体培养基中，放入28℃恒温培养箱中培养1-2d，备用。液体培养时，挑取单菌落于5mL液体NB培养基中，28℃、150r/min，振荡培养48h。

二、对植物病原真菌的抑菌作用测定

将活化好的植物病原真菌用灭菌打孔器打取5mm直径的菌块，放入新的PDA培养平皿中心位置；四周放4片灭菌滤纸片，其上滴加10μL培养好的生防细菌菌液；置于25℃恒温培养箱中培养，4d后开始进行抑菌带宽度(拮抗菌距离病原真菌边缘的距离)的测量。

三、对植物病原细菌的抑菌作用测定

融化NA固体培养基，待温度降至50度左右，加入5mL植物病原细菌菌液，摇匀后倒平皿，平皿凝固后在四周放4片灭菌滤纸片，分别滴加10μL拮抗细菌菌液，每皿重复3次，晾干后28℃恒温培养，2d后开始进行抑菌圈半径(拮抗菌距离病原细菌边缘的距离)的测量。

四、结果与分析

1、生防细菌对植物病原真菌的抑菌活性测定

拮抗细菌X1-b对植物病原真菌的抑制活性测定结果见表4。从表4可见解淀粉芽胞杆菌X1-b对所测的病原真菌均有较强的抑菌效果，抑菌带宽度均大于4mm；而枯草芽胞杆菌(B.subtilis)X1-a和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)BT抑菌谱较窄，只对少数病原真菌有抑菌作用，抑菌带宽度较小，抑菌能力较弱。由此可见解淀粉芽胞杆菌X1-b对植物病原真菌抑菌谱较广，抑菌能力强。

表4、拮抗细菌X1-b对病原真菌的抑菌带宽度测定结果(单位：mm)

2、拮抗细菌X1-b对植物病原细菌的抑菌活性测定

拮抗细菌X1-b对8株植物病原细菌的抑制活性测定结果见表5。从表5可见，解淀粉芽胞杆菌X1-b对葡糖杆菌Sfyg3-2、醋酸杆菌Sfb-18、大白菜软腐病菌ECC、十字花科细菌性黑斑病菌PSM和西瓜细菌性果斑病菌MH21均有不同程度的抑菌活性，而对野油菜黄单胞菌XCP、水稻白叶枯病菌XO99F以及青枯雷尔氏菌RS0909没有抑菌活性。作为对照，苏云金芽胞杆菌BT对所有待测病原细菌均无抑菌活性，枯草芽胞杆菌X1-a仅对大白菜软腐病菌ECC有一定的拮抗活性。

表5拮抗细菌X1-b对植物病原细菌的抑菌圈半径(单位：mm)

实施例3、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCC No.12742对黄瓜绵腐(Pythium aphanidermatum)病和柑橘青霉(penicillium italicum)病的防治试验

一、病原菌活化与生防菌发酵液的制备

真菌活化：将保存的柑橘青霉菌(Penicillium italicum)PI-1用灭菌接种针挑取菌丝到新的PDA培养基平板中，25℃恒温培养箱中培养3-5d，备用。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCC No.12742生防菌液的制备：挑取新活化的X1-b单菌落接于含有30mL液体NA培养基300mL三角瓶中，28℃、150r/min，振荡培养48h，即为生防用发酵菌液。灭菌发酵液：直接将培养好的发酵液在121℃，高压灭菌20min。

二、对黄瓜绵腐病的防治试验

取菜地田间自然土(含瓜果腐霉菌)铺满灭菌培养皿中，将黄瓜表面用5％的次氯酸钠消毒5min，截成5cm左右的小段，置于盛有带菌土的培养皿中，分别在培养皿中加入10mL的灭菌水、X1-b生防发酵液、X1-b灭菌发酵液和1％的硫酸铜溶液，置于保湿箱中，25℃放置3-4d，调查黄瓜的发病情况，计算防病效果。

三、对柑橘青霉病的防治试验

将柑橘表面用5％的次氯酸钠消毒5min，用灭菌接种针刺伤，用打孔器打取活化好的青霉菌(Penicillium italicum)PI-1菌片，将菌片贴在伤口处20min，取下菌片，在伤口处贴上灭菌脱脂棉，脱脂棉上分别滴加500μL的灭菌水、X1-b生防发酵液、X1-b生防发酵液的灭菌液和1％的硫酸铜溶液，置于保湿箱中，25℃放置3-4d，调查柑橘的发病情况，计算防病效果。

四、结果与分析

1、生防菌液对黄瓜绵腐病的防治效果

拮抗细菌X1-b对植物黄瓜绵腐病的防治效果见图5。从图5可见解淀粉芽胞杆菌X1-b发酵液对所测的黄瓜绵腐病有较好的防治效果。相对于硫酸铜溶液(防效100％)，X1-b发酵液防效能达到70％，发酵液经过高压灭菌之后防效也能达40％～50％左右。

2、生防菌液对柑橘青霉病的防治效果

拮抗细菌X1-b对柑橘青霉病的防治效果见图6。从图6可见解淀粉芽胞杆菌X1-b发酵液和硫酸铜处理的柑桔均未有青霉菌的扩展，防效能达到100％，X1-b的灭菌发酵液防效较小或丧失了防治效果。

实施例4、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCC No.12742产抗菌肽基因鉴定

随着测序技术的迅猛发展，高通量测序已经日益成为生物学研究中的重要手段，发挥着越来越广泛的作用。其中二代测序广泛用于生物研究领域，而本章主要对解淀粉芽胞杆菌X1-b进行了全基因组二代测序，为下一步研究基因的功能奠定基础。

经过二代测序序列组装和分析比对结果显示，解淀粉芽胞杆菌X1-b的全基因组序列染色体长度为4175709bp，共有4261个基因，基因平均大小为862bp，GC％为46.12％，4075个CDS，87个tRNA，13套rRNA。

经过对全基因组的生物信息分析，发现解淀粉芽胞杆菌X1-b至少拥有合成4种抗菌肽的基因簇，分别是：合成表面活性素(surfactin)的srfA、srfB、srfC和srfD基因簇；杆菌霉素(bacillomycin)合成基因bacA、bacB、bacC、bacD和bacE；丰原素(fengycin)合成基因ppsA、ppsB、ppsC、ppsD和ppsE；还有合成抗霉枯草菌素(mycosubtilin)的基因簇基因mycA、mycB、mycC(图7)。说明，生防解淀粉芽胞杆菌X1-b株产抗菌肽基因簇很多，这也是其抑菌谱宽的决定因素之一。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 北京农学院

<120> 一株生防用解淀粉芽胞杆菌及其应用

<130> WHOI170016

<160> 2

<210> 1

<211> 1505

<212> DNA

<213> 解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）X1-b

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gccsaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaggggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactgggaaa cttgagtgca 660

gaggaggaga gtggcactcc acgtgtagcg tgaaatgcgt agagatgtgg aggacaccag 720

tggcgaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac 780

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt 840

ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag 900

actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac 1020

gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080

tgttgggttt agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg 1140

gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200

atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa 1260

ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg 1320

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cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag 1440

gtaaccttta tggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga agtcgtaaca 1500

aggta 1505

<210> 2

<211> 1215

<212> DNA

<213>解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）X1-b

<400> 2

gaagtcatca tgaccgttct ccacgccggc ggtaaatttg acggaagcgg atataaagta 60

tccggcggtc ttcacggtgt aggggcgtct gtcgtaaacg ccttgtcgac cactcttgac 120

gttacggttc atcgtgacgg aaaaatccac tatcaggcgt acgagcgcgg tgtacctgtg 180

gccgatcttg aagtgatcgg tgatactgat aagaccggaa cgattacgca cttcgttccg 240

gatccggaaa ttttcaaaga aacaaccgta tacgactatg atctgctttc aaaccgtgtc 300

cgggaattgg ccttcctgac aaaaggcgta aacatcacga ttgaagacaa acgtgaagga 360

caagaacgga aaaacgagta ccactacgaa ggcggaatca aaagctatgt tgagtactta 420

aaccgttcca aagaagtcgt tcatgaagag ccgatttata tcgaaggcga gaaagacggc 480

ataacggttg aagttgcatt gcaatacaac gacagctata caagcaatat ttattctttc 540

acgaataata tcaacacata cgaaggcggc acgcacgagg ccggatttaa aaccggtctg 600

acccgtgtca taaacgacta tgcaagaaga aaagggattt tcaaagaaaa tgatccgaat 660

ttaagcgggg atgatgtgag agaagggctg actgccatta tttcaattaa gcaccctgat 720

ccgcaattcg aaggtcagac gaaaacgaag ctcggcaact ccgaagcgag aacgatcact 780

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atgatcacgg ccctcggaac aggaatcgga gaagatttta atcttgaaaa agcgcgttat 1200

cataaagtgg tcatc 1215

Claims

1.一株解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌的名称为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12742。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌具有针对植物病原真菌和植物病原细菌的抑菌活性。

3.根据权利要求2所述的解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，所述植物病原真菌为芸苔链格孢Alternaria brassicae、细极链格孢Alternaria tenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、白腐盾壳霉菌Coniothyrium diplodiella、大斑凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、围小丛壳菌Glomerella cingulata、棒形拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、意大利青霉Penicillium italicum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、藤仓镰刀菌Fusarium fujikuroi、茎点霉属Phoma sp.和苹果黑腐皮壳菌Valsa mali；所述植物病原细菌为醋酸杆菌Acetobacter malorum、西瓜食酸菌Acidovorax citrulli、葡糖杆菌Gluconobacter oxydans、胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、丁香假单胞杆菌斑生致病变种Pseudomonas syringaepvmaculicola。

4.解淀粉芽胞杆菌在防治植物病原真菌和植物病原细菌中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌的名称为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12742。

5.解淀粉芽胞杆菌在制备针对植物病原真菌和植物病原细菌的生防菌剂或微生物菌肥中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽胞杆菌的名称为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-b，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12742。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为芸苔链格孢Alternaria brassicae、细极链格孢Alternaria tenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea、白腐盾壳霉菌Coniothyrium diplodiella、大斑凸脐蠕孢Exserohilumturcicum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、围小丛壳菌Glomerella cingulata、棒形拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、意大利青霉Penicillium italicum、胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、藤仓镰刀菌Fusarium fujikuroi、茎点霉属Phoma sp.和苹果黑腐皮壳菌Valsa mali；所述植物病原细菌为醋酸杆菌Acetobacter malorum、西瓜食酸菌Acidovorax citrulli、葡糖杆菌Gluconobacter oxydans、胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、丁香假单胞杆菌斑生致病变种Pseudomonas syringaepvmaculicola。

7.一种针对植物病原真菌和植物病原细菌的生防菌剂或微生物菌肥，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCCNo.12742，所述微生物菌肥中含有解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-bCGMCC No.12742。

8.根据权利要求7所述的生防菌剂或微生物菌肥，其特征在于，所述植物病原真菌为芸苔链格孢Alternaria brassicae、细极链格孢Alternaria tenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、白腐盾壳霉菌Coniothyrium diplodiella、大斑凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、围小丛壳菌Glomerella cingulata、棒形拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、意大利青霉Penicillium italicum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、藤仓镰刀菌Fusarium fujikuroi、茎点霉属Phoma sp.和苹果黑腐皮壳菌Valsa mali；所述植物病原细菌为醋酸杆菌Acetobacter malorum、西瓜食酸菌Acidovorax citrulli、葡糖杆菌Gluconobacter oxydans、胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、丁香假单胞杆菌斑生致病变种Pseudomonas syringaepvmaculicola。

9.解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X1-b CGMCC No.12742在制备抗生素中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗生素为合成表面活性素、杆菌霉素、丰原素和/或抗霉枯草菌素。