CN103122328A

CN103122328A - 一种巨大芽孢杆菌菌株及其用途

Info

Publication number: CN103122328A
Application number: CN2012105218719A
Authority: CN
Inventors: 万科; 李祝; 张传萍; 黄化刚; 葛永怡; 申燕; 赵玉; 曹廷茂
Original assignee: Guizhou University; Guizhou Tobacco Co Ltd Bijie Branch
Current assignee: Guizhou University; Guizhou Tobacco Co Ltd Bijie Branch
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: CN103122328B

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌菌株（BacillusmagateriumL2）及其用途，其形态特征：菌株在普通琼脂培养基上，37℃，培养36h，菌落近圆形，表明凸起，黄色，不透明，菌落2-4mm，边缘整齐，表面有光泽或较暗，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.2~1.5×2.0~4.0μm，成链成链状排列，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、半固体穿刺试验阳性、牛奶分解阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、pH5.7阳性、VP试验阴性、吲哚实验阴性、甘露醇水解阴性。本发明能产生耐热的芽孢，既易于生产、剂型加工，又利于存活、定殖与繁殖。

Description

一种巨大芽孢杆菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种巨大芽孢杆菌菌株，同时还涉及其巨大芽孢杆菌菌株在抑制烟草链格孢菌方面的用途。

背景技术

烟草链格孢菌（Alternaria alternata (Fries) Keissler）为赤星病的病原菌，属半知菌亚门链格孢属。烟草赤星病是烟叶成熟后期重要的叶部病害，具有潜育期短、流行速度快的特点，直接影响烟叶的品质和产量。自1892 年首先在美国发现以来，曾几次给世界烟叶生产造成严重的经济损失。据中国烟叶购销公司统计，2005年，烟草赤星病在全国15个省市的发病面积达815万hm²，对我国烟叶生产造成的损失仅次于病毒病，居第2位，产量损失1370.918 万kg，产值损失9138.615万元。

目前，烟草赤星病的防治方法主要有以下几种：

选育种植抗病品种，这是最根本、最经济有效的防治措施，抗赤星病的品种有中烟90、云烟85等。但现阶段选育的抗病品种抗性水平偏低，即使抗性较高，当接种压力大、环境有利于发病时，植株还会呈现感病状，而且抗病品种往往是低等劣质品种，经济效益不理想。又由于病菌生理小种的存在，它的毒力可以经常发生变异，产生新的毒力不同的菌株，致使抗病品种或稍抗品种变为感病品种。

农业措施如加强栽培管理，发展春烟，合理轮作，早育苗早移栽，适宜的种植密度等；但它只能起辅助防治效果，起不到根本性的防治作用。因此，有必要对目前的防治措施予以补充和完善。

化学防治措施效果明显，但化学防治措施费工费时费钱，遇到连续阴雨天气时，既使喷药也达不到预期的效果，并且存在存在用药品种单一、药剂残留、病菌产生抗药性等问题。同时烟草是叶用经济作物，对烟叶的外观和内在质量有特殊要求，化学防治措施易降低烟叶品质、破坏生态环境和影响人类健康。

生物防治是国际上目前进行植物病害防治的首选防治措施，这种从自然界中分离、筛选有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有高效、无毒、无残留和低成本等特点。从现有植物病害生物防治的研究报道来看，采用的微生物种类有细菌、真菌、放线菌等微生物。但真菌和放线菌生长较慢，定殖较慢，营养要求较高，生产周期较长，成本相对较高，且对光、紫外、干燥较为敏感。

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种能产生耐热的芽孢，既易于生产、剂型加工，又利于存活、定殖与繁殖的巨大芽孢杆菌菌株。

本发明的另一目的在于提供该巨大芽孢杆菌菌株在抑制烟草链格孢菌方面的用途。

一种巨大芽孢杆菌L2（Bacillus magaterium L2），其形态特征：L2菌株在普通琼脂培养基上，37 ℃，培养36 h，菌落近圆形，表明凸起，黄色，不透明，菌落2-4mm，边缘整齐，表面有光泽或较暗，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.2 ~1.5×2.0~4.0 μm，成链成链状排列，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、半固体穿刺试验阳性、牛奶分解阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、pH5.7阳性、VP试验阴性、吲哚实验阴性、甘露醇水解阴性。

该菌种已于2012年9 月 26保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：CCTCC NO: M2012381，名称为：巨大芽孢杆菌L2（Bacillus magaterium L2）。

对烟草链格孢菌有抑制作用的巨大芽孢杆菌L2（Bacillus magaterium L2）的分离步骤：

（1）分离与纯化：称取采自贵州省毕节市威宁县的10g植烟土样于90mL带有玻璃珠的无菌水中，摇床上160rpm振荡20min，静置5min，吸取土壤悬浮液用无菌水逐级梯度稀释。吸取0.1mL稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃倒置培养36h，待平板长出菌落后，挑取单菌落纯化，编号保存，待测；

（2）筛选：采用平板对峙法，倒好PDA培养基平板，用5mm打孔器打取PDA培养基上的链格孢菌菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称接种待测细菌菌株，以不接菌体的平板为对照。重复三次，在28℃培养箱中培养5天，观察到有一株细菌周围产生了明显的抑菌圈，对烟草赤星病菌有明显的拮抗作用，挑出此细菌菌株；

（3）鉴定：将上述所得菌株在普通琼脂培养基上，37 ℃，培养36 h，菌落近圆形，表明凸起，黄色，不透明，菌落2-4mm，边缘整齐，表面有光泽或较暗，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.2 ~1.5×2.0~4.0 μm，成链状排列，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、半固体穿刺试验阳性、牛奶分解阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、pH5.7阳性、VP试验阴性、吲哚实验阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》，初步鉴定为芽孢杆菌属。

将菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，160rpm 28℃培养12h，离心收集菌体。采用上海生工Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（细菌）提取基因组DNA。以提取到的DNA为模板，用正向引物

16SF(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')

和反向引物16SR(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')对菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 3min；94℃ 45s，54℃ 30s，72℃ 1min，25个循环；72℃终延伸5min，4℃停止。PCR产物送由上海生工生物工程股份有限公司测序，长度为1471bp。测序结果在GenBank中与Bacillus magateriμm相似性为99%。综合菌落形态、生理生化及分子鉴定，将这一菌株记为巨大芽孢杆菌L2（Bacillus magaterium L2）。

巨大芽孢杆菌菌株在抑制链格孢菌方面的应用：

（1）将活化的巨大芽孢杆菌L2（Bacillus magaterium L2）挑一环接入牛肉膏蛋白胨培养液中，160rpm ，28℃培养48h，作为拮抗效果测定的发酵液；

（2）采用平板对峙法，倒好PDA培养基（马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1L，自然pH，121℃，灭菌30min）平板，用5mm打孔器打取链格孢菌菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称放置三个浸泡过巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2）发酵液的滤纸片，以不接发酵液的为对照，重复三次，在28℃培养箱中培养5天，L2对烟草链格孢菌的抑菌圈直径达到了17mm。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明的巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2）来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，能适应病害生态系统，容易培养和保存，抑制烟草链格孢菌效果好，在农业方面有很大的应用前景。该技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，实现液体发酵工业化生产巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2），为开发相关生物制剂及大田推广奠定基础。

具体实施方式

对烟草链格孢菌有抑制作用的巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2）的分离步骤：

（1）供试菌株：烟草赤星病病原菌——链格孢菌（Alternaria alternata），贵州大学微生物实验室分离、筛选、鉴定、保存。

（2）拮抗菌的分离与纯化：称取采自贵州省毕节市威宁县的10g植烟土样于90mL带有玻璃珠的无菌水中，摇床上160rpm振荡20min，静置5min，吸取土壤悬浮液用无菌水逐级梯度稀释。吸取0.1mL稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃倒置培养36h，待平板长出菌落后，挑取单菌落纯化，编号保存，待测。

（3）拮抗细菌的筛选：采用平板对峙法，倒好PDA培养基（马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1L，自然pH，121℃，灭菌30min）平板，用5mm打孔器打取PDA培养基上的链格孢菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称接种待测菌株，以不接菌体的平板为对照。重复三次，在28℃培养箱中培养5天，观察到一株细菌周围产生明显的抑菌圈，将这株细菌命名为L2。

将活化的L2菌株挑一环接入牛肉膏蛋白胨培养液(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水补足1L，pH 7.2，121℃，灭菌45 min）中，160rpm， 28℃培养48h，作为拮抗效果测定的发酵液。

采用平板对峙法，倒好PDA培养基平板，用5mm打孔器打取链格孢菌丝块放在平板中央，在其周围距离2.5cm处对称放置三个浸泡过L2发酵液的滤纸片（直径为5mm），以不加发酵液的为对照，重复三次，在28℃培养箱中培养5天，L2对烟草链格孢菌的抑菌圈直径达到17mm。

（4）拮抗菌的鉴定：L2菌株在普通琼脂培养基上，37 ℃，培养36 h，菌落近圆形，表明凸起，黄色，不透明，菌落2-4mm，边缘整齐，表面有光泽或较暗，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.2 ~1.5×2.0~4.0μm，成链状排列，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7%NaCl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、半固体穿刺试验阳性、牛奶分解阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、pH5.7阳性、VP试验阴性、吲哚实验阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》，初步鉴定为芽孢杆菌属。

将L2菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，160rpm 28℃培养12h，离心收集菌体。采用上海生工Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（细菌）提取基因组DNA。以提取到的DNA为模板，用正向引物

16SF(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')

和反向引物16SR(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')对菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 3min；94℃ 45s，54℃ 30s，72℃ 1min，25个循环；72℃终延伸5min，4℃停止。PCR产物送由上海生工生物工程股份有限公司测序，长度为1471bp。测序结果在GenBank中与Bacillus magaterium相似性为99%。综合菌落形态、生理生化及分子鉴定，将这一菌株记为巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2）。

通过对抑菌试验来说明本发明的巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2）的抑制烟草链格孢菌的用途：

（1）发酵液的制备：将活化的巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus magaterium L2）挑一环接入牛肉膏蛋白胨培养液(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水补足1L，pH 7.2，121℃，灭菌45 min）中，160rpm ，28℃培养12h，作为种子液。按3%接种量将L2种子液接入装有50ml牛肉膏蛋白胨发酵培养液的250ml培养瓶中，28℃，160rpm，摇瓶培养48h，得拮抗菌发酵液。

（2）用无菌的圆滤纸片（直径5mm），吸取发酵液在酒精灯前略微干燥，轻轻放在接种烟草链格孢菌的PDA平板（马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1L，自然pH，121℃，灭菌30min）上，倒置于28℃培养箱培养5天，L2对烟草链格孢菌的抑菌圈直径达到17mm。

Claims

1. 一种巨大芽孢杆菌L2（Bacillus magaterium L2），其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC NO: M2012381。

2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌L2在抑制烟草链格孢菌方面的用途。