CN105400712A

CN105400712A - 耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌CGMCC No.10669及其应用

Info

Publication number: CN105400712A
Application number: CN201510578504.6A
Authority: CN
Inventors: 王倩; 刘好宝; 苏玉龙; 史素娟; 毛静静; 张鸽; 李晓旭
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-09-06
Filing date: 2015-09-06
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-09-06
Also published as: CN105400712B

Abstract

本发明提供了一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌(Bicillus？megaterium.)，其保藏编号为：CGMCC？No.10669，保藏日期为2015年3月30日。本发明还提供了利用保藏编号为：CGMCC？No.10669的巨大芽孢杆菌在耐受高浓度的糖的情况下生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的应用方法。本发明的巨大芽孢杆菌CGMCC？No.10669是一种分离的全新的菌株，该菌株具高浓度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物包括1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，为后期利用该菌通过代谢工程改造，生产相应的化学品奠定基础。

Description

耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌CGMCC No.10669及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及巨大芽孢杆菌新的菌株以及该菌株的应用。

背景技术

生物基化学品是指利用可再生的生物质(淀粉、葡萄糖、木质纤维素等)为原料生产的大宗化学品和精细化学品等产品。生物基化学品的研发可以摆脱了对不可再生的原料(石油、煤和天然气等)的依赖，避免或减少了温室气体的排放，被认为是实现可持续发展的重要方向，已引起世界各国的广泛重视。美国2012年发布的“国家生物经济蓝图”将发展生物基化学品作为生物经济的主要内容之一。生物基化学品也被我国政府作为生物制造业的产业的核心内容。

目前已经有大量的生物基化学品被利用微生物生产出来，包括2，5-呋喃二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、山梨醇、3-羟基-γ-丁内酯等。这些化学品的生产宿主菌大部分为工程菌如大肠杆菌、酵母菌等。随着测序技术和代谢工程技术的不断发展，越来越多的野生菌株被开发出来，通过改造应用于生物基化学品的生产。此外，葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。因此，发掘具有葡萄糖耐受性的生产生物基化学品的菌株具有重要的意义。因此，本发明的目的是，提供一种新的耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌新的菌株以及利用该菌株生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化学品的方法。

发明内容

本发明着眼于开发更多的可用于代谢工程改造生产生物基化学品的野生菌株，特别是工业菌株的高浓度葡萄糖耐受性需要提升的现状，筛选获得高浓度葡萄糖耐受性的巨大芽孢杆菌(Bicillusmegaterium.)，以及利用该菌株生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化学品的方法。

本发明提供了一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌(Bicillusmegaterium.)，其保藏编号为：CGMCCNo.10669，保藏日期为2015年3月30日。

所述耐受高葡萄糖浓度的巨大芽孢杆菌(Bicillusmegaterium.)是从云南省临沧市烟草试验站烟田土壤中采样，通过高浓度葡萄糖选择性培养基分离得到的。

所述CGMCCNo.10669的巨大芽孢杆菌具有如下生物学特征：

单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

上述巨大芽孢杆菌菌株的经通用引物PCR获得16SrDNA序列与其它多株巨大芽孢杆菌的16SrDNA序列有99％的相似性但是不同。

其中上述PCR的引物为fD1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，

rP2：CGGCTACCTTGTTACGACTT。

进一步的，本发明还公开了CGMCCNo.10669的巨大芽孢杆菌的应用方法，即：利用保藏编号为：CGMCCNo.10669的巨大芽孢杆菌在耐受高浓度的糖的情况下生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸。

所述巨大芽孢杆菌能够在高葡萄糖浓度的培养基里快速生长并产生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸，具体为：

所述巨大芽孢杆菌筛选培养基配方为：胰蛋白胨8～20g/l，牛肉膏2～10g/l，NaCl3～6g/l，葡萄糖300～500g/L，pH值7.0～7.4，最佳温度为30～37℃，

培养时的转速为100～140r/min，

生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的所述巨大芽孢杆菌菌株培养在250ml的三角瓶中，装液量为40～80ml，

生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的培养时间为36～48小时，

生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的培养基的灭菌条件为110～120℃灭菌20～30分钟。

进一步的，按照所述巨大芽孢杆菌能够在高葡萄糖浓度的培养基里快速生长并产生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的操作方法：

该巨大芽孢杆菌能够在含有500g/L的葡萄糖的培养基中生长，在摇瓶发酵水平上能够产生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，具有极高的开发价值。

进一步的，利用该巨大芽孢杆菌菌株生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸时的复合氮源还可以为：

酵母浸出物+蛋白胨(1∶1)、酵母浸出物+蛋白胨+氯化铵(2∶2∶1)或者酵母浸出物+蛋白胨+尿素(2∶2∶1)

碳源还可以为：

甘露醇、蔗糖、果糖、麦芽糖

即、耐受高浓度葡萄糖的的生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的复合氮源可以是牛肉膏或蛋白胨，但不局限于牛肉膏和蛋白胨，碳源为葡萄糖，但不仅限于葡萄糖。

本发明的巨大芽孢杆菌CGMCCNo-10669是一种分离的全新的菌株，该菌株具高浓度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物包括1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，为后期利用该菌通过代谢工程改造，生产相应的化学品奠定基础。葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。

保藏信息：

菌株名称：巨大芽孢杆菌(Bicillusmegaterium.)

参据的生物材料(株)：CAS5077-67-8-YNLC

保藏日期：2015年3月30日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏编号：CGMCCNo.10669

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1巨大芽孢杆菌的高浓度葡萄糖耐受性

图2摇瓶发酵巨大芽孢杆菌生产化学品的质谱图(a.1-羟基-2-丁酮、b.当归内酯、c.丙烯酸、d.丁烯酸

具体实施方式

一：菌株筛选

1.培养基及培养条件：

耐受高浓度葡萄糖产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、、丁烯酸等化学品的菌株的筛选配方为：胰蛋白胨3～8g/l，牛肉膏2～5g/l，NaCl3～5g/l，MgSO₄·7H₂O，2～4g/l，葡萄糖300～500g/l，pH值7.0～7.4。最佳温度为30～37℃，转速为100～140r/min，在250ml的三角瓶中的装液量为40～80ml。

培养时间为24～36小时。

上述烟培养基的灭菌条件为110℃～115℃灭菌20～30分钟。

上述培养基中添加1％～1.5％的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选。2.筛选方法：

取污水、污泥以及腐败生物质的土壤按照0.8～1.2g样品4～7m1水溶解，将水样置于室温20～39小时活化然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的土壤。

取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到以添加1％～1.5％的琼脂的含有高浓度葡萄糖的培养基制成的固体培养基培养皿上。

上述菌落的产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、、丁烯酸等化学品的菌株的筛选方法为：将上述稀释液体100～300μl，涂布于含有300～500g/L高浓度葡萄糖的平板上，24～48小时后获得少量菌株。

上述筛选获得菌株，利用50ml的摇瓶，培养24～36小时后挑取单菌落进行液体培养，葡萄糖耐受性试验。经筛选共获得菌株5株，进行摇瓶培养后利用气相-质谱鉴定产生的化学品。

二：葡萄糖耐受性的验证

取上述菌株筛选培养基，按照1～5％的接种量接种活化后的巨大芽孢杆菌，接种于装有2～4mlLB培养基的试管中，生长到菌体密度为OD600大约08～1.2左右时接种于装有50ml以葡萄糖含量在100～500g/L的上述培养基的250ml的摇瓶中，于100～140转每分钟的摇床中，30～37℃培养。培养36～48小时测定该菌株的生长量。

生长量的测定：取上述菌液1ml，经12000r/min离心2～5min后，利用蒸馏水重悬，稀释适当倍数后，利用紫外-可见分光光度计于600nm处测定吸光度。经测定，该菌株能够耐受500g/L以上的葡萄糖浓度(图1，图1巨大芽孢杆菌的高浓度葡萄糖耐受性)。从图1可看出，菌株在400g/L的葡萄糖溶液中表现出最大生长量。其中在葡糖糖浓度为0-400g/L范围内该菌株的生长量表现为持续增加趋势，葡萄糖浓度增加到500g/L时菌株的生长量即出现明显的下降趋势。

三：菌株16SrDNA鉴定

1.培养基及材料

LB培养基含有以下成分：蛋白胨8～12g/l，酵母粉4～6g/l，氯化钠1～4g/l，pH6.8～7.5，110℃到115℃灭菌25～35分钟。

LA培养基：在LB培养基中添加40～100μg氨苄青霉素。

LB/LA固体培养基：在上述LB/LA培养基中添加1.2％～1.7％的琼脂。

TAE：50倍tris-acetate-EDTA(2Mtris-acetate，0.05MEDTA，PH8.3).

琼脂糖电泳凝胶：1倍TAE电泳缓冲液添加0.8～1.2％的琼脂糖凝胶。2.16SrDNA测定

基因组DNA的提取，在LB液体培养基中生长的5-2菌体(约12～24小时)离心。提取基因组DNA，然后用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检测合格的DNA进行PCR基因扩增，PCR采用的引物为fD1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，rP2：CGGCTACCTTGTTACGACTT；PCR模板DNA添加0.5μl调节到合适浓度，引物浓度为0.4μM，dNTP浓度为0.2mM，DNA聚合酶大约2.5U，反应总体积50μl，变性温度为94℃，退火温度为55℃，延伸温度72℃，共30个循环。PCR产物约为1.5kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，经PCR扩增得到的DNA电泳检测后连接到PMD18-T转化大肠杆菌，转化的DH5α菌株经过添加LA(Luria-Bertani培养基添加50mg氨苄青霉素)培养基筛选后，提取质粒进行电泳验证，将正确质粒进行测序，测序结果如sequence1所示。

Sequence1：

将本发明的菌株的16SrDNA序列与GenBank中已登录的16SrDNA序列进行同源比较，该16SrDNA序列与其它多株巨大芽孢杆菌的16SrDNA序列相似但不完全相同。单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。上述菌株的经通用引物PCR获得16SrDNA序列与其它多株基巨大芽孢杆菌的16SrDNA序列有99％的相似性但是不同。根据16SrDNA序列和形态学特征，鉴定该菌为巨大芽孢杆菌。

四：摇瓶发酵巨大芽孢杆菌生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化学品。

产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化学品培养基配方为：胰蛋白胨8～20g/l，牛肉膏2～10g/l，NaCl3～6g/l，葡萄糖300～500g/L，pH值7.0～7.4。最佳温度为30～37℃，培养方法的转速为100～140r/min。

取上述培养基，按照1～5％的接种量接种活化后的巨大芽孢杆菌，接种于装有2～4mlLB培养基的试管中，生长到菌体密度为OD600大约1左右时接种于装有50ml上述培养基的250ml的摇瓶中，培养36～48小时后测定化学品产物(产物经气相-质谱定性图2，图2摇瓶发酵巨大芽孢杆菌生产化学品的质谱图，(a.1-羟基-2-丁酮、b.当归内酯、c.丙烯酸、d.丁烯酸))。图2中横坐标代表质核比，纵坐标代表离子强度，质谱分析结果与标准库中的色谱图作比较后显示出了与对应色谱峰相似度最高的标准图谱对应的化学物质结构，结果表明四种主要产物对应的标准图谱化学物质分别为1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸和丁烯酸。

每次取样时取样1ml于1.5ml离心管，12000rpm离心2min，吸取上清液，备用。

化学品检测：化学品的检测采用气相-质谱法，气相检测室温度270℃，气化室温度250℃，柱室温度初始温度为50℃，2min，20℃/min升温到120℃后30℃/min升温到240℃，保持5min后降温到50℃，完成检测。

综上，本发明的巨大芽孢杆菌CGMCCNo.10669是一种分离的全新的菌株，该菌株具高浓度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物包括1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，为后期利用该菌通过代谢工程改造，生产相应的化学品奠定基础。葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于提高产物的浓度具有重要意义。

Claims

1.一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌(Bicillusmegaterium.)，其保藏编号为：CGMCCNo.10669，保藏日期为2015年3月30日。

2.一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌的应用方法，其特征在于，利用保藏编号为：CGMCCNo.10669的巨大芽孢杆菌在耐受高浓度的糖的情况下生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸。

3.根据权利要求2所述巨大芽孢杆菌的应用方法，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌能够在高葡萄糖浓度的培养基里快速生长并产生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、、丁烯酸，具体为：

培养时的转速为100～140r/min，

4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，利用该巨大芽孢杆菌菌株生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸时的复合氮源还可以为：

碳源还可以为：

甘露醇、蔗糖、果糖、麦芽糖。