CN104164388A - 一株巨大芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样中筛选到一株新型巨大芽孢杆菌YX-7，其具有异养及硝化性能，保藏编号CCTCC NO：M2014275。所述菌株对水体中的NO2-N降解效果显著，处理48h后，NO2-N的去除率高达91.15％，可用于养殖水体和生活污水的处理，减轻水体污染；此外，所述巨大芽孢杆菌YX-7能有效提高水产动物对饲料的利用率，实验组南美白对虾的料肉比比对照组降低了8％，因此可作为饲料添加剂应用于水产饲料中，有利于提高养殖户的经济效益，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。
背景技术
我国水产养殖业近年来迅猛发展，集约化、高密度养殖规模日益扩大，集中投饵造成养殖水体中积累大量的残饵、粪便及动植物尸体，导致水体氮元素含量严重超标，富营养化加剧，使得养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。硝化过程是将NO2 --N转化为NO3 --N，是自然界中氮循环中的重要一环。随着水产养殖高密度的发展，投饵量持续上升，自然界中脱氮负荷不断加大，造成氮的积累。研究表明，NO2 --N是水产动物致病的主要根源之一，NO2 --N能优先与血红蛋白及血蓝蛋白结合，造成养殖对象缺氧，进而引发各种疾病。所以控制养殖水体中的NO2 --N成为水产养殖水质处理的重点，也是目前水质处理的难点。
由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点，逐渐成为工业污水、生活污水及水产养殖废水处理的主要方式。脱氮功能微生物菌种是整个生物脱氮技术的核心，而菌种的质量是决定反应性能的关键因素之一，因此，筛选性能优良的脱氮微生物成为目前本领域的研发热点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一株新型巨大芽孢杆菌菌株。所述巨大芽孢杆菌具有异养及硝化性能，能有效降低水体中NO2-N的含量，还可作为饲料添加剂应用于水产饲料中，用于提高水产动物的生产性能。
本发明一方面提供了一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YX-7，已于2014年6月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014275。
本发明另一方面提供了上述巨大芽孢杆菌YX-7在净化水体方面的应用。
所述巨大芽孢杆菌可以菌粉的形式制成微生态添加剂，制备过程为：将巨大芽孢杆菌YX-7进行活化，扩大培养，经液态发酵，絮凝后喷雾干燥做成巨大芽孢杆菌含量为10-100亿/g的菌粉。
本发明还提供了包含上述巨大芽孢杆菌YX-7的微生物制剂。
所述微生物制剂在饲料中的应用。
本发明的有益效果：
本发明筛选到的巨大芽孢杆菌YX-7，具有异养及硝化性能。所述菌株对水体中的NO2-N降解效果显著，处理48h后，NO2-N的去除率高达91.15％，可用于养殖水体和生活污水的处理，减轻水体污染；此外，所述巨大芽孢杆菌YX-7能有效提高水产动物对饲料的利用率，实验组南美白对虾的料肉比比对照组降低了8％，因此可作为饲料添加剂应用于水产饲料中，有利于提高养殖户的经济效益，应用前景广阔。
具体实施方式：
实施例1菌株的分离、筛选与鉴定
1、样品
取自烟台东方海洋集团三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样；
2、异养硝化培养基：
| 名称 | 重量(g) |
| NaNO2 | 0.5 |
| 琥珀酸钠 | 5.62 |
| K2HPO4 | 5.0 |
| MgSO4·7H2O | 2.5 |
| NaCl | 2.5 |
| FeSO4·7H2O | 0.05 |
| MnSO4·4H2O | 0.05 |
| H2O | 1000 |
3、筛选方法
申请人采用梯度稀释法将水样稀释至适当浓度；取0.1mL稀释后的水样均匀涂布于上述异养硝化培养基表面，置入恒温培养箱，30℃下培养2～3d后，用接种环挑取培养基上的单菌落，进行分离纯化，即为初筛菌株。
本次试验共挑取了10株单菌落，并依此命名为YX-1、YX-2、YX-3……、YX-10。将上述单菌落分别接种至营养肉汤培养基，在30℃、160r/min条件下进行液体培养，24h后，将发酵液在无菌条件下进行离心，将菌泥用生理盐水重悬，制成菌浓度为108-109CFU/mL的菌液。
按1％(v/v)的比例将上述菌液分别接种到已灭菌的养殖废水(NO2-N浓度为1.47mg/L)中，30℃、160r/min条件下进行摇瓶处理，48h后取样测定水体中NO2-N的浓度，计算NO2-N的去除率，具体结果如表1所示：
NO2-N的浓度采用重氮-偶氮光度法测定；
去除率＝(初始浓度-终止浓度)/初始浓度×100％。
表1处理48h后水体中NO2-N的去除情况
| 菌株编号 | 初始NO2 --N(mg/L) | 终止NO2 --N(mg/L) | 去除率 |
| YX-1 | 1.47 | 0.34 | 76.87％ |
| YX-2 | 1.47 | 0.78 | 46.94％ |
| YX-3 | 1.47 | 0.76 | 48.30％ |
| YX-4 | 1.47 | 0.39 | 73.47％ |
| YX-5 | 1.47 | 0.24 | 83.67％ |
| YX-6 | 1.47 | 0.42 | 71.43％ |
| YX-7 | 1.47 | 0.13 | 91.15％ |
| YX-8 | 1.47 | 0.90 | 38.78％ |
| YX-9 | 1.47 | 0.71 | 51.70％ |
| YX-10 | 1.47 | 0.45 | 69.39％ |
从表1的结果可以看出，本发明从三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样中筛选到的菌株YX-7对水体中的NO2-N降解效果最好，处理48h后，NO2-N的去除率高达91.15％，远高于筛选到的其他菌株。
4、菌株鉴定
1)菌落形态特征：将上述菌株YX-7在营养琼脂培养基上培养24小时，呈现为白色略带黄、半透明、表面湿润、有皱褶、直径约1mm菌落，镜检其细胞为长杆状。
2)利用试剂盒提取上述菌株YX-7的基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA序列，测序后获得长度为1428bp的片段。通过BLAST比对分析，其与已公布的多株巨大芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度为100％，鉴定证实上述菌株YX-7为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，与生化鉴定结果一致。
菌株YX-7的16S rRNA序列：
GCTATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGC
3)将上述菌株YX-7命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YX7，已于2014年6月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014275。
实施例2巨大芽孢杆菌YX-7处理水产养殖水体实验
1、菌粉的制备
首先将巨大芽孢杆菌YX-7进行活化，扩大培养，经液态发酵、喷雾干燥做成菌粉，其中巨大芽孢杆菌含量约为100亿/g。
2、实验地点：江苏如东的小棚虾养殖池
选取水质指标相近的三个养殖池作为三个平行，分别用塑料布将养殖池的水体隔开，一半水体作为实验组，另一半水体作为对照组。分别检测各组水体中NO2 --N的初始浓度；然后向实验组水体中添加10ppm上述巨大芽孢杆菌YX-7菌粉，对照组不加。实验温度为28-30℃，实验期间不间断曝气，且各组曝气量一致。48h后分别测定各组水体中NO2 --N的浓度，将三个平行组的检测结果取平均值，用于计算NO2-N的去除率。具体结果如表2所示：
表2处理48h后养殖池水体中NO2-N的去除情况
| 组别 | 初始NO2 --N(mg/L) | 终止NO2 --N(mg/L) | 去除率 |
| 对照组 | 1.23±0.03 | 1.14±0.02 | 7.32％ |
| 实验组 | 1.25±0.03 | 0.17±0.02 | 86.40％ |
从上述实验结果来看，本发明提供的巨大芽孢杆YX-7菌粉能有效降解养殖水体中的NO2-N，处理48h后NO2-N的去除率高达86.4％(p＜0.05)。由于亚硝态氮在血液中优先与血红蛋白或血蓝蛋白结合，能严重影响水产动物的代谢，亚硝态氮的降解问题是目前水产养殖上的难点之一。本发明所述巨大芽孢杆YX-7对亚硝态氮的降解效果显著，可用于解决水产养殖水体中亚硝态氮过高的问题。
除了能降解养殖水体中的亚硝态氮之外，本发明所述巨大芽孢杆YX-7还可应用于生活污水的处理，效果也很显著，处理48h后NO2-N的去除率高于88％。
实施例3：巨大芽孢杆菌YX-7对水产动物料肉比的影响
实验地点：江苏如东的小棚虾养殖池；
选取水质指标正常、对虾健康养殖池塘，在养殖池塘中用塑料布搭建6个长宽高分别为4m×4m×2m的围隔，围隔中注入等量的本池塘中的水，围隔中带有等量的曝气石，将曝气量调节均匀一致。随机抽取3个作为实验组，另3个作为对照组。各组投放健康的南美白对虾1000尾，投放之前，从每组中随机选出500尾对虾进行称重，三个实验组和对照组各取平均值。
南美白对虾的饲料选择市售的对虾配合饲料，其中实验组的饲料中按1‰的质量比添加本发明所述巨大芽孢杆YX-7菌粉，而对照组的饲料中不加。每天投喂2次饲料，实验组和对照组投喂饲料的重量及时间均一致，记录每次投喂的饲料重量。实验期间不间断曝气，其他管理均一致。饲喂20天后，从每组中随机选出500尾对虾进行称重，三个实验组和对照组各取平均值，然后计算料肉比，具体结果如表3所示：
表3巨大芽孢杆菌YX-7对水产动物料肉比的影响
从表3的数据可以看出，通过在饲料中添加本发明所述巨大芽孢杆YX-7，实验组的南美白对虾料肉比比对照组降低了8％，从而说明巨大芽孢杆YX-7能有效提高水产动物对饲料的利用率，因此可作为饲料添加剂，用于增加养殖户的经济效益。
Claims (5)
1.一种巨大芽孢杆菌，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2014275。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌在水体净化领域中的应用。
3.一种微生物制剂，所述的微生物制剂包含有权利要求1所述的巨大芽孢杆菌。
4.权利要求3所述的微生物制剂，所述的微生物制剂为微生物菌粉，是将权利要求1所述的巨大芽孢杆菌活化、扩大培养，经液态发酵，喷雾干燥，制成菌量为100亿/g的菌粉。
5.权利要求3或4所述的微生物制剂在水产饲料或水体净化领域中的应用。
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