CN111286464B

CN111286464B - 一种表达几丁质酶的工程菌及植物促生长应用

Info

Publication number: CN111286464B
Application number: CN202010262257.XA
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 宋文; 贺妮莎; 张诺; 刘天罡
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2020-04-06
Filing date: 2020-04-06
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2040-04-06
Also published as: CN111286464A

Abstract

本发明提供了一种表达几丁质酶的工程菌及应用，该工程菌以毕赤酵母GS115为表达宿主，结合基因拷贝数、辅助因子共表达和高密度发酵等策略，使得到的几丁质酶具有表达量高、活性高等优点。利用本发明工程菌表达的几丁质酶可以水解高浓度胶体几丁质，水解活性好，水解产物主要是N‑乙酰氨基葡萄糖，其次是N,N‑二乙酰基壳二糖，可用于促进水稻和小麦种子的萌发和生长。

Description

一种表达几丁质酶的工程菌及植物促生长应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及一种表达几丁质酶的工程菌及在植物种子萌发生长中的应用。

背景技术

几丁质(甲壳素)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物，是最丰富的的天然高分子化合物之一。几丁质经几丁质酶水解后的产物是几丁寡糖，其在医药保健、农业等领域有很高的应用价值。几丁寡糖是有效的植物激发子，具有诱导植物抗性、促进植物生长等功能。几丁质广泛存在于多种节肢动物如虾、蟹和昆虫等的外壳中，自然界每年由生物体所合成的几丁质多达10¹¹吨，是自然界含量最丰富的多糖之一。将这些几丁质资源进行生物降解，是几丁寡糖的主要来源。

天然的甲壳素降解较为困难，目前的重点研究领域在于，筛选出产酶量高且适合工业化生产的菌株及表达系统、寻找合适的发酵工艺、探索使酶活稳定的方法及酶的改性研究等，从而推动我国几丁质研究及相关产业的发展。目前虽然已有地衣芽孢杆菌来源的几丁质酶(ChiA)进行异源表达的报道，但是存在表达量较低，以及活性低的问题，使其在工业应用方面存在明显的弊端。

通过检索国内外现有技术，尚未有地衣芽孢杆菌来源的几丁质酶在宿主中大量表达的方法应用，且已有的几丁质酶不能水解高浓度胶体几丁质。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过地衣芽孢杆菌WX-02来源几丁质酶的基因序列，构建了一种高效表达几丁质酶的工程菌，从而解决了现有几丁质酶表达量和活性不高的问题。

为实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种表达几丁质酶的工程菌，该工程菌以毕赤酵母GS115为宿主菌，内含重组载体A和重组载体B，所述重组载体A是含有几丁质酶基因3-6拷贝的重组载体，所述重组载体B是插入辅助因子HAC1或ERV29基因序列的重组载体。

需要说明的是，几丁质酶属于真核基因，研究发现其存在翻译后修饰。而本发明人选用的毕赤酵母GS115存在真核基因具有的翻译后修饰特点，且能够进行分泌表达和高密度发酵，满足工业化应用的条件。因此，我们选择毕赤酵母GS115作为出发菌株进行几丁质酶的表达。

进一步优选地，如上所述表达几丁质酶的工程菌，其中的重组载体A是在pHBM905M载体的Cpo I和Not I位点间插入几丁质酶的编码基因,再通过生物砖技术将几丁质酶的表达框重复构建获得3-6拷贝。

进一步优选地，如上所述表达几丁质酶的工程菌，其中的重组载体B是在pGAPZB载体的Xho I和Xba I位点间插入辅助因子HAC1或ERV29基因序列的重组载体。

再进一步优选地，如上所述表达几丁质酶的工程菌，其中的的几丁质酶基因来源于地衣芽孢杆菌WX-02，且具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

另外，本发明还提供了一种表达几丁质酶的工程菌的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)几丁质酶基因片段的获得：通过设计引物，在几丁质酶基因上、下游引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的片段；

(2)几丁质酶基因多拷贝工程菌的构建：步骤(1)中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接，得到目的基因的3-6拷贝重组质粒，然后转化至毕赤酵母GS115感受态，筛选得到阳性重组子，得到几丁质酶基因多拷贝工程菌；

(3)辅助因子和多拷贝几丁质酶共表达工程菌的制备：根据辅助因子的基因序列设计引物进行基因扩增，将辅助因子的基因构建在pGAPZB载体的Xho I和Xba I酶切位点之间，线性化酶切后，转化至步骤(2)构建的几丁质酶基因多拷贝工程菌，得到辅助因子和多拷贝几丁质酶共表达工程菌。

进一步优选地，如上所述表达几丁质酶的工程菌的制备方法，其中步骤(1)设计的引物为：

ChiA-F：GTCAGATTCCGGAAAAAACTATAAAATCATCGGC

ChiA-R：GGCCATTATTCGCAGCCTCCGATCAGCC

所述的引物ChiA-F的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的引物ChiA-R的序列如SEQID NO.3所示。

进一步优选地，如上所述表达几丁质酶的工程菌的制备方法，步骤(3)中的辅助因子为HAC1，设计的引物为：

HAC1-F：ATCCGAGACGGCCAATCATTTTTTTTTTTTGTCTGTGTATTCTTCTTA

HAC1-R：ATCCGAGACGGCATGAAGCCTGCATCTCTCAGG

所述的引物HAC1-F的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的引物HAC1-R的序列如SEQID NO.5所示。

进一步优选地，如上所述表达几丁质酶的工程菌的制备方法，步骤(3)中的辅助因子为ERV29，设计的引物为：

ERV29-F：GTGGCCCAGCCGATGTCTTATCGCCCTCAGTTTCAACA

ERV29-R：ATCCGAGACGGCTCAATAGATCTTTTTCTTTTCATCAAAACTCAA

所述的引物ERV29-F的序列如SEQ ID NO.6所示，所述的引物ERV29-R的序列如SEQID NO.7所示。

由于采用上述工程菌获得的几丁质酶可水解浓度为30％左右的高浓度胶体几丁质，且水解产物的成分组成为：N-乙酰氨基葡萄糖、N,N-二乙酰基壳二糖，不含其它寡糖，因此本发明还提供了上述工程菌发酵表达的几丁质酶在水解高浓度胶体几丁质制备N-乙酰氨基葡萄糖或/和N,N-二乙酰基壳二糖中的应用，所述的高浓度为28％-32％。

最后，虽然目前已经有文献报道几丁寡糖能促进水稻和小麦种子的萌发与生长，但是其采用的均为多个糖原单位的寡糖，而本发明采用的是几丁质酶水解高浓度胶体几丁质的产物，即仅含有N-乙酰氨基葡萄糖或/和N,N-二乙酰基壳二糖。因此，本发明还提供N-乙酰氨基葡萄糖或/和N,N-二乙酰基壳二糖在促进植物种子萌发与生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和进步性：

(1)利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法，实现了几丁质酶的高量表达，且拷贝数与表达量并不是成正比；

(2)不同辅助因子的共表达，实现了几丁质酶表达量的进一步提高，其中HAC1促进作用最强；

(3)地衣芽孢杆菌WX-02来源的几丁质酶表达量和活性均为目前报道最高。

(4)利用本发明工程菌表达获得的几丁质酶，可水解浓度为30％左右的胶体几丁质，且水解产物的主要成分是N-乙酰氨基葡萄糖，其次是N,N-二乙酰基壳二糖。

(5)利用本发明工程菌表达获得的几丁质酶，其水解胶体几丁质的产物可显著促进水稻和小麦种子的萌发与生长。

附图说明

图1为几丁质酶多拷贝构建验证DNA电泳图，其中泳道1/2/3/4/5分别为几丁质酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝质粒。

图2为几丁质酶多拷贝构建质粒酶切验证DNA电泳图，其中泳道1/2/3/4/5分别为用Sal I酶切1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝。

图3为几丁质酶1、2、3、4、6拷贝菌株表达的SDS-PAGE检测图，其中泳道1/2/3/4/5/6/7分别为1-7天诱导表达上清。

图4为辅助因子和几丁质酶共表达SDS-PAGE检测图，其中泳道1/2/3/4/5/6分别为几丁质酶4拷贝菌株、辅助因子HAC1共表达菌株、辅助因子SEC16共表达菌株、辅助因子ERV29共表达菌株、辅助因COG5共表达菌株、辅助因子TRM1共表达菌株。

图5上罐发酵中酶活和细胞密度OD₆₀₀的曲线。

图6上罐发酵中不同诱导时间表达ChiA蛋白SDS-PAGE电泳图。

其中：M为蛋白marker；1-12为甲醇诱导0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120和132h的表达上清。

图7为几丁质酶水解不同浓度胶体几丁质12h。1:标准样品N-乙酰氨基葡萄糖(峰a)和N，N′-二乙酰基壳二糖(峰b)。2-7:10％、15％、25％、30％、35％、40％胶体几丁质。

图8为不同浓度几丁寡糖对水稻和小麦种子萌发的影响。(A)水稻。a-e：H₂O，50μg/mL，150μg/mL，300μg/mL和500μg/mL的几丁寡糖。(B)小麦。a-e：H₂O、1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和100μg/mL。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、表达载体的构建及蛋白质表达

1、基因序列的扩增

根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计引物对(ChiA-F、ChiA-R)。

表1：几丁质酶编码基因扩增用引物

参见表1，正向引物的下划线部分为Cpo I的酶切位点，反向引物的下划线部分为Not I酶切位点，此位点的序列设计符合T₄ DNA聚合酶作削的方法所产生的粘性末端。

PCR反应体系：

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min50s，30轮循环扩增，最后72℃延伸10min。

用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA纯化试剂盒(Omega公司)

2、重组表达载体的构建

1)将上述纯化的PCR产物用T₄ DNA聚合酶加dTTP作削的方法处理，然后进行溶液回收产物。

2)将质粒pHBM905M用Cpo I和Not I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3)将步骤1)的溶液回收产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Gold后涂布于含有100μg/mL氨苄抗生素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用引物ChiA-F和ChiA-R进行菌落PCR，筛选到含有几丁质酶基因的重组菌，抽提重组菌的质粒并进行测序验证。结果表明，在pHBM905M的Cpo I和Not I酶切位点之间插入了几丁质酶的DNA片段，该片段包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列，插入方向正确。将该重组质粒命名为pHBM905M-ChiA(A1C)。

3、几丁质酶多拷贝质粒的构建

重组载体pHBM905M-ChiA表达框的5’端含有Xba I酶切位点，3’端含有Spe I和BamH I酶切位点。因Xba I和Spe I为同尾酶，故利用Xba I/BamH I两种酶双酶切得到表达框，Spe I/BamH I两种酶双酶切得到线性化的载体，再把酶切回收得到的片段和载体通过T₄ DNA连接酶连接就可以得到我们所需的几丁质酶2拷贝质粒，命名为pHBM905M-ChiA-2copy(A2C)。如此类推，通过这3种酶酶切酶连的方法，我们可以得到3拷贝，4拷贝，6拷贝质粒，分别命名为pHBM905M-ChiA-3copy(A3C)，pHBM905M-ChiA-4copy(A5C)，pHBM905M-ChiA-6copy(A6C)。

如图1所示，构建成功的多拷贝质粒，其分子量大小会呈现一个梯度变化，随着拷贝数增加，分子量也会增强。因表达载体上有两个Sal I酶切位点，故用这个酶去切割多拷贝质粒。无论多少拷贝，酶切后总有一个DNA片段大小不变，如图2所示。

4、工程菌的制备

将构建好的几丁质酶的A1C、A2C、A3C、A4C、A6C质粒分别用Sal I线性化酶切后，溶液回收酶切产物。然后在1.5kv的条件下电转化GS115感受态后涂布组氨酸缺陷型MD平板，28℃培养2天。再将MD平板上的菌转接到YPD平板上，做好标记。然后进行一次酵母菌落PCR，缩小筛选范围，将筛选到的菌取适量进行摇瓶甲醇诱导表达。

取适量的单菌落接种于50mL BMGY培养基中培养36h左右，使其OD₆₀₀接近15左右，再将BMGY培养基通过低温离心换成25mL BMMY培养基，并每隔12h加入125μL甲醇进行诱导表达，使其终浓度为1％。每隔24h取样，所取培养液于10000rpm、4℃条件下离心5min左右收集上清，于4℃冰箱中储存。

在几丁质酶表达的实验中，几丁质酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝的表达菌株表达量逐渐提高。另外，为了研究几丁质酶表达框更多时是否能够进一步提高几丁质酶表达量，我们构建6拷贝质粒去表达几丁质酶。然而如图3所示，几丁质酶4拷贝的表达量要高于6拷贝的表达量，因此几丁质酶的表达量并不会随着表达框的增加而增加，且4拷贝的蛋白质浓度能够达到1.40mg/mL,针对胶体几丁质的活性为16.74U/mL，而6拷贝的蛋白质浓度为1.0mg/mL,针对胶体几丁质的活性为13.4U/mL。

实施例2、辅助因子基因及相关载体的构建

1、辅助因子基因扩增

根据毕赤酵母GS115来源的HAC1、ERV29、SEC16、COG5和TRM1辅助因子基因序列，设计引物进行基因扩增，这些基因分别构建在pGAPZB载体的Xho I和Xba I酶切位点之间。

参见表2，正向引物的下划线部分为Xho I的酶切位点及其在载体左端的同源序列，反向引物的下划线部分为Xba I酶切位点及其在载体的右端同源序列，此位点的序列设计符合T₅外切核酸酶构建载体的方法。

表2：辅助因子基因扩增用引物

PCR反应体系：

PCR反应条件：98℃预变性5min，98℃变性10s，56℃退火5s，72℃延伸(1kb/5s)，30个循环，最后72℃延伸5min。

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA纯化试剂盒(Omega公司生产)纯化。

2、重组表达载体的构建

1)将质粒pGAPZB用Xho I和Xba I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将回收纯化的DNA片段(HAC1、SEC16、ERV29、COG5和TRM1)和步骤1)的酶切产物用T₅外切酶的方法进行转化大肠杆菌Gold后，涂布于含有25μg/mL Zeocin的低盐LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子分别用上述的正向引物和反向引物进行菌落PCR，筛选到含有辅助因子基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证。结果表明，在pGAPZB载体的Xho I和Xba I酶切位点之间分别插入了HAC1、ERV29、SEC16、COG5和TRM1辅助因子片段，插入方向正确，将重组质粒分别命名为pGAPZB-HAC1、pGAPZB-ERV29、pGAPZB-SEC16、pGAPZB-COG5、pGAPZB-TRM1。

实施例3、辅助因子和4拷贝几丁质酶共表达重组菌株

将质粒pGAPZB-HAC1、pGAPZB-ERV29、pGAPZB-SEC16、pGAPZB-COG5、pGAPZB-TRM1分别用Avr II线性化酶切后，溶液回收酶切产物。然后在1.5kv的条件下电转化几丁质酶4拷贝基因的GS115感受态后，涂布含有100μg/mL Zeocin的YPD平板，28℃培养2天。再将YPD(Zeocin)平板上的菌转接到YPD平板上，并做好标记。然后进行一次酵母菌落PCR，缩小筛选范围。将筛选到的菌取适量进行摇瓶甲醇诱导表达。后续几丁质酶的表达步骤按照实施例2中的第5点进行甲醇诱导表达。

结果如图4显示：1为几丁质酶4拷贝对照，2/3/4/5/6分别为在几丁质酶4拷贝菌株的基础上，过表达HAC1、ERV29、SEC16、COG5和TRM1时几丁质酶的表达情况。在过表达的三个辅助因子中，SEC16、COG5、TRM1的过表达无法有效促进几丁质酶的表达，而HAC1和ERV29的过表达有明显的促进作用，且HAC1的促进效果最好。过表达HAC1的几丁质酶4拷贝菌株，蛋白质浓度达到了1.78mg/mL,针对胶体几丁质的活性达到了20.69U/mL，相对于4拷贝几丁质酶表达对照菌株，表达量提高了近27.3％，活性也提高了近23％。

实施例4、重组酵母菌株高密度发酵

基础盐培养基含有：2％NH₄H₂PO₄，0.09％CaCO₃，1.2％K₂SO₄，1％MgSO₄·7H₂O，0.4％KH₂PO₄，0.06％KOH，4％甘油，0.24mL/L豆油，4mL/L PTM1，pH 6.0。

其中PTM1含有：0.6％CuSO₄·5H₂O，0.008％KI，0.3％MnSO₄·H₂O，0.02％Na₂MoO₄·2H₂O，0.002％H₃BO₃，2％ZnSO₄·7H₂O，6.5％FeSO₄·7H₂O，0.05％CoCl₂·6H₂O，0.02％生物素，0.5％H₂SO₄(V/V)。

挑取单菌落接种至YPD培养基中，28℃，220rpm培养48h，获得种子培养液。

整个发酵过程分为三个阶段：

第一阶段，以初始发酵体积10％的接种量将种子培养液接种于基础盐培养基中，温度25℃，用氨水调节pH为6.0，通过调节通气量与搅拌转速，控制溶氧在20-30％之间。从接种开始29-30h之后，发酵罐中的甘油被耗尽，溶氧迅速上升至60％。

第二阶段，当溶氧迅速上升至60％时，开始流加50％的甘油(v/v),并控制溶氧在20-30％之间。当菌体密度OD₆₀₀达到300左右时，停止补加甘油，溶氧上升至60％左右并维持30min，之后进入第三阶段。

第三阶段，降低温度至22℃，补加酵母粉至终浓度为10％，然后开始流加甲醇诱导蛋白的表达，并控制溶氧在20-30％之间。每12h取样，通过12％的SDS-PAGE胶检测，并测定水解胶体几丁质的酶活(如图5和图6所示)。在发酵120h时，ChiA水解胶体几丁质的酶活最高，达到168.78U/mL，是摇瓶表达水平的10倍。

实施例5、水解高浓度胶体几丁质制备几丁寡糖

使用200μL几丁质酶发酵液(18U/mL)分别水解500μL浓度分别为10％，15％，25％，30％，35％，40％(w/v)的胶体几丁质。在45℃下孵育12h后，沸水浴10min终止反应。将每个样品通过0.22μm Millipore膜过滤后，通过高效液相色谱法(HPLC)分析反应产物。测定中以N-乙酰氨基葡萄糖和N，N′-二乙酰基壳二糖(峰b)作为标准品。

实验设三次重复。

结果如图7所示，当水解30％(w/v)的胶体几丁质时，得到的产物最多。当将底物浓度继续提高时，产物量不再显着增加。因此，当200μL发酵液(18U/mL)在45℃下水解500μL30％(w/v)的胶体几丁质12h可以最高效的得到几丁寡糖，转化率为72％。我们还发现，在水解产物中，主要成分是N-乙酰氨基葡萄糖，其次是N,N-二乙酰基壳二糖，不含其它寡糖。

实施例6、不同浓度几丁寡糖对种子根长及芽长的影响

1、种子的处理及培养

选择大小相近、粒度饱满的水稻和小麦种子，用水洗净，滤纸吸干种子表面水分。将处理后的水稻和小麦种子随机分成5组，放置在培养皿中。分别用H₂O，50μg/mL，150μg/mL，300μg/mL和500μg/mL的几丁寡糖(实施例5制备)浸泡水稻种子，同样小麦种子分别浸入H₂O，1μg/mL，10μg/mL，25μg/mL和100μg/mL的几丁寡糖中。每天用喷雾器喷洒对应浓度的几丁寡糖，保持种子的湿润，在室温下发芽7-10天。

2、根长和芽长的测定

分别随机取各实验组已经萌发的水稻和小麦种子，置于平整的桌面，测量水稻和小麦种子的根长与芽长。在我们的实验条件下，发现300μg/mL的几丁寡糖对水稻种子生长的促进效果最好，而促进小麦生长效果最好的几丁寡糖浓度为10μg/mL。当几丁寡糖的浓度进一步增加时，水稻和小麦的生长反而逐渐受到抑制。用300μg/mL几丁寡糖处理过的水稻种子，芽长和根长分别是是对照组的1.9倍和2倍。而用10μg/mL几丁寡糖处理过的小麦种子，芽长和根长分别是是对照组的1.8倍和2.2倍。

表3：不同浓度几丁寡糖对植物种子萌发和生长的影响

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种高效表达几丁质酶的工程菌及植物促生长应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis WX-02(地衣芽孢杆菌WX-02)

<400> 1

gattccggaa aaaactataa aatcatcggc tactatccat catggggtgc ttatggaagg 60

gattttcaag tttgggatat ggacgtttcg aaagtcagcc acattaatta tgcctttgct 120

gatatttgct gggagggaag gcatggaaac cctgatccga caggccccaa tcctcaaacg 180

tggtcatgcc aggatgaaaa cggagtgatc gacgcgccaa atggaacaat cgtgatgggc 240

gatccctgga ttgacgcaca aaagtcaaat cccggggatg tctgggatga accgatccgc 300

ggcaacttta aacaattgtt gaagctgaaa aagagccacc ctcatttgaa aacgttcata 360

tcggtcgggg ggtggacttg gtctaaccgc ttttcagatg tcgcggcaga tcctgcggca 420

agggagaatt tcgccgcttc ggccgttgag tttttaagga aatacgggtt tgacggggtc 480

gatcttgact gggaatatcc ggtcagcgga ggattgccgg ggaacagcac acgtccggaa 540

gataaaagaa actacacgct gctcctgcaa gaggtgcgca aaaaacttga cgctgcagaa 600

gcaaaagacg gcaaggaata cttgctgacg atcgcatccg gcgcaagtcc cgattatgta 660

agcaacactg agctcgataa aatcgctcaa accgtggatt ggattaacat tatgacctat 720

gactttaatg gcggatggca aagcataagc gcccataatg caccgctgtt ctatgatcca 780

aaagcgaaag aagcaggcgt tccaaacgct gagacctaca atattgaaaa cactgtgaaa 840

cgctacaagg aagccggtgt caagggtgac aaattagtgc ttggaacacc gttctacgga 900

aggggctgga gcggttgtga accagggggg cacggagaat atcagaaatg cggaccggct 960

aaagaaggga catgggaaaa gggcgtattc gatttttcag atcttgaaag gaactatgtg 1020

aatcaaaacg gctataaaag gtattggaac gatcaagcaa aagtgccgtt tttgtataat 1080

gcggaaaatg gcaatttcat cacttatgat gatgaacaat cattcggcca caaaacggat 1140

tttattaaag caaacggatt aagcggagca atgttctggg atttcagcgg cgattccaat 1200

cggacgcttc tcaataaatt ggcagccgat ttagattttg caccggacgg aggcaatccg 1260

gagccgcctt catcggcacc tgtgaatgtg cgtgtaaccg gaaaaactgc tacaagtgtc 1320

agcctggcgt gggatgcgcc gagcagcgga gcaaacattg cggaatatgt cgtgtcattt 1380

gaaaaccggt cgatatctgt aaaagaaaca tcagcggaaa taggcggctt gaagccgggt 1440

acggcctact catttactgt ttcagcaaag gatgcggatg gaaagctcca tgccggacca 1500

acggtagagg tcacgacgaa ttctgaccaa gcctgttcat atgacgaatg gaaagagacg 1560

agcgcataca caggcggaga gcgggttgca tttaacggaa aagtgtatga agcgaaatgg 1620

tggacgaaag gcgaccggcc tgatcaatcc ggtgaatggg gcgtatggcg gctgatcgga 1680

ggctgcgaat aa 1692

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcagattcc ggaaaaaact ataaaatcat cggc 34

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccattatt cgcagcctcc gatcagcc 28

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccgagacg gccaatcatt tttttttttt gtctgtgtat tcttctta 48

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccgagacg gcatgaagcc tgcatctctc agg 33

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggcccagc cgatgtctta tcgccctcag tttcaaca 38

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atccgagacg gctcaataga tctttttctt ttcatcaaaa ctcaa 45

Claims

1.一种表达几丁质酶的工程菌，其特征在于，该工程菌以毕赤酵母GS115为宿主菌，内含重组载体A和重组载体B，所述重组载体A是含有几丁质酶基因4拷贝的重组载体，所述重组载体B是插入辅助因子ERV29基因序列的重组载体，所述的几丁质酶基因来源于地衣芽孢杆菌( Bacillus licheniformis ) WX-02，所述的几丁质酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述表达几丁质酶的工程菌，其特征在于，所述重组载体A是在pHBM905M载体的Cpo I和Not I位点间插入几丁质酶的编码基因，再通过生物砖技术将几丁质酶的表达框重复构建获得4拷贝。

3.根据权利要求1所述表达几丁质酶的工程菌，其特征在于，所述重组载体B是在pGAPZB载体的Xho I和Xba I位点间插入辅助因子ERV29基因序列的重组载体。