CN116200319B - 一株一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。该基因工程菌是在马链球菌兽疫亚种ATCC39920中导入透明质酸酶基因和锌离子诱导启动子PczcD。所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述锌离子诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了该基因工程菌的构建方法及其在生产透明质酸钠中的应用。该基因工程菌将透明质酸钠的发酵制备和酶解过程两个过程合二为一既能实现透明质酸的发酵，又能通过诱导调节该工程菌株分泌透明质酸酶，一步酶解透明质酸，大大减少了工艺步骤，实现了直接从发酵液中制备低分子量透明质酸钠，极大的简化了工艺流程，工业化生产更为简便且节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及一株一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
目前透明质酸的应用范围已渗透到医药、医疗器械、化妆品、食品等多行业中，低分子量的透明质酸应用范围也在逐渐扩大，并且呈现出了比大分子量透明质酸更优异的生物活性和应用性能。其中研究表明低分子量透明质酸具有较高的医疗应用价值，例如：低分子量透明质酸可广泛用于眼科、骨科的伤口愈合和化妆品添加；当透明质酸分子量介于2-3.5KDa之间或透明质酸寡糖时，它可以促进纤维细胞增生、血管生成，诱导炎症介质的表达，抑制肿瘤生长以及促进胶原蛋白合成等功能。随着透明质酸的应用范围扩大，低分子量透明质酸钠的需求日益增大，如何获得低分子量透明质酸钠的工艺技术则成了研究重点。
目前制备低分子量透明质酸钠的方法主要是通过物理法、化学法、酶法降解大分子透明质酸，物理或化学的方法反应条件剧烈，往往会破坏单糖残基结构，且非特异性降解糖苷键，无法保持透明质酸的生物活性。工业化制备低分子量透明质酸钠多为酶解透明质酸钠，酶法降解可特异性降解糖苷键，反应温和。现今常规制备低分子量透明质酸产品多采用对已纯化的高分子量透明质酸进行水解，进而纯化分离酶解液得到低分子量透明质酸钠，高分子量透明质酸钠则由发酵纯化制得，该方法工艺路线长，副产物多，同时该手段水解效率不稳定、产品收率低、水解过程会引入多种杂质需要进行二次纯化等多种缺陷。
在现有技术中曾构建表达透明质酸酶的乳酸克鲁维酵母，将该酵母生产出的透明质酸酶纯化，制得后与工程菌株共同进行发酵，或者将酶进行灭菌在发酵中途加入到发酵罐中，进一步纯化后得到低分子量透明质酸钠。但该方法存在两个缺点，首先该工艺工业化操作过程中需要提前通过工程菌构建、发酵、纯化制备透明质酸酶，需要经过乳酸克鲁维酵母和透明质酸生产菌株两次发酵过程和透明质酸酶提取纯化步骤，实际操作过程周期长且步骤繁琐。其次，在利用兽疫链球菌发酵生产透明质酸时，当透明质酸的产量超过4-5g/L的情况下发酵液的粘稠度会急剧上升，随着发酵液的粘稠度上升会导致发酵液中溶氧能力下降，最终会导致菌体生长使用无氧呼吸合成大量的乳酸，乳酸的积累不仅会导致碳源的浪费并会导致对菌体生长的抑制以及对透明质酸合成的抑制。因此，构建一种可以一步发酵生产低分子量透明质酸的工程菌，以提高低分子量透明质酸钠的生产效率和产量成本，成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一株一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌，所述基因工程菌是在马链球菌兽疫亚种ATCC39920中导入透明质酸酶基因和锌离子诱导启动子PczcD。
根据本发明优选的，所述透明质酸酶基因为已公开的可水解透明质酸的任意酶，包括但不限于透明质酸裂解酶、透明质酸-4-糖苷水解酶和透明质酸-3-糖苷水解酶。
进一步优选的，所述透明质酸酶基因为来自兽疫链球菌的透明质酸裂解酶基因hyl，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应兽疫链球菌。
根据本发明优选的，所述锌离子诱导启动子PczcD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述一步发酵生产透明质酸的基因工程菌的构建方法，包括步骤如下：
(1)人工合成如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的透明质酸裂解酶基因hyl序列和锌离子诱导启动子PczcD序列；
(2)以透明质酸裂解酶基因hyl为模板进行PCR扩增，得到透明质酸裂解酶基因hyl序列，以锌离子诱导启动子PczcD为模板进行PCR扩增，得到锌离子诱导启动子PczcD序列；然后通过融合PCR将透明质酸裂解酶基因hyl和锌离子诱导启动子PczcD进行融合，得到融合片段PczcD-hyl；
(3)将融合片段PczcD-hyl连接至载体pAE03中，得到重组质粒pAE-hyl；
(4)将兽疫链球菌制备成电转感受态，然后将重组质粒pAE-hyl转化至兽疫链球菌中，挑选阳性转化子，得到一步发酵生产透明质酸的基因工程菌。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述透明质酸裂解酶基因hyl的PCR引物序列如下：
hyl-R：5′-CTATGATAAGGCCTTAAAAGATAGCTGC-3′；
hyl-F：5′-ATGGCAACAGGAACTGAGAAAAAACAC-3′；
所述锌离子诱导启动子PczcD的PCR引物序列如下：
PczcD P1：5′-GGGAATTCCATGATAGGACACTTAAGGCAAATTG-3′；
PczcD-A P2：5′-TTATGAGGTTTTTTAATGTTCTCATCATATTTCTCATTCC-3′。
根据本发明优选优选的，步骤(2)中，所述融合PCR中透明质酸裂解酶基因hyl和锌离子诱导启动子PczcD的摩尔比为1：1。
本发明还提供上述基因工程菌在生产透明质酸钠中的应用。
根据本发明优选的，所述生产透明质酸钠的工艺如下：
1)将上述基因工程菌按照5～10％的接种量接入发酵罐中，在温度36～38℃、转速98～102rpm、pH值7.00～8.00、通气量10～50m3/h，罐内压力0.04～0.07MPa的条件下发酵培养至粘度为7800～8200Pa·s，然后流加补入含有硫酸锌的培养基至硫酸锌在发酵体系中的终浓度为0.05～0.5moL/L，得到发酵产物；
2)向发酵产物中加入酒精至酒精终浓度为50％，搅拌后静置至分层，去除上清洗涤沉淀，然后将沉淀溶解于氯化钠溶液中，在pH值10～10.5，50℃条件下碱解2h，过滤得滤液，调节pH至6.0，加入4％活性炭进行搅拌吸附，过滤得滤液；向滤液中再次加入酒精终浓度为50％，搅拌后静置，搅拌后静置至分层，去除上清洗涤沉淀，经真空干燥后，得到透明质酸钠。
根据本发明优选的，步骤1)中，所述发酵罐中含有葡萄糖80g/L、蛋白胨16.5g/L、酵母粉5.00g/L、谷氨酸钠3.5g/L、磷酸氢二钾硫酸镁0.8g/L、消泡剂0.2g/L。
根据本发明优选的，步骤1)中，所述含有硫酸锌的培养基为含有20g/L葡萄糖溶液。
根据本发明优选的，步骤1)中，所述发酵培养为培养至粘度8000Pa·s。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一株一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌，将透明质酸钠的发酵制备和酶解过程两个过程合二为一既能实现透明质酸的发酵，又能通过诱导调节该工程菌株分泌透明质酸酶，一步酶解透明质酸，大大减少了工艺步骤，实现了直接从发酵液中制备低分子量透明质酸钠，极大的简化了工艺流程，工业化生产更为简便且节约成本。
2、本发明提供了一步发酵生产透明质酸钠的工艺，在发酵前期进行透明质酸的发酵，当发酵液黏度增加后，通过添加含有硫酸锌的培养基诱导调节工程菌株分泌透明质酸酶，实现了一边产透明质酸，一边酶切降解，降低发酵液黏度，提高传质传热，增加溶氧量，解决因发酵液黏度过高导致分离纯化困难的问题，同时提高了透明质酸的产量。相于现在工业化所采用的低分子量透明质酸钠酶解制备方法，本发明中的一步发酵法制备效率更高，在10L发酵罐发酵产量可达到49.78～58.46g/L。
3、本发明通过控制诱导剂硫酸锌的加入时间和加入量，实现了一步发酵发获得低分子量的透明质酸产品，省去了下游碱降解步骤。
4、本发明提供了一步发酵生产低分子量透明质酸钠的工艺可以通过调节诱导剂硫酸锌在发酵体系中的终浓度控制透明质酸裂解酶的表达量，进而控制产物透明质酸钠样品的分子量，实现了根据实际要求生产特定分子量范围的透明质酸钠，使得生产更加灵活方便。
附图说明
图1为实施例1中透明质酸裂解酶目的基因的电泳图；
图中泳道1和泳道2均为目的基因。
具体实施方法
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
本发明中使用的马链球菌兽疫亚种ATCC39920、大肠杆菌均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。
本发明使用的载体pAE03，购自BioVector NTCC典型培养物保藏中心，该载体中含有红霉素抗性基因与潮霉素抗性基因，可通过在多克隆位点插入的DNA序列与马链球菌兽疫亚种ATCC39920基因组的DNA序列进行单臂交换重组后整合至基因组中。
实施例1、基因工程菌的构建
1、根据如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成透明质酸裂解酶基因hyl序列和锌离子诱导启动子PczcD序列。
然后以透明质酸裂解酶基因hyl为模板，以hyl-R/hyl-F为引物进行PCR扩增，得到透明质酸裂解酶基因hyl序列，引物序列如下：
hyl-R：5′-CTATGATAAGGCCTTAAAAGATAGCTGC-3′；
hyl-F：5′-ATGGCAACAGGAACTGAGAAAAAACAC-3′。
以锌离子诱导启动子PczcD为模板，以PczcD P1/PczcD-A P2为引物进行PCR扩增，得到锌离子诱导启动子PczcD序列，引物序列如下：
PczcD P1：5′-GGGAATTCCATGATAGGACACTTAAGGCAAATTG-3′；
PczcD-A P2：5′-TTATGAGGTTTTTTAATGTTCTCATCATATTTCTCATTCC-3′。
其中，PCR扩增的体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，模板DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH2O补足50μL；
PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；98℃变性10sec，68℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。
2、将扩增得到的透明质酸裂解酶基因hyl序列和锌离子诱导启动子PczcD序列，按照摩尔比1：1进行融合PCR扩增，得到融合片段PczcD-hyl。
其中，融合PCR扩增体系为：10μM上游引物1.5μL，10μM下游引物1.5μL，模板DNA1μL，dNTP混合物0.5μL，5×Fusion缓冲液10μL，Fusion酶1μL，ddH2O补足50μL。
融合PCR扩增的程序为：95℃5min，12个扩增循环(95℃30s，70℃1s，55℃30s，68℃2min)，23个扩增循环(95℃30s，70℃1s，55℃30s，68℃120s+10*循环数s)，68℃5min。
对融合片段PczcD-hyl和载体pAE03用EcoRI酶进行单酶切，将酶切产物跑胶回收，并通过T4 DNA连接酶连接过夜，然后将融合片段PczcD-hyl插入至载体pAE03的EcoRI位点中，再转化至大肠杆菌中，获得载体pAE-hyl。
3、利用质粒小量提取试剂盒提取得到重组质粒pAE-hyl，线性化处理后用DNA纯化试剂盒进行回收，得到线性化的重组质粒pKLAC1-hyl。通过电脉冲法(电压为2500V)将线性化的质粒DNA片段转化到兽疫链球菌感受态细胞中，电击完毕迅速加入含有1mol/L山梨醇的LB液体培养基，37℃孵育菌体4小时。在具有潮霉素与红霉素抗性的LB固体上筛选培养2～3天，待单克隆长出，挑选阳性重组子，提取该兽疫链球菌基因组，利用PCR反应对筛选到的阳性转化子进行鉴定，得到一步发酵生产透明质酸的基因工程菌。所述鉴定结果如图1所示，由图1可知凝胶电泳图中出现目的条带且条带单一，说明透明质酸裂解酶基因重组表达成功。
实施例2、基因工程菌的发酵培养
在10L发酵罐中添加发酵培养基，然后按照5％的接种量将实施例1构建的基因工程菌接入发酵罐中，控制培养温度为37℃，转速为100rpm，pH值为7.00～8.00，调节通气量为10～50m3/h，罐内压力0.05MPa，在此条件下发酵培养16h，得到发酵产物。
向发酵产物中加入酒精至酒精终浓度为50％，搅拌后静置至分层，去除上层酒精上清，用50％酒精洗涤沉淀2次。然后将沉淀溶解于4％氯化钠溶液中，调节pH值为10～10.5，在50℃下碱解2h，过滤得滤液，调节滤液pH至6.0，按4％的质量比加入活性炭进行搅拌吸附，过滤得滤液，再次向滤液中加入酒精至酒精终浓度为50％，搅拌后静置至分层，去除上层酒精上清，用50％酒精洗涤沉淀2次，在60℃条件下真空干燥后，得到透明质酸钠样品一。
实施例3、一步发酵生产透明质酸钠
利用实施例1构建的基因工程菌一步发酵生产透明质酸钠，包括步骤如下：
1)将实施例1构建的基因工程菌按照5％的接种量接入10L发酵罐中，在温度37℃、转速100rpm、pH值7.5、通气量30m3/h，罐内压力0.05MPa的条件下发酵培养16h，然后流加补入含有硫酸锌的培养基至硫酸锌，其中1号罐中硫酸锌在发酵体系中的终浓度为0.05moL/L，2号罐中硫酸锌在发酵体系中的终浓度为0.2moL/L，3号罐中硫酸锌在发酵体系中的终浓度为0.5moL/L，补料结束后继续发酵培养6h，每小时取样测黏度，得到发酵产物；
2)向发酵产物中加入酒精至酒精终浓度为50％，搅拌后静置至分层，去除上层酒精上清，用50％酒精洗涤沉淀2次。然后将沉淀溶解于4％氯化钠溶液中，调节pH值为10～10.5，在50℃下碱解2h，过滤得滤液，调节滤液pH至6.0，按4％的质量比加入活性炭进行搅拌吸附，过滤得滤液，再次向滤液中加入酒精至酒精终浓度为50％，搅拌后静置至分层，去除上层酒精上清，用50％酒精洗涤沉淀2次，在60℃条件下真空干燥后，得到透明质酸钠样品二、透明质酸钠样品三和透明质酸钠样品四。
步骤(1)中取样测黏度的测定结果如下表1所示。
表1、各发酵罐中发酵液黏度值
当10L发酵罐黏度达到8000mPa·s左右时，由于发酵液黏度和溶氧参数已经不能满足兽疫链球菌产生透明质酸的培养条件，常作为发酵终点。但是本发明在发酵达到终点时，通过流加补料加入含有诱导剂硫酸锌的培养基，诱导透明质酸裂解酶表达，分泌透明质酸酶到发酵液中，酶解高分子透明质酸，有效地降低发酵液黏度。由表1可知，在添加硫酸锌后1～3h内，发酵液黏度急剧降低，证明透明质酸酶已经在发酵液中酶解高分子透明质酸，降低透明质酸分子量，进而增加透明质酸钠的产量。
实施例4、透明质酸钠产量和平均分子量的测定
将实施例2和实施例3得到的透明质酸钠样品一和透明质酸钠样品二、三、四称重，计算发酵罐产量。然后称取部分样品溶解，利用全自动乌氏粘度计测试出特性黏数，经过下列公式计算，算出平均分子量，结果如表2所示。
表2
由表2可知，在未添加诱导剂硫酸锌的条件下，发酵所得透明质酸钠样品一的平均分子量为2380kDa，产量仅为12.64g/L。当添加诱导剂硫酸锌后，透明质酸钠样品的产量达到了49.78～58.46g/L，相较于实施例2增加3～4倍，而且平均分子量也得到降低。同时，本发明还发现了通过调节诱导剂硫酸锌在发酵体系中的终浓度，可以控制透明质酸裂解酶的表达量，进而控制产物透明质酸钠样品的分子量，可以根据实际要求生产特定分子量范围的透明质酸钠，使得生产更加灵活方便。
Claims (4)
1.一种一步发酵生产低分子量透明质酸钠的方法，其特征在于，包括步骤如下：
1）将一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌按照5~10%的接种量接入发酵罐中，在温度36~38℃、转速98~102rpm、pH值7.00~8.00、通气量10~50 m3/h，罐内压力0.04~0.07 MPa的条件下发酵培养至粘度为7800~8200Pa·s，然后流加补入含有硫酸锌的培养基至硫酸锌在发酵体系中的终浓度为0.05~0.5moL/L，得到发酵产物；
2）向发酵产物中加入酒精至酒精终浓度为50%，搅拌后静置至分层，去除上清洗涤沉淀，然后将沉淀溶解于氯化钠溶液中，在pH值10~10.5，50℃条件下碱解2h，过滤得滤液，调节pH至6.0，加入4%活性炭进行搅拌吸附，过滤得滤液；向滤液中再次加入酒精至终浓度为50%，搅拌后静置至分层，去除上清洗涤沉淀，经真空干燥后，得到透明质酸钠；
其中，步骤1）中，所述一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌是在马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）ATCC39920中导入透明质酸酶基因和锌离子诱导启动子PczcD；
所述透明质酸酶基因为来自兽疫链球菌（Streptococcus equi subsp.zooepidemicus）的透明质酸裂解酶基因hyl，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述锌离子诱导启动子PczcD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌的构建方法包括步骤如下：
（1）人工合成如SEQ ID NO.1所示的透明质酸裂解酶基因hyl序列和SEQ ID NO.2所示的锌离子诱导启动子PczcD序列；
（2）以透明质酸裂解酶基因hyl为模板进行PCR扩增，得到透明质酸裂解酶基因hyl序列，以锌离子诱导启动子PczcD为模板进行PCR扩增，得到锌离子诱导启动子PczcD序列；然后通过融合PCR将透明质酸裂解酶基因hyl和锌离子诱导启动子PczcD进行融合，得到融合片段PczcD-hyl；
（3）将融合片段PczcD-hyl连接至载体pAE03中，得到重组质粒pAE-hyl；
（4）将马链球菌兽疫亚种ATCC39920制备成电转感受态，然后将重组质粒pAE-hyl转化至马链球菌兽疫亚种ATCC39920中，挑选阳性转化子，得到一步发酵生产低分子量透明质酸的基因工程菌。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述透明质酸裂解酶基因hyl的PCR引物序列如下：
hyl-R：5′-CTATGATAAGGCCTTAAAAGATAGCTGC -3′；
hyl-F：5′- ATGGCAACAGGAACTGAGAAAAAACAC -3′。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述融合PCR中透明质酸裂解酶基因hyl和锌离子诱导启动子PczcD的摩尔比为1：1。
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