KR20130128655A - 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 발효를 통해 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액을 제조하고, 상기 미생물 배양액에 수산화나트륨 수용액을 첨가한 다음, 불순물을 제거하여 제조되는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 복잡한 정제단계를 생략하고 단순화된 방법을 통해 미생물 배양액 내에 존재하는 다양한 불순물들을 효과적으로 제거하여 고순도의 저분자량 히알루론산을 효율적으로 정제 및 제조할 수 있다.

Description

저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법{Preparation method of low molecular weight sodium hyaluronate}
본 발명은 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 발효를 통해 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액을 제조하고, 상기 미생물 배양액에 수산화나트륨 수용액을 첨가한 다음, 불순물을 제거하여 제조되는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법에 관한 것이다.
히알루론산(hyaluronic acid)은 연결조직의 세포 간 물질(intercellular matrix)의 구성성분으로, 1934년 Meyer와 Palmer에 의해 소 눈의 초자체에서 처음 발견되었다. 히알루론산은 자연계에 널리 존재하는 생체 고분자물질로 분자량은 1kDa~10,000kDa까지 다양하게 존재하며, 무색의 투명한 고점도성으로 피부, 근육, 힘줄, 연골, 관절 등 조직에서 세포와 세포 사이의 공간을 채우고 있고, 특히 태반과 관절액에 다량 존재한다.
히알루론산은 선형의 다당류로써 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)과 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)으로 구성된다.
이러한 히알루론산은 당 단백질 CD44와 결합하는 특성을 가지며, 체내에 존재하는 천연 물질로, 거부반응이나 부작용이 없고 통증이나 염증을 일으킬 확률이 적기 때문에 의료용으로 다양하게 이용될 수 있다. 천연 고분자인 히알루론산은 안과 수술용으로 사용하기 시작하여, 관절염치료제, 외과 수술 후의 유착 저해제 등으로 광범위하게 사용되고 있다. 또한, 분자 내 카르복실기 및 수산화기가 다량 존재하기 때문에 친수성으로 보습효과가 탁월해 화장품 산업에도 광범위하게 적용되고 있다.
히알루론산은 동물의 태반이나 수탉의 벼슬에서 추출할 수도 있고, 미생물 발효를 통하여 생산할 수도 있다. 그러나, 생체조직으로부터 히알루론산을 추출할 경우에는 콘드로이친(chrondroitin), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 등의 불순물을 제거하기 위한 정제 과정이 복잡하고, 이에 많은 비용이 소요된다는 단점이 있다. 이에 반해 미생물 발효를 통한 히알루론산의 생산방법은 상대적으로 생산 비용이 적고, 수율이 높으며, 정제방법이 비교적 간단하다는 장점이 있다.
한편, 체내에서 히알루론산은 히알루로니다아제에 의해 빠른 대사과정을 겪게 되고 생체고분자로써 체내에서 장시간 동안 이용되기 위해서는 고분자량의 히알루론산이 필요하다. 그러나, 고분자량의 히알루론산은 작은 크기의 모공을 통과할 수 없기 때문에 화장품용으로 이용하기에는 부적합한 등 용도에 따라 적합한 분자량의 히알루론산 나트륨이 필요하다. 저분자량 히알루론산은 화장품용으로 이용하기에 적합하고, 점도가 낮아 정제에 필요한 복잡한 과정을 생략할 수 있어 경제적인 히알루론산 생산이 가능하다. 히알루론산을 저분자화하여 표적화 약물에 이용하거나, 화장품용으로 사용하기 적합하다.
히알루론산을 저분자화하는 방법으로는 감마선을 사용하는 분해방법, 초음파를 사용하는 방법, 자외선을 이용하는 방법, 열을 가하는 방법, 산이나 알칼리 처리에 의한 방법, 히알루론산 분해 효소를 사용하는 방법 등이 있다. 이러한 방법은 이미 제조된 고분자량의 히알루론산을 저분자화 할 때 적합한 방법으로, 저분자화 과정에서 추가적인 처리과정과 공정이 요구되어 비용이 상승한다는 문제가 있다.
국내공개특허 제2008-0046821호 국내등록특허 제10-0381408호
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 기존의 복잡한 정제단계를 생략하고 단순화된 방법을 통해 미생물 배양액 내에 존재하는 다양한 불순물들을 효과적으로 제거하여 고순도의 저분자량 히알루론산을 효율적으로 정제 및 제조할 수 있는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 생산성을 높이고 생산단계를 줄여 생산단가를 절약할 수 있는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 고순도의 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 의료용, 의약용, 식품용 및 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 S1) 미생물 발효를 통해 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액을 제조하는 단계; S2) 상기 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액에 염화나트륨 수용액 및 수산화나트륨 수용액을 첨가하는 단계; S3) 상기 수산화나트륨 수용액이 첨가된 미생물 배양액으로부터 균체 및 부유 불순물을 제거하는 단계; S4) 상기 균체가 제거된 미생물 배양액을 여과 및 투석하여 정제된 히알루론산 수용액을 얻는 단계; 및 S5) 상기 정제된 히알루론산 수용액에 유기용매를 첨가하여 히알루론산을 침전시키고 건조하여 분말형태의 히알루론산 나트륨을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법을 제공한다.
상기 S1)단계의 미생물은 히알루론산 생산균으로, 스트렙토코커스 이퀴, 스트렙토코커스 주에피데미커스, 스트렙토코커스 파이오젠 등을 사용할 수 있다. 특히, 상기 미생물은 스트렙토코커스 주에피데미커스(streptococcus equi subsp. zooepidemicus, ATCC 39920)를 사용하는 것이 좋다.
또한, 상기 S1)단계의 미생물 발효는 종균배양, 계대배양 및 본배양의 단계로 수행될 수 있다.
상기 S2)단계의 염화나트륨 수용액은 미생물 배양액에 1:0.5 내지 1:2의 부피비로 첨가되며, 수산화나트륨 수용액은 배양액의 pH가 12 내지 14가 되도록 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 S3)단계의 고속원심분리는 8,000 내지 15,000rpm에서 30~60분 동안 수행되는 것이 바람직하다.
상기 S4)단계의 여과는 제균필터를 사용하여 수행되며, 투석은 MWCO(molecular weight cut off) 12,000 내지 14,000Da인 투석막을 사용하여 24 내지 40시간 동안 수행될 수 있다.
상기 S5)단계의 유기용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 이소프로필알코올 등이 사용될 수 있다.
상기와 같이 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨은 분자량이 300 내지 500kDa인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기와 같이 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기와 같이 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기와 같이 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기와 같이 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 기존의 복잡한 정제단계를 생략하고 단순화된 방법을 통해 미생물 배양액 내에 존재하는 다양한 불순물들을 효과적으로 제거할 수 있으며, 생산성을 높이고 생산단계를 줄여 생산단가를 절약할 수 있는 효과가 있다. 즉, 본 발명은 미생물 배양 종료 후 정제과정에서 히알루론산이 저분자화되고 점도가 낮아지기 때문에 비교적 단순화된 방법으로 저분자량의 히알루론산 나트륨의 제조가 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명은 고순도의 저분자량 히알루론산을 효율적으로 정제 및 제조할 수 있어 의료용, 의약용, 식품용 및 화장료 조성물에 사용하기 적합하다.
도 1은 본 발명에 따른 히알루론산 나트륨의 제조방법을 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 균체(S. zooepidemicus)의 계대배양 시 대수성장기를 확인하기 위하여 1차, 2차, 3차 성장곡선을 측정한 그래프이다(a: 1차 배양 b: 2차 배양 c: 3차 배양).
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 균체(S. zooepidemicus)의 본배양 시 배지의 점도를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 표준곡선을 통하여 저분자량 히알루론산 나트륨의 분자량과 점도를 측정한 분자량 도표를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨의 1H-NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다(a: 시판되는 히알루론산 나트륨 b: 본 발명의 히알루론산 나트륨).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨의 FT-IR 분석결과를 나타낸 그래프이다(a: 시판되는 히알루론산 나트륨 b: 본 발명의 히알루론산 나트륨).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적으로 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액은 점도가 높기 때문에 정제방법이 비효율적일 수밖에 없고, 단순한 과정으로 정제하기 곤란하고 복잡하기 때문에 추가적인 공정이 필요하다. 이에 본 발명에서는 미생물 배양액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 미생물 배양액의 점도를 감소시키고 저분자화를 유도한 후 고속원심분리 방법을 통해 불순물을 제거하는 방법으로 공정을 단순화시켜 고순도의 저분자량 히알루론산 나트륨을 효율적으로 정제 및 제조하고자 하였다.
본 발명의 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법을 자세히 설명하면 다음과 같다.
S1) 미생물 배양액 제조
먼저, 미생물 발효를 통해 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액을 제조한다.
상기 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액은 히알루론산의 생산균주로서 공지된 균주, 예를 들어 스트렙토코커스 속 균주, 바람직하게는 스트렙토코커스 이퀴, 스트렙토코커스 주에피데미커스, 스트렙토코커스 파이오젠 등을 각 균주에 대해 공지된 배양 조건하에 배양하여 얻을 수 있다. 구체적인 균주의 종류 및 배양조건은 당업계에 공지되어 있다.
특히, 본 발명에서는 스트렙토코커스 에퀴(streptococcus equi)의 아종 주에피데미커스(zooepidemicus)로써 돌연변이 유발물질인 NTG를 사용하여 용혈성이 결여되고 히알루론산 생산성이 우수한 변종으로 고분자량의 히알루론산 생산이 가능하도록 HA-116이라는 이름으로 디자인된 스트렙토코커스 주에피데미커스(streptococcus equi subsp. zooepidemicus, ATCC 39920)를 American Type Culture Collection으로부터 분양받아 사용하였다.
또한 상기 S. zooepidemicus 배양은 우수한 군락의 균주를 채취하기 위한 종배양 단계, 균체를 활성화시키기 위한 계대배양 단계 및 활성화된 균체 배양액을 본배양 배지에 접종하여 배양하는 본배양 단계를 통하여 수행될 수 있다.
상기 종배양, 계대배양 및 본배양은 S. zooepidemicus에 대해 공지되어 있는 통상의 배지와 배양조건을 통하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 종배양에서는 혈액한천배지(blood agar medium)를 사용하며, S. zooepidemicus 중 성장속도가 빠르고 생산력이 우수한 비용혈성 군락을 채취한다. 그 다음, 계대배양에서는 TSB(trypic soy broth) 액체배지에 상기 종배양 단계에서 채취한 우수 군락의 균체를 수회 활성화시킨다. 이어, 상기 활성화된 균체 배양액은 본배양 배지에 접종하여 배양하게 된다.
상기 본배양 배지는 덱스트로즈(dextrose), 효모추출물(yeast extract), 카제인 다이제스트(casein digest), L-글루탐산(L-glutamic acid), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 인산칼륨(potassium phosphate), 염화나트륨(sodium chloride), L-글루타민(L-glutamine), 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid, 분자량 50~500kDa) 등의 성분으로 이루어진다. 이때, 상기 본배양 배지에 사용되는 글루탐산과 글루타민은 균체의 형성과 증식에 도움을 주어 결과적으로 히알루론산의 분자량 증가에 영향을 줄 수 있다. 또한 상기 폴리감마글루탐산은 히알루론산 분해효소인 히알루로니다아제를 억제하는 기능을 가지는데, 이는 히알루론산을 합성하는 미생물이 가지고 있는 히알루로니다아제 활성을 억제시켜 생산되는 히알루론산의 분자량을 상승시킬 수 있게 된다.
상기 본배양이 시작된 시점부터 배지의 점도가 지수적으로 증가하는 추세를 관찰하여 균체에 의한 히알루론산의 생산이 본격적으로 이루어지는 시점을 파악하여 해당시점부터 배지의 효율적인 혼합을 위해 교반속도를 높여주는 것이 좋으며, 점도가 감소하는 시점을 기준으로 하여 배양을 종료하고 배양액의 정제를 시작할 수 있다.
S2) 염화나트륨 수용액 및 수산화나트륨 수용액 첨가
상기 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액을 제조한 이후에 상기 배양액에는 염화나트륨 수용액과 수산화나트륨 수용액을 첨가한다.
상기 염화나트륨 수용액은 배양이 완료된 배양액을 희석시켜 균체와 히알루론산을 분리하도록 하는 작용을 한다.
상기 염화나트륨 수용액은 미생물 배양액에 대해 1:0.5 내지 1:2의 부피비, 바람직하게는 1:1의 부피비로 첨가하는 배양액의 농도를 절반으로 희석하는 것이 배양액에 함유된 균체와 히알루론산의 효율적인 분리에 있어 더욱 바람직하다.
상기와 같이 염화나트륨 수용액의 첨가로 희석된 미생물 배양액에는 이후 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 미생물 배양액의 점도를 감소시킨다.
일반적으로 히알루론산을 포함하고 있는 미생물 배양액은 점도가 높기 때문에 정제의 방법이 비효율적일 수밖에 없고, 단순한 과정으로는 정제하기 곤란하고 그 과정이 복잡하여 추가적인 공정이 필요하였다. 그러나, 본 발명에서는 상기와 같이 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 미생물의 배양액의 점도를 감소시킴으로써 히알루론산을 비교적 간단한 방법으로 정제할 수 있고, 고순도의 히알루론산 나트륨을 효율적으로 제조할 수 있게 되는 것이다.
상기 수산화나트륨 수용액은 희석된 배양액의 pH가 12 내지 14가 되도록 배양액에 첨가되는 것이 바람직하며, 구체적으로 배양액에 1 내지 2중량%로 첨가되는 것이 바람직하다. 상기 pH가 12 이하일 경우에는 점도의 감소폭이 미미하기 때문에 고속원심분리로 효율적인 불순물 제거가 어려울 수 있고, 수산화나트륨 수용액의 과량 첨가로 pH가 14에 가까워질수록 분자량이 과도하게 작게 분해될 수 있기 때문에 적절한 pH를 유지하는 것이 무엇보다 중요하다.
S3) 균체 및 불순물 제거
이어, 상기 수산화나트륨 수용액이 첨가된 미생물 배양액으로부터 균체를 제거한다.
상기 미생물 배양액으로부터 균체를 제거하기 위해서는 당업계에서 공지된 임의의 방법, 예를 들어 원심분리, 유기산 침전, 여과(filtration) 등의 방법이 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에서는 통상의 고속 원심분리장치를 사용하여 분당회전속도 8,000 내지 15,000rpm의로 30 내지 60분 동안 고속으로 원심분리하여 미생물 배양액 내에 존재하는 균체 및 부유 불순물을 제거하였다.
S4) 여과 및 투석
상기 고속원심분리를 통해 균체 및 부유 불순물이 제거된 미생물 배양액은 이후 여과 및 투석을 통하여 잔류 배지 및 수산화나트륨을 제거한다.
상기 여과는 제균필터(pore size 0.22㎛)를 사용하여 감압 여과할 수 있으며, 투석은 MWCO(molecular weight cut off) 12,000 내지 14,000Da인 투석막을 사용하여 24 내지 40시간 동안 투석하는 것이 바람직하다.
상기와 같은 여과 및 투석을 통하여 미생물 배양액에 잔류하는 배지성분과 수산화나트륨이 제거된 정제된 히알루론산 수용액을 얻을 수 있게 된다.
S5) 침전 및 건조
상기 정제된 히알루론산 수용액은 히알루론산의 회수를 위하여 유기용매를 첨가하여 침전시킨 후 건조하는 공정을 실시한다.
상기 유기용매로는 당업계에서 사용되는 통상의 유기용매를 사용할 수 있음은 물론이며, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 아세톤, 이소프로필알코올 등이 사용될 수 있다. 또한, 추가적으로 불순물을 제거하고 건조를 용이하게 하기 위해서는 침전 후 추가로 유기용매를 사용하여 세척하는 과정을 수행할 수도 있다.
이같이 유기용매로 침전된 히알루론산은 당업계에 알려진 통상의 건조방법, 예를 들어 질소 또는 공기 퍼징, 동결 건조, 진공 건조 등의 방법으로 건조시켜 분말형태의 히알루론산 나트륨을 얻을 수 있다.
상기와 같이 얻어진 본 발명의 히알루론산 나트륨은 분자량이 300 내지 500kDa인 것이 바람직하다.
본 발명자들은 최종적으로 얻어진 히알루론산 나트륨에 대하여 균체의 성장곡선 및 배양액의 점성을 측정하여 배양의 종류 및 배양액의 정제를 시작할 시기를 판단하고, 본 발명에 따라 정제 및 제조된 히알루론산 나트륨의 점도 및 분자량을 측정하였다. 또한, 히알루론산 나트륨의 단백질 및 핵산의 함량을 측정하였으며, 1H-NMR과 FT-IR을 이용하여 구조분석을 실시하였다.
또한 본 발명은, 상기와 같이 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 의료용, 의약용, 식품용, 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 의료용 조성물은 관절액 및 초자체액의 대용물, 약물의 제어 방출 매트릭스, 또는 항부착제, 고체 혹은 반고체의 형태 혹은 주형가능한 형태의 혈관 보철물(혈관의 항부착성 드레싱, 인공심장 밸브 등), 안과 물품(렌즈 대용품, 콘택트렌즈), 복부, 부인과, 성형외과, 정형외과, 안과학, 흉과, 이비인후과의 수술의 항부착성 이식물 등에 적용이 가능하다.
본 발명에 따라 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골순, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 경구투여, 비경구 투여용, 주사용 등의 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 제제화에 필요한 통상의 성분들과 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 엘릭시르(elixirs), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이때, 정제, 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 혼합할 수도 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 혼합할 수도 있다.
또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화 할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 약학적 조성물의 유효투입량은 환자의 연령, 신체적 조건, 몸무게 등의 상태를 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위로 조절될 수 있다. 일반적으로, 상기 약학적 조성물의 유효투입량은 성인 환자 체중 1㎏ 당 1 내지 200㎎/일이고, 바람직하기로는 5 내지 100㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2회 내지 5회 분할 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 식품용 조성물을 제공한다.
상기 식품용 조성물로는 그 종류가 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품으로 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수도 있다. 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류 등으로 제조될 수도 있다. 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있음은 물론이다.
또한, 본 발명의 식품용 조성물에 포함되는 저분자량 히알루론산 나트륨은 통상의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수도 있다.
상기 식품류로는 전형적인 식품뿐만 아니라, 음료(알콜성 음료도 포함함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용 식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소오스 등) 등을 포함함은 물론이다.
또한, 본 발명에 따라 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 저분자량 히알루론산 나트륨을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 저분자량 히알루론산 나트륨은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로션제, 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다.
화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알콜, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸 알코올, 유동 파라핀 등이 있다.
상기와 같은 본 발명의 화장료 조성물은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면, 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕에 탐) 등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1-1. 미생물 배양액 제조
본 실시예에서 사용된 균주는 American Type Culture Collection으로부터 분양받은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, ATCC 39920)를 사용하였다. 계대배양을 통해 활성화한 후, 50% 글리세롤을 사용하여 고정시키고 -80℃에서 보존하였다.
(종배양)
혈액한천배지(Blood agar base) 42g을 3차 증류수 1L에 용해시킨 후, 121℃에서 15분간 고압 증기 멸균하여 제조하고, 상기 배양액에 면양혈액(sheep blood) 5중량%로 첨가하여 혼합하였다. 혼합된 배지를 페트리디쉬(Petri dish)에 1/3정도 부어준 후 굳혔다. 그 다음, 동결보존상태의 균체(S. zooepidemicus)를 해동시켜 상기 혼합된 배지에 10μl로 드롭핑(dropping)하여 도말하고 37℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.
란스필드 그룹(Lancefield group) A, C군의 경우 베타용혈현상을 일으키는데, 이는 혈액한천상에서 세균이 생산하는 독소로 인해 일어나는 것으로, 완전 용혈에 의해 투명한 용혈환이 생기는 용혈을 말한다. 베타용혈은 군락 주위로 크고 거의 투명에 가까운 배경이 나타나므로, 이러한 현상이 나타나지 않고, 군락의 크기가 크며 주변에 점액성 물질이 많은 비용혈성 군락을 채취하였다.
(계대배양)
미생물 성장 및 활성화를 위하여 Tryptic soy broth 30g을 3차 증류수 1L에 용해시킨 후, 121℃에서 15분간 고압 증기 멸균하여 제조하였다. 1차, 2차, 3차 배양을 위하여 200mL의 멸균병 3개를 준비하고, 각각의 멸균병에 150mL의 배지를 넣고 121℃에서 15분간 멸균하였다. 1차 배양액에는 상기 종배양에서 채취한 군락을 접종하고, 37℃의 진탕배양기에서 대수성장기까지 배양하였다. 1차 배양의 대수성장기가 되었을 때, 2차 배양액에 1차 배양액 3%를 접종하고 대수성장기까지 배양한 후, 2차 배양의 대수성장기 이후 3차 배양액에 2차 배양액의 3%를 접종하여 3차 배양의 대수성장기까지 배양하여 계대배양하였다. 계대배양 시 각 차수의 균체의 대수성장기는 UV-vis spectrometer를 이용하여 균체의 성장곡선을 측정하여 확인하였다(도 2 참조).
(본배양)
덱스트로즈(dextrose) 30(g/L), 효모추출물(yeast extract) 5(g/L), 카제인 다이제스트(casein digest) 17(g/L), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 0.5(g/L), 인산칼륨(potassium phosphate) 2.5(g/L), 염화나트륨(sodium chloride) 5(g/L), L-글루탐산(L-glutamic acid) 0.4(g/L), L-글루타민(L-glutamine) 1(g/L), 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid, 분자량 50~500kDa) 0.1(g/L)을 121℃에서 15분간 멸균한 후, jar fermentor(㈜퍼멘텍)를 사용하여 working volume 1L로 배양하였다, 배양온도는 37℃, 배양액의 pH는 7.0, 교반속도는 배양초기에 300rpm에서 배양이 진행되며 배양액의 점도가 증가하기 시작하는 시기인 접종 후 10시간 이후부터 600rpm까지 상승시켰고, 통기량은 1vvm을 유지시켰다. 이때, pH는 10N의 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH 7.0으로 자동조절하였다. 사전에 실험결과를 통해 배양액의 점도가 최고점도가 되는 시기인 14시간을 전후로 하여 배양액의 발효를 종료하고 배양액을 정제하였다.
본배양이 시작된 시점부터 배지의 점성을 측정하여 점도가 지수적으로 증가하는 추세를 관찰하여 균체에 의한 히알루론산의 생산이 본격적으로 이루어지는 시점을 파악하여 해당시점부터 배지의 효율적인 혼합을 위해 교반속도를 높여주었으며, 점도가 감소하는 시점을 기준으로 배양을 종료하고 배양액의 정제 시작 시기를 판단하였다(도 3 참조).
실시예 1-2. 저분자량 히알루론산 나트륨(LHA1) 제조
상기 배양이 완료된 배양액에 2M 염화나트륨(NaCl) 수용액을 1:1의 부피비로 첨가하여 배양액의 농도를 절반으로 희석시켜 균체와 히알루론산을 분리하였다. 그 다음, 상기 희석된 배양액의 pH가 11~13이 되도록 10N 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 첨가하여 점도를 감소시켰다.
상기 수산화나트륨 수용액이 첨가된 배양액은 고속 원심분리장치를 이용하여 분당회전속도 8,000~15,000rpm으로 30~60분 동안 고속으로 원심분리하여 미생물 배양액 내에 존재하는 균체 및 부유 불순물들을 제거하였다.
그 다음, 고속 원심분리를 통해 균체 및 부유 불순물들이 제거된 배양액은 제균필터(pore size 0.22㎛)를 사용하여 감압여과하고, 이어 MWCO(molecular weight cut off) 12,000 내지 14,000Da인 투석막(Dialysis membrane)을 사용하여 24 내지 40시간 동안 투석하여 배양액 내에 잔류하는 배지성분과 수산화나트륨을 제거하여 정제된 히알루론산 수용액을 수득하였다.
상기 얻어진 히알루론산 수용액에 유기용매로 에탄올을 사용하여 히알루론산을 침전시킨 후, 진공건조하여 분말형태의 히알루론산 나트륨을 수득하였다.
실시예 2. 저분자량 히알루론산 나트륨(LHA2) 제조
상기 실시예 1-1의 본배양 배지의 조성에서 덱스트로즈(destrose)를 20(g/L)의 농도로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 3. 저분자량 히알루론산 나트륨(LHA3) 제조
상기 실시예 1-1의 본배양 배지의 조성에서 폴리감마글루탐산을 첨가하지 않고, 덱스트로즈(destrose)를 60(g/L), 글루타민을 0.6(g/L) 및 글루탐산을 0.4(g/L)의 농도로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 4. 저분자량 히알루론산 나트륨(LHA4) 제조
상기 실시예 1-1의 본배양 배지의 조성에서 글루탐산을 1(g/L)의 농도로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실험예 1. 히알루론산 나트륨의 점성분자량 측정
상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨의 점성분자량을 측정하기 위하여, 표준물질로 시판되고 있는 4종의 히알루론산 나트륨의 점도를 측정하여 cP, Torque 수치를 통해 표준곡선을 작성하고, 상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨의 점도를 측정하여 분자량을 측정하였다.
하기 표 1에는 표준물질인 시판되는 4종의 히알루론산 나트륨(품명: X, (주)태평양 제조 제품 4종)의 분자량과 점도를 나타내었으며, 도 4에는 시판 히알루론산 나트륨들로부터 작성된 표준곡선을 통하여 실시예 1 내지 4의 저분자량 히알루론산 나트륨의 분자량과 점도를 측정한 분자량 도표를 나타내었다. 또한, 상기 실시예 1 내지 4의 저분자량 히알루론산 나트륨의 예상 점성분자량을 하기 표 2에 나타내었다.
구분 분자량(Da) cP Torque(%) 온도(℃)
표준물질1 8K 11.2 2.8 26
표준물질2 4,20K 82 20.5 25.9
표준물질3 8,00K 167.2 41.8 25.9
표준물질4 1,100K 261.6 65.5 26
구분 예상 점성분자량(Da)
실시예 1(LHA1) 390K
실시예 2(LHA2) 490K
실시예 3(LHA3) 480K
실시예 4(LHA4) 450K
상기 표 1, 2 및 도 4를 통하여, 본 발명에 따라 제조한 실시예 1 내지 4의 저분자량 히알루론산 나트륨은 예상되는 점성분자량이 390~490K 정도로 저분자량임을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 히알루론산 나트륨의 단백질 함량 측정
상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨의 단백질 함량을 측정하기 위하여, Bradford protein assay법을 통해 단백질 함량을 확인하고, 히알루론산 나트륨에 함유된 단백질의 양을 계산하였다. 이때, 흡광도는 UV-visible spectrometer를 이용하여 확인하였다. 이때 대조군으로는 시판되고 있는 히알루론산 나트륨을 사용하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
구분 평균 흡광도(㎚) 단백질 함량(㎍/mL)
표준물질1 4.6 2.37
표준물질2 4.5 1.95
표준물질3 4.3 1.10
표준물질4 5.9 7.8
실시예 1(LHA1) 4.7 2.79
실시예 2(LHA2) 4.3 1.10
실시예 3(LHA3) 5 4.07
실시예 4(LHA4) 5.9 7.8
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 시판되고 있는 히알루론산 나트륨과 본 발명에 따라 제조한 실시예 1 내지 4의 저분자량 히알루론산 나트륨에 함유된 단백질 함량은 유사한 정도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 히알루론산 나트륨의 핵산 함량 측정
상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨을 염화나트륨(NaCl) 수용액으로 용해시킨 후, 260㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도(absorbance260=A260)에 다음과 같이 적당한 수를 곱하여 핵산의 농도(ㅅg/ㅅl)를 계산하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 시판되고 있는 히알루론산 나트륨을 사용하였다.
단일가닥 DNA = A260 × 50
이중가닥DNA = A260 × 33
RNA = = A260 × 40
구분 핵산 함량(㎍/mL)
표준물질1 3.4
표준물질2 4.5
표준물질3 3
표준물질4 2
실시예 1(LHA1) 4
실시예 2(LHA2) 1
실시예 3(LHA3) 4.5
실시예 4(LHA4) 5
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 시판되고 있는 히알루론산 나트륨과 본 발명에 따라 제조한 실시예 1 내지 4의 저분자량 히알루론산 나트륨에 함유된 핵산 함량은 유사한 정도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 히알루론산 나트륨의 구조분석
상기 실시예 1에서 제조한 저분자량 히알루론산 나트륨의 구조분석을 위하여, 1H-NMR과 FT-IR을 이용하여 화학적인 구조를 분석하였다. 이때, 본 발명에 따라 제조한 실시예 1의 저분자량 히알루론산 나트륨과 시판되고 있는 히알루론산 나트륨(품명: X, (주)태평양 제조)의 화학적인 구조를 비교하였다.
1H-NMR은 D2O용액에 히알루론산 나트륨을 용해시킨 후, 한 시간 정도 안정화시켜 측정하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. FT-IR은 KBr을 사용해 펠릿을 제조하여 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었으며, 히알루론산 나트륨의 IR band(적외선 스펙트럼 흡수띠)는 하기 표 5에 나타내었다.
IR bands Wavenumber(㎝-1)
1 C-O-C, C-O, and C-O-H stretching 1018
2 C-O-C, C-O, and C-O-H stretching 1078
3 C-O-C, C-O, and C-O-H stretching 1148
4 NH deformation 1455
5 Amid Ⅱ 1602
6 C=O carboxyl amid Ⅰ 1654
7 CH stretching 2878
8 NH with C=O combination 3104
0 NH stretching and OH stretching 3284
도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조한 실시예 1의 저분자량 히알루론산 나트륨은 시판되고 있는 히알루론산 나트륨과 1H-NMR 및 FT-IR 분석결과 대부분의 피크가 같음을 확인할 수 있었다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (14)

  1. S1) 미생물 발효를 통해 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액을 제조하는 단계;
    S2) 상기 히알루론산을 포함하는 미생물 배양액에 염화나트륨 수용액 및 수산화나트륨 수용액을 첨가하는 단계;
    S3) 상기 수산화나트륨 수용액이 첨가된 미생물 배양액으로부터 균체 및 부유 불순물을 제거하는 단계;
    S4) 상기 균체가 제거된 미생물 배양액을 여과 및 투석하여 정제된 히알루론산 수용액을 얻는 단계; 및
    S5) 상기 정제된 히알루론산 수용액에 유기용매를 첨가하여 히알루론산을 침전시키고 건조하여 분말형태의 히알루론산 나트륨을 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 S1)단계의 미생물은 스트렙토코커스 이퀴, 스트렙토코커스 주에피데미커스 및 스트렙토코커스 파이오젠 중 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 S1)단계의 미생물은 히알루론산 생산균인 스트렙토코커스 주에피데미커스(streptococcus equi subsp. zooepidemicus, ATCC 39920)인 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 S1)단계의 미생물 발효는 종배양 단계, 계대배양 단계 및 본배양 단계를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 S2)단계의 염화나트륨 수용액은 미생물 배양액에 1:0.5 내지 1:2부피비로 첨가되는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 S2)단계의 수산화나트륨 수용액은 배양액의 pH가 12 내지 14가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 S3)단계의 고속원심분리는 8,000 내지 15,000rpm에서 30~60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 S4)단계의 여과는 제균필터를 사용하여 수행되며, 투석은 MWCO(molecular weight cut off) 12,000 내지 14,000Da인 투석막을 사용하여 24 내지 40시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 S5)단계의 유기용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이소프로필알코올 중 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 저분자량 히알루론산 나트륨은 분자량이 300 내지 500kDa인 것을 특징으로 하는 저분자량 히알루론산 나트륨의 제조방법.
  11. 제1항의 방법으로 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료용 조성물.
  12. 제1항의 방법으로 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약용 조성물.
  13. 제1항의 방법으로 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
  14. 제1항의 방법으로 제조된 저분자량 히알루론산 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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