CN109718255B

CN109718255B - 一种消除宿醉酶粉末的制备方法和含有该成分的消除宿醉用组合物

Info

Publication number: CN109718255B
Application number: CN201811184404.5A
Authority: CN
Inventors: 慎镛喆; 朴哲; 金利洙; 金爱香; 沈在民
Original assignee: Amicogen Inc
Current assignee: Amicogen Inc
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2023-02-10
Anticipated expiration: 2038-10-11
Also published as: KR101925096B1; CN109718255A

Abstract

本发明涉及一种消除宿醉酶粉末的制备方法和含有该成分的消除宿醉用组合物，更具体地，涉及一种消除宿醉酶粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：a)在含有酵母提取物粉末的固体培养基中培养巴氏醋杆菌VA2(Acetobacter pasteurianus VA2)菌株后，在混合酵母提取物粉末和发酵酒精的液体培养基中接种菌株并进行发酵的步骤；b)离心所述步骤a)中发酵的培养液并除去上清液以获得醋酸菌体的步骤；c)破碎所述步骤b)中获得的醋酸菌体，然后混合赋形剂的步骤；和d)将所述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤，以及含有消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉预防及消除用药物组合物及食品组合物。本发明的方法，使用具有优异醋酸生产能力的醋酸菌制备具有乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)酶活性的组合物，可以有效地使用于消除宿醉并防止由饮酒引起的肝损伤。

Description

一种消除宿醉酶粉末的制备方法和含有该成分的消除宿醉用组合物

技术领域

本发明涉及一种消除宿醉酶粉末的制备方法和含有该成分的消除宿醉用组合物{A manufacturing method of hangover-eliminating enzyme powder and acomposition for relieving hangover comprising thereof}，更具体地，涉及一种消除宿醉酶粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：a)在含有酵母提取物粉末的固体培养基中培养巴氏醋杆菌VA2(Acetobacter pasteurianus VA2)菌株后，在混合酵母提取物粉末和发酵酒精的液体培养基中接种菌株并进行发酵的步骤；b)离心所述步骤a)中发酵的培养液并除去上清液以获得醋酸菌体的步骤；c)破碎所述步骤b)中获得的醋酸菌体，然后混合赋形剂的步骤；和d)将所述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤，以及含有消除宿醉酶粉作为活性成分的宿醉预防及消除用药物组合物及食品组合物。

背景技术

酒精主要在消化道中被吸收，其中30％在胃中被吸收，60％在小肠中被吸收。被吸收的酒精在肝脏中代谢，其余10％通过呼吸、尿液和汗液排出体外。一般来说，人体吸收的酒精被ADH(乙醇脱氢酶，alcohol dehydrogenase)氧化成乙醛(acetaldehyde)。然后乙醛被ALDH(乙醛脱氢酶，acetaldehyde dehydrogenase)氧化成醋酸，醋酸在体内被用作能量来源。(Shumate RP et al,J Forensic Med 14:83-100,1967；Lieber CS.,Clin LiverDis 9:1-35,2005；Gill,K.et al.,Alcohol 13(4):347-355,1996).

另外，在乙醇分解过程中，在乙醛通过ALDH氧化成醋酸过程中形成活性氧ROS(活性氧簇，Reactive oxygen specsis)，这会是引起头痛、恶心和腹痛等宿醉症状的原因。(Gemma S.et al.,Ann Ist Super Sanita 42:8-16,2006)。

另外，醋酸杆菌(Acetobacter)属菌株拥有酒精耐性高、醋酸耐性强的特点，是产业上最重要的食醋生产菌。为了通过醋酸菌生产醋酸，ADH通过与辅酶NAD+的氧化反应分解成乙醛，乙醛被ALDH分解最终生成醋酸(Kall,L.el al.,J.Mol.Biol.338,1027-1036.2004)。目前，巴氏醋杆(Acetobacter pasteurianus)菌在韩国食品和药物管理局被允许用作食醋中的GRAS(通常被认为是安全的，generally recognized as safe)(Eun-Jung Yim et al.,Korean Journal of Food Preservation,22(1),108-118,2015)。

近日，可以起到持续服用后带来肝功能增强效果及饮酒前后服用可以消除宿醉并保护肝脏的消除宿醉用饮料已被商业化，这种消除宿醉用饮料，可以使人在饮酒后第二天也无宿醉现象并进行相同的日常活动，因此无论男女老少其需求日益增加。

然而，传统的消除宿醉饮料，其焦点放在了抑制或促进肝脏内的酶即ADH活性的生物活性成分上，主要将中药草提取物制备为饮料，其效果甚微或者暂时缓解症状，无法从根本上消除宿醉或对酒精进行解毒，对饮酒后出现的腹痛、头痛、恶心等头部及肠胃系统问题没有效果或效果不够充分。

因此，需要发明出可以快速达到消除宿醉效果，并且可以预防肝损伤，对人体无副作用的消除宿醉产品。

发明内容

【技术课题】

因此，本发明人一直在研究能够快速达到消除宿醉的效果，并且可以预防肝损伤，对人体无副作用的消除宿醉剂，证实醋酸菌衍生的乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)在体内具有快速将乙醇和乙醛分解成乙酸的效果，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种消除宿醉酶粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)在含有酵母提取物粉末的固体培养基中培养巴氏醋杆菌VA2(Acetobacterpasteurianus VA2)菌株后，在混合酵母提取物粉末和发酵酒精的液体培养基中接种菌株并进行发酵的步骤；

b)离心所述步骤a)中发酵的培养液并除去上清液以获得醋酸菌体的步骤；

c)破碎所述步骤b)中获得的醋酸菌体，然后混合赋形剂的步骤；和

d)将所述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉预防及消除用药物组合物。

本发明的又一个目的是提供一种含有所述宿醉消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉预防及消除用食品组合物。

【技术解决方法】

为了达到所述目的，本发明提供一种消除宿醉酶粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：

c)破碎所述述步骤b)中获得的醋酸菌体，然后混合赋形剂的步骤；和

d)将所述述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤。

为了达到本发明的另一个目的，提供一种含有所述消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉预防及消除用药物组合物。

为了达到本发明的又一个目的，提供一种含有所述消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉预防及消除用食品组合物。

下面将对本发明进行详细说明。

本发明提供一种消除宿醉酶粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：

d)将所述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤。

下面对各个步骤进行详细说明。

本发明中的步骤a)是在含有酵母提取物粉末的固体培养基中培养巴氏醋杆菌VA2(Acetobacter pasteurianus VA2)菌株后，在混合酵母提取物粉末和发酵酒精的液体培养基中接种菌株并进行发酵的步骤。

本发明的所述“巴氏醋杆菌VA2(Acetobacter pasteurianus VA2)”的特征在于以保藏号(KCTC13506BP)保藏。

在本发明中，所述“巴氏醋杆菌”菌株是醋酸杆菌(Acetobacter)属的醋酸菌。醋酸杆菌属菌是一种革兰氏阴性需氧菌，也被称为“醋酸菌(acetic acid bacteria)”。它利用氧气将乙醇转化为乙酸而使乙酸发酵，并且由于其高耐酒精性和强耐醋酸性，它是工业中最重要的食醋生产菌。生长的最佳温度为20至30℃，当温度低于10℃或高于45℃时，增殖能力非常弱。另外，如果酒精浓度不在5～10％的范围内，则细菌不会生长，如果生成的乙酸浓度为10％以上，则会全部死亡。巴氏醋杆菌在韩国食品和药物管理局被允许用作食醋中的GRAS(通常被认为是安全的，generally recognized as safe)(Eun-Jung Yim et al.,Korean Journal of Food Preservation,22(1),108-118,2015)。

本发明的制备方法特征在于，在所述步骤a)中，培养基包含0.5～1重量％的酵母提取物粉末。

在本发明的制备例中，菌株在由酵母提取物粉末、甘露醇和蛋白胨组成的固体培养基中培养16至24小时，然后将含有酵母提取物粉末、大豆胨(soytone)、葡萄糖、MnSO4的液体培养基与发酵酒精混合，将菌株接种并培养。

本发明的制备方法特征在于，在所述步骤a)中，混合1～5重量％发酵酒精。

本发明中的“发酵酒精”是用大米、大麦、甘薯、木薯、甘蔗和甜菜等谷物作为原料，通过微生物或酶发酵后，通过连续式蒸馏方法蒸馏的酒精度95％的酒精。它主要用作酒的主要成分，另外广泛用于所有可用酒精的领域，如食品、药品、饮料、化妆品和其他工业用途，可优选使用市售的乙醇(ethanol)。

本发明中的“发酵(fermentation)”是指微生物利用其自身的酶分解有机物质的过程，优选“醋酸发酵(acetic acid fermentation)”。所述醋酸发酵也称为乙酸发酵，是乙酸菌(醋酸菌)通过氧化酒精生成乙醛后再生成醋酸的过程。用于发酵的最佳温度可以是20至30℃，这是乙酸细菌生长的最佳温度，在本范明中优选在25至30℃的温度下发酵24至36小时。

本发明中的所述步骤b)是离心所述步骤a)中发酵的培养液并除去上清液以获得醋酸菌体的步骤。

本发明中的“发酵培养液”是指用醋酸菌醋酸发酵的培养液，发酵后的醋酸浓度应小于10重量％。培养液的pH值优选为3.5～4.0，醋酸浓度为2.0～4.0重量％。

在本发明的制备例中，将发酵培养液以10,000×g离心20分钟，然后除去上清液，沉淀物用生理盐水洗涤2至3次以获得醋酸菌体。

本发明的所述步骤c)是粉碎所述步骤b)中获得的醋酸菌体，然后混合赋形剂的步骤。

本发明中的所述“赋形剂”可选自淀粉、葡萄糖、纤维素、乳糖、糖原、D-甘露醇、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖糊精、碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸一氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、精纯羊毛脂、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素、胶体硅胶、羟丙基淀粉、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、酪蛋白、乳酸钙、底胶、阿拉伯树胶等，并且优选淀粉、葡萄糖、纤维素、乳糖、糊精、糖原、D-甘露醇、麦芽糖糊精，最优选麦芽糖糊精。

在本发明的制备例中，使用细胞破碎机通过高压破碎法破碎所获得的醋酸菌体，然后将麦芽糖糊精以醋酸菌体重量的50至60重量％的浓度添加至破碎的醋酸菌体溶液中混合搅拌。

本发明中的“麦芽糖糊精”是一种通过将淀粉分解成稀酸或淀粉酶而形成的糊精(dextrin)，具有比消色糊精更小的聚合度，是形成麦芽糖之前的低分子糊精。麦芽糖糊精是一种广泛用于食品中的功能性糖类，具有防止蛋白质变性效果、食物掩蔽(masking)效果和赋予食物柔软口感的效果。麦芽糖糊精包括麦芽二糖(G2,maltose)、麦芽三糖(G3,maltotriose)、麦芽四糖(G4,maltotetraose)、麦芽五糖(G5,maltopentaose)、麦芽六糖(G6,maltohexaose)、麦芽七糖(G7,maltoheptaose)、麦芽八糖(G8,maltooctaose)、麦芽九糖(G9,maltononaose)等。

本发明的所述步骤d)是将所述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤。

在本发明的制备例中，将与糊精混合的醋酸菌溶液用冷冻干燥机干燥2～4天后，将干燥物破碎、粉体化、制成粉末。

本发明中的“消除宿醉粉末”的特征在于含有乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)。

所述“乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)”是通过从酒精中除去氢的催化反应而生成醛或酮的酶。它存在于人体内以及许多其他动物、酵母、高等植物和细菌中，帮助引起有毒的酒精的化学变化。

所述“乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)”是通过氧化由乙醇产生的乙醛而产生羧酸或酰基的酶，存在于微生物、绿色植物、动物等中。肝酶主要在乙醛中产生乙酸。在体内分解乙醛的过程中，形成活性氧ROS(活性氧簇，Reactive oxygen specsis)，引起头痛、恶心和腹痛等宿醉症状。

本发明提供一种含有所述消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉预防及消除用药物组合物及食品组合物。

在本发明的药物组合物和食品组合物中，消除宿醉酶粉末和谷物发酵酶粉末可以以1:0.5至5的重量比混合，优选以1:0.5至3的重量比比混合，最优选以1：1的重量比混合使用。

根据本发明的药物组合物可以单独含有消除宿醉酶粉末或与药学上可接受的载体一起配制成合适的剂型，并且可以进一步含有赋形剂或稀释剂。如本文所用，“药学上可接受的”是指生理学上可接受的无毒组合物，当施用于人体时通常不会引起胃肠道紊乱、头晕等过敏反应或类似反应。

药学上可接受的载体还可以包括例如用于口服给药的载体或用于非口服给药的载体。口服给药载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。另外，它可以含有用于肽制剂口服给药的各种药物递送物质。另外，非口服给药用载体可以含有水、合适的油、盐溶液、葡萄糖水溶液和乙二醇，还可以含有稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂有抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。除了上述组分之外，本发明的药物组合物还可以含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂等。其他药学上可接受的载体和制剂可以参考以下文献中列出的内容(Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,MackPublishing Company,Easton,PA,1995)。

本发明的组合物可以通过任何方法施用于包括人在内的哺乳动物。例如，它可以口服或非口服给药。非口服给药方法包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠内给药。

根据如上所述的给药途径，本发明的药物组合物可以配制成口服或非口服剂型。

作为口服给药制剂，本发明的组合物可以通过本行业领域已知的方法制成粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等剂型。例如，口服制剂可通过将活性成分与固体赋形剂混合，然后粉碎，加入合适的助剂，然后将混合物加工成粒状混合物来获得片剂或糖衣片剂。合适的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇和麦芽糖醇的糖类和包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉的淀粉类；包括纤维素、甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素等纤维素；包括明胶、聚乙烯吡咯烷酮等填充剂。另外，可以添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠等作为崩解剂。此外，本发明的药物组合物可进一步包含抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和防腐剂。

通过本行业领域已知的方法，可以以注射剂、乳膏剂、乳液、软膏剂、油剂、保湿剂、凝胶剂、气雾剂和鼻吸入剂的形式配制非口服给药制剂。这些剂型在制药化学领域中通常已知的处方书文献(雷明顿药物科学，Remington's Pharmaceutical Science,19th ed.,Mack出版公司，Easton，宾夕法尼亚,1995)中已有记载。

本发明的组合物的总有效量可以以单次剂量(single dose)或以多次剂量(multiple dose)长期施用的分次治疗方案(fractionated treatment protocol)施用给患者。本发明的药物组合物可根据疾病的严重程度，调整活性成分的含量。优选地，本发明的药物组合物的优选总用量为每天每1公斤患者体重约0.01μg至10,000mg，最优选0.1μg至500mg。然而，所述药物组合物的用量不仅要考虑制剂化方法、施用途径和治疗次数，还要根据患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病的严重程度、饮食和排泄率等多种因素确定对患者的有效剂量，在本领域具有一般知识的技术人员能够确定本发明的组合物的合适的有效剂量。根据本发明的药物组合物，对其制剂、给药途径、给药方法没有特别的限制，只要能够达到本发明的效果即可。

使用本发明的消除宿醉酶粉末的食品用组合物包括功能性食品(functionalfood)、营养补充剂(nutritional supplement)、保健食品(health food)和食品添加剂(food additives)等所有形式。可根据本领域已知的常规方法以各种形式制备这些类型。

例如，作为健康食品，本发明的食品用组合物本身可以以茶、果汁和饮料的形式制备用于饮用，或被颗粒化、胶囊化、粉末化后用于摄取。此外，本发明的食品用组合物可以通过与已知的具有消除宿醉效果的物质或活性成分混合以组合物的形式制备。

另外，作为功能性食品，可在制备饮料(酒精饮料包括在内)、水果及其加工食品(如水果罐头、瓶装水果、果酱、柠檬或橙子酿出的果酱)、鱼类和肉类及其加工食品(如火腿、香肠等)、面包以及面食类(如乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖、乳制品(如黄油、芝士等)、食用植物油、人造黄油、植物性蛋白质、蒸煮袋食品、冷冻食品、各种调味料(如豆瓣酱、酱油、酱汁等)等时添加本发明的食品组合物。

根据本发明的食品组合物的含量优选但不限于最终制备的食品总重量的0.01至50％重量比。为了将本发明的食品组合物用于食品添加剂，也可以将其制备成粉末或浓缩液形式。

在本发明的一个实施例中，比较了本发明中使用的巴氏醋杆菌VA2(Acetobacterpasteurianus VA2)与来自ATCC(美国模式培养物保藏中心，American Type CultureCollection)和KCTC(韩国模式培养物保藏中心，Korean Collection for Type Cultures)的另一种巴氏醋杆菌菌株和四种乳酸菌(短乳杆菌/Lb.brevis、罗伊氏乳杆菌/Lb.reuteri、发酵乳杆菌/Lb.fermentum和植物乳杆菌/Lb.plantarum)的乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的酶活性，证实了本发明中使用的巴氏醋杆菌VA2的酶活性较高(见实施例2，表1和表2)。

在本发明的另一个实施例中，将本发明的不同浓度的消除宿醉酶粉末用酒精进行3小时反应，测量各组的酒精含量的变化和乙醛含量的变化，结果可以确认，与对照组相比，用消除宿醉酶粉末进行处理时酒精浓度和乙醛含量进一步降低(见实施例3、图2和图3)。

在本发明的另一个实施例中，给大鼠分别施用酶粉末、复合物、黎明，30分钟后施用酒精，采集血液测量血中酒精浓度及乙醛消除宿醉浓度，结果可以确认，酒精处理组在30分钟后酒精浓度急剧上升，与对照组相比，施用消除宿醉酶粉末时血中酒精浓度及乙醛浓度更低，证实了消除宿醉酶粉末具有快速分解体内酒精的作用(见实施例4、图4和图5)。

在本发明的另一个实施例中，给大鼠分别施用消除宿醉酶粉末、复合物、黎明，30分钟后施用酒精，采集血液测量肝毒性指标AST(天冬氨酸转氨酶，aspartateaminotransferase)、ALT(丙氨酸转移酶，alanine transferase)，结果可以确认，对照组的AST和ALT血中浓度增加，而消除宿醉酶粉末处理组的AST和ALT血中浓度降低(见

实施例5、图6)。

在本发明的另一个实施例中，给大鼠分别施用消除宿醉酶粉末、复合物、黎明，30分钟后施用酒精，摘除肝组织，用H&E染色法观察肝组织，结果可以确认，与正常组相比，对照组的肝损伤严重，而用消除宿醉酶粉末进行处理时肝损伤较小，用高浓度消除宿醉酶粉末进行处理时肝的状态与正常组基本相似(见实施例6、图7)。

【发明的效果】

因此，本发明提供一种消除宿醉酶粉末的制备方法和含有该成分的消除宿醉用组合物。本发明的方消除宿醉法，使用具有优异醋酸生产能力的醋酸菌制备具有乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)酶活性的组合物，可以有效地使用于消除宿醉并防止由饮酒引起的肝损伤。

附图说明

图1是消除宿醉粉末制备方法的示意图；

图2是在5％酒精中施用不同浓度的宿醉消除酶粉末时，显示随着时间变化的酒精浓度和酒精浓度降低率的图；

图3是在5％酒精中施用不同浓度的消除宿醉酶粉末时，显示随着时间变化的乙醛浓度的图；

图4显示在动物模型中施用消除宿醉酶粉末时，显示随着时间变化的血中酒精浓度(图4a)及血中酒精浓度-时间曲线下面积(AUC)(图4b)；

图5显示在动物模型中施用消除宿醉酶粉末时，随着时间变化的血中乙醛浓度(图5a)及血中乙醛浓度-时间曲线下面积(AUC)(图5b)；

图6显示在动物模型中施用消除宿醉酶粉末时，肝毒性指数即AST(天冬氨酸转氨酶，aspartate aminotransferase)的血中浓度(图6a)和ALT(丙氨酸转移酶，alaninetransferase)的血中浓度(图6b)；

图7显示了在动物模型中施用消除宿醉酶粉末时，肝组织的观察结果；

所述图中，相对于正常组的对照组统计学显著性是^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，相对于对照组的实验组(L-CA，H-CA，CA+GF)及阳性对照组(YM)的统计学显著性是^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001，相对于阳性对照组(YM)的实验组(L-CA，H-CA，CA+GF)的统计学显著性是^$p<0.05。

具体实施方式

下面将对本发明进行详细说明。

但下面说明的实施例，是为了帮助理解本发明的示例性说明，本发明的内容不应局限于此。

<制备例1>消除宿醉酶粉末

经醋酸发酵醋酸菌株(巴氏醋杆菌VA2，Acetobacter pasteurianus VA2)以表达ADH和ALDH，并制备包含所述ADH和ALDH的酶复合物。具体方法如下。

将醋酸菌在酵母提取物粉末为0.5％、D-甘露醇为2.5％和蛋白胨为0.3％的预培养基中培养16至24小时。混合酵母提取物粉0.5％至1％、大豆胨0.5％至1.5％、含水结晶葡萄糖2.5％至7.5％、硫酸锰0.01％至0.05％，并在该培养基中混合发酵酒精1％至5％，接种预培养的菌株，将其在25至30℃以200至300rpm培养24至36小时。培养后，pH优选为3.5～4.0，醋酸浓度优选为2.0～4.0重量％。然后通过离心(10,000×g，20分钟)除去上清液，用0.85％生理盐水洗涤沉淀物2至3次。将沉淀物以20至50重量％的浓度悬浮于磷酸钾缓冲溶液(pH7.0-8.0)中，并用细胞破碎机破碎醋酸菌体。然后，将麦芽糖糊精(maltodextrin)赋形剂以醋酸菌体重量的50至60重量％的量加入到粉碎的醋酸菌溶液中并搅拌。在冷冻干燥机中干燥2至4天后，将干燥的材料粉碎并粉末化以制备宿醉消除酶粉末。这个过程如图1所示。

然后，所述宿醉消除酶粉末以103mg/kg的浓度(以下表示为L-CA)及以206mg/kg的浓度(以下表示为H-CA)施用给动物模型。

<制备例2>消除宿醉酶复合物

通过将谷物发酵酶粉末(申请号10-2017-0080405)添加至<制备例1>中获得的消除宿醉酶粉末来制备宿醉消除酶复合物。然后，给动物模型施用103mg/kg宿醉消除酶粉末和103mg/kg谷物发酵酶粉末(1:1重量比)，以下表示为CA+FG。

<比较制备例1>

作为对照组，将其他公司产品黎明808(DAWN 808)以12ml/kg的浓度施用，以下表示为YM。

<实施例1>

测定消除宿醉酶粉末的酶活性

<1-1>乙醇脱氢酶的活性分析方法

首先，将200μl以上制备的样品置于E-管中，并通过在100℃加热30分钟或更长时间来去除酶活性。将1.3mL的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.8，sodium phosphate buffer)和1.5mL的15mMβ-NAD溶液与0.1mL的95％(v/v)乙醇混合以制备底物反应溶液，使得总溶液为2.9mL。

将6.67μl样品和193.3μl所述制备的反应溶液混合并分配到96孔微板(空白＝在100℃下加热30分钟的酶溶液)中。之后，使用多重读数器(Multiple reader)在340nm和25℃下测量0-10分钟的吸光度后，并使用以下<公式1>分析乙醇脱氢酶的活性。

<1-2>乙醛脱氢酶的活性分析方法

首先，将200μl以上制备的样品置于E-管中，并通过在100℃加热30分钟或更长时间来去除酶活性。将2.32mL的三次蒸馏水、300μl的1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、100μl的20mMβ-NAD溶液、100μl的3M KCl、50μl的100mM乙醛溶液、和30μl的1M巯基乙醇溶液(3-mercaptoethanol solution)混合以制备反应溶液，使得总溶液为2.9mL。然后，将6.67μl样品和193.3μl反应溶液混合并分配在96孔微板(空白＝在100℃下加热30分钟的酶溶液)中。之后，使用多重读数器(Multiple reader)在340nm和25℃下测量0-10分钟的吸光度，并使用下面的<公式1>分析乙醛脱氢酶的活性。

<公式1>

※1个单位是可以1分钟将1.0umol的乙醇分解为乙醛或1分钟将1.0umol的乙醛分解成乙酸的酶活性(pH 8.8，25℃)

<实施例2>

比较分析醋酸菌株的酶活性

<2-1>比较分析不同种类醋酸菌株的酶活性

为了比较用于制备本发明的消除宿醉酶粉末的醋酸菌株(巴氏醋杆菌VA2，Acetobacter pasteurianus VA2)和其他巴氏醋杆菌(A.pasteurianus)的酶活性，进行下列实验。

巴氏醋杆菌(A.pasteurianus)从ATCC(美国模式培养物保藏中心，American TypeCulture Collection)和KCTC(生物资源中心，韩国模式培养物保藏中心，KoreanCollection for Type Cultures)获得，巴氏醋杆菌VA2(Acetobacter pasteurianus VA2)(KCTC 13506BP)从天然发酵柿子醋中获得。

在相同的培养条件下培养醋酸菌株(VA2)和巴氏醋杆菌(A.pasteurianus)，

然后进行高压破碎。根据实施例1中描述的方法测量酶活性，并比较乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的酶活性。

结果，如表1所示，用于制备本发明的消除宿醉酶粉末的醋酸菌(VA2)具有7.53单位/g的ADH活性和2.77单位/g的ALDH活性。结果证实其酶活性高于其他醋酸菌株。

[表1]

(*A.pasteurianus:巴氏醋杆菌；

OD:生长OD；

pH:生长pH；dry,unit/g:干燥，单位/g)

<2-2>比较分析醋酸菌株和乳酸菌的酶活性

为了比较本发明的消除宿醉酶粉末与已被报道具有乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的酶活性的四种乳酸菌(短乳杆菌/Lb.brevis、罗伊氏乳杆菌/Lb.reuteri、发酵乳杆菌/Lb.fermentum和植物乳杆菌/Lb.plantarum)的酶活性，进行以下实验。

四种乳酸菌(短乳杆菌/Lb.brevis、罗伊氏乳杆菌/Lb.reuteri、发酵乳杆菌/Lb.fermentum和植物乳杆菌/Lb.plantarum)从ATCC(美国模式培养物保藏中心，AmericanType Culture Collection)和KCTC(生物资源中心，韩国模式培养物保藏中心，KoreanCollection for Type Cultures)、KFRI(韩国食品研究院)、KACC(农业基因资源中心，韩国农业科学技术研究所)获得，各个菌株分别在其最佳培养基中添加1至3％乙醇进行培养。

然后将各个乳酸菌进行高压破碎，根据所述<实施例2-1>，所述<实施例1>中描述的方法测量酶活性，并比较乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的酶活性。

结果如表2所示，四种乳酸菌中，短乳杆菌(Lb.Brevis)的ADH活性最高，罗伊氏乳杆菌(Lb.Reuteri)的ALDH活性最高，但都比本发明的醋酸菌株(VA2)的ADH和ALDH活性低。

[表2]

(*Strain:菌株；

:生长度；Unit/g:单位/g；Lb.brevis：短乳杆菌；Lb.reuteri：

罗伊氏乳杆菌；Lb.fermentum：发酵乳杆菌；Lb.plantarum：植物乳杆菌)

<实施例3>

消除宿醉酶粉末的酒精分解作用

为了确认根据所述制备例中记载的方法制备的消除宿醉酶粉末的酒精分解效果，进行以下的实验。

将制备例1中制备的消除宿醉酶粉末与5％的酒精以1％(w/v)和3％(w/v)混合，对照组用蒸馏水以1％(v/v)混合。然后，在25℃，100rpm下进行3小时反应。混合物进行反应时以0、1和3小时的间隔取样，以测量混合物中所含的酒精。使用韩国食品和药物管理局的关于食品及添加物法典上的乙醇通用试验方法即通过酒精计的比重法测量酒精的含量。

使用酒精蒸馏装置将50mL的混合物在沸水中煮沸20分钟以蒸馏酒精。收集蒸馏酒精后，相对于50mL混合溶液稀释4倍(v/v)至最终体积为200mL，冷却至15℃，并通过悬浮酒精计测量酒精含量。

对于确认乙醛减少的方法，与所述酒精减少确认实验相同，将消除宿醉粉末与5％的酒精以1％(w/v)和3％(w/v)混合。然后，在25℃，100rpm下进行3小时反应。混合后以0、0.5、1、3、5、7、10、22小时的间隔取样，利用乙醛测定试剂盒(acetaldehyde assay kit，megazyme)测量混合物中所含的乙醛。

结果如图2和图3所示。

如图2所示，当与宿醉消除酶粉末混合时，与对照组相比，酒精浓度降低，而且酶粉末含量越高酒精浓度降低越多。

另外，如图3所示，对照组的乙醛含量几乎没有变化，混合宿醉消除酶粉末3％(w/v)比混合宿醉消除酶粉末1％(w/v)时乙醛含量下降得更快。

从这些结果可以确认宿醉消除酶粉末具有减少酒精的作用，并且酒精分解速度随浓度更加变得更快。

<实施例4>

消除宿醉酶粉末对血中酒精和乙醛的影响

为了确认消除宿醉酶粉末在体内对酒精分解的影响，进行以下实验。

首先，购买斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley，SD)大鼠并使其在22±2℃的温度，40-60％的湿度和12小时的明暗循环的条件下适应环境一周。此后，各取10只分别作为无任何处理的正常组、仅施用酒精的对照组、施用103mg/kg剂量消除宿醉酶粉末的L-CA组、施用206mg/kg剂量消除宿醉酶粉末的H-CA组、施用所述制备例2的消除宿醉酶粉末复合物的CA+FG组、施用浓度为12mg/kg的黎明的YM组。之后禁食12小时，然后分别给各组口服施用。

施用30分钟后，口服施用0.4g/ml(40％酒精)酒精，在施用0(施用前)、1、3、5、8小时后收集血液。将血液以3,000rpm离心15分钟以分离血清，然后分别用商业酒精浓度测量试剂盒(EnzyChrom^TM乙醇测量试剂盒，EnzyChrom^TM Ethanol Assay Kit(BioAssaySystem,USA))和乙醛测量试剂盒(EnzyChrom^TM乙醛测量试剂盒，EnzyChrom^TMAcetaldehyde Assay Kit(BioAssay System,USA))，通过ELISA测量565nm处的吸光度并测量血液浓度。然后，使用以下<公式2>计算血中浓度-时间曲线下面积(AUC)。

<公式2>

血中浓度-时间曲线下面积AUC＝(((0小时浓度+1小时浓度)*1)/2)+(((1小时浓度+3小时浓度)*2)/2)+(((3小时浓度+5小时浓度)*2)/2)+(((5小时浓度+8小时浓度)*3)/2)

其结果如图4所示，在除正常组以外的所有组中，施用酒精30分钟后血液酒精浓度迅速增加，而且可以确认L-CA组、H-CA组、CA+FG组和YM组的酒精含量均比对照组低。另外，H-CA组和CA+FG组，其血液酒精浓度低于YM组。

另外，如图5所示，在正常组以外的所有组中，施用酒精1小时后血液中的乙醛浓度迅速增加，并且L-CA组、H-CA组和CA+FG组和YM组的乙醛含量均比对照组低。

<实施例5>

消除宿醉酶粉末对血中AST和ALT浓度的影响

AST(天冬氨酸转氨酶，aspartate aminotransferase)和ALT(丙氨酸转移酶，alaninetransferase)被用作肝毒性的标志物，若肝脏受损其血中浓度值会明显升高，为了证实消除宿醉酶粉末对血中AST和ALT浓度的影响，进行以下实验。

以与所述<实施例4>中所述相同的方式进行动物实验，给大鼠施用消除宿醉酶粉末、复合物和黎明，并在30分钟后口服给予0.4g/ml的酒精(40％酒精)。施用0.5、1、3、5和8小时后，通过静脉收集血液。在每分钟3000rpm离心15分钟后，将血清分离，使用商业AST、ALT试剂盒(GOT、GPT测定试剂盒(Asan Pharmaceutical Co.,首尔，韩国))，通过ELISA在490nm处测量吸光度以测量血中浓度。

结果，如图6所示，对照组中的AST和ALT的血中浓度水平与正常组相比显著增加。另外，在L-CA组，H-CA组，CA+FG组和YM组中，AST和ALT血中浓度水平低于对照组。特别是H-CA组和CA+FG组的ALT含量明显低于YM组。

通过以上结果，证实了本发明的消除宿醉酶粉末和消除宿醉酶复合物具有优异的消除宿醉效果，并且可有效预防肝损伤。

<实施例6>

消除宿醉酶粉末对肝脏组织的影响

以与<实施例4>中所述相同的方式进行动物实验，给大鼠施用消除宿醉酶粉末、复合物和黎明，并在30分钟后口服给予0.4g/ml的酒精(40％酒精)。施用酒精1小时后，对大鼠进行剖腹并提取肝脏组织。然后，通过本领域常用的方法将组织石蜡包埋，然后切成3至4μm厚的切片。将组织切片用H&E(苏木精和伊红，hematoxylin and eosin)染色并在光学显微镜下观察。

结果，如图7所示，对照组(Control)的肝损伤比正常组(Normal)更严重。另一方面，L-CA组(低)、H-CA组(高)、CA+FG组(谷物)和YM组(黎明)的肝损伤较少。其中，H-CA组(高)和CA+FG组(谷物)，肝脏状况几乎与正常组相似。

由此可以证实，本发明的消除宿醉酶粉末和消除宿醉酶复合物具有抑制肝损伤的作用。

【产业利用可能性】

如以上所述，本发明的方法，使用具有很强的醋酸生产能力的醋酸菌制备具有乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)酶活性的组合物，可以有效地使用于消除宿醉并防止由饮酒引起的肝损伤。

【保藏号】

保管机构：韩国生命工学研究院

保藏号：KCTC13506BP

保藏日期：20180328

Claims

1.一种消除宿醉酶粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)在含有酵母提取物粉末的固体培养基中培养保藏号为KCTC13506BP的巴氏醋杆菌VA2菌株后，在混合酵母提取物粉末和发酵酒精的液体培养基中接种菌株并进行发酵的步骤；

d)将所述步骤c)的混合物进行干燥后粉末化的步骤。

2.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，所述消除宿醉酶粉末含有乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。

3.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，在所述步骤a)中，液体培养基包含0.5～1重量％的酵母提取物粉末。

4.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，在所述步骤a)中，混合1～5重量％的发酵酒精。

5.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，在所述步骤a)中，发酵酒精是乙醇。

6.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，所述步骤a)的发酵在25至30℃的温度下进行24至36小时。

7.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，所述步骤b)的培养液的pH值为3.5～4.0，醋酸浓度为2.0～4.0重量％。

8.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，在所述步骤c)中，赋形剂选自由淀粉、葡萄糖、纤维素、乳糖、糖原、D-甘露醇、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖糊精、碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸一氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、精纯羊毛脂、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素、胶体硅胶、羟丙基淀粉、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、酪蛋白、乳酸钙、底胶、阿拉伯树胶组合的群中至少一种。

9.根据权利请求第1项的所述制备方法，其特征为，在所述步骤c)中，混合赋形剂是以醋酸菌体重量的50至60重量％添加麦芽糖糊精。

10.一种含有权利请求第1项的消除宿醉酶粉末作为活性成分的宿醉消除用食品组合物。

11.根据权利请求第10项的所述食品组合物，其特征为，在所述组合物中，消除宿醉酶粉末和谷物发酵酶粉末以1:0.5至5重量比混合。