KR20170048229A

KR20170048229A - 효소 생산능이 우수한 전통 발효식품 유래 신규 균주 및 이를 이용하여 곡물 발효 효소식품을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20170048229A
Application number: KR1020160140464A
Authority: KR
Inventors: 박민주; 김아진; 한성욱; 허수진; 양태주; 박승원; 이상범; 장재호; 조성준; 홍영호; 박성희
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2017-05-08
Also published as: CN108347974B; TWI636739B; KR102134209B1; KR20190020718A; JP2018531036A; US20190098923A1; WO2017074037A1; KR101956986B1; CN108347974A; HK1254899A1; US11571012B2; JP6759337B2; TW201717778A

Abstract

본 출원은 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주, 상기 균주를 이용한 곡물 발효물의 제조방법, 상기 균주를 포함하는 곡물 발효물, 및 상기 균주 또는 곡물 발효물을 포함하는, 혈전 분해용; 소화 개선용; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료용; 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

Description

효소 생산능이 우수한 전통 발효식품 유래 신규 균주 및 이를 이용하여 곡물 발효 효소식품을 제조하는 방법{Novel strains derived from fermented food and having with excellent enzyme activity and method for producing grains-fermented food using the same}

효소란, 체내 대사활동에 작용하는 중요한 단백질로서 화학작용의 촉매 역할을 하는 물질을 말한다. 크게, 체내에서 만들어지지 않아 외부에서 섭취해야 하는 식품효소, 체내에서 스스로 만들어져 소화에 필요한 역할을 하는 소화효소, 소화를 제외한 다른 대사작용에 필요한 역할을 하는 대사효소로 구분할 수 있다. 이 중 식품효소는 소화흡수작용, 분해배출작용, 항염·항균작용, 해독살균작용, 혈액정화작용 및 세포부활작용 등의 생리작용을 할 수 있음이 보고되어 있다(신현재, 효소치료, p. 29-41, 2013).

효소식품은 이러한 효소의 기능을 강화시키기 위하여 식용 원료에 식용 미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 한 것, 식품에서 효소 함유부분을 추출한 것, 또는 이들을 가공한 것을 통칭한다. 이러한 효소식품은 식품 자체의 효소와 미생물의 발효 및 숙성과정을 통하여 각종 생리활성 물질과 영양소의 생성 작용 및 유익균 증식작용을 통해 소화·흡수를 돕는 각종 미량원소 및 생리 활성물질들이 증가되어 들어있다고 보고되어 있다(Huh, S.H. and Kim, M.H. The modern health and health food, 1997. Hongikjea press. Korea, p. 35-36).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 효소식품으로 이용할 수 있는 곡물 발효물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 전분 및 단백질 분해능력이 우수한 균주를 스크리닝하였으며, 이를 이용하여 곡물 발효물을 제조하고 이로부터 다양한 효과를 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

없음

Huh, S.H. and Kim, M.H. The modern health and health food, 1997. Hongikjea press. Korea, p. 35-36

본 출원의 하나의 목적은 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 (a) 곡물에, 본 출원의 균주를 접종하는 단계; 및 (b) 상기 균주를 배양하여 곡물 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 곡물 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 균주를 포함하는 곡물 발효물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물을 포함하는 혈전 분해용; 소화 개선용; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료용; 또는 항산화용 조성물, 및 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물을 포함하는 식품 조성물(예컨대, 효소 식품 조성물)을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 출원은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주(KCTC 12905BP)를 제공한다.

구체적으로, 본 출원의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주는 활성이 강력한 전분 및 단백 분해효소를 생산하여 고분자인 탄수화물 및 단백질을 가수분해하여 저분자화함으로써 미생물이 이용하기 용이한 당류로 분해시켜 미생물의 작용을 도울 뿐 아니라, 저분자화된 펩타이드를 제공함으로써 소화· 흡수율을 현저히 증가시킬 수 있다. 또한, 본 출원의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주는 곡물의 주요 구성성분인 탄수화물을 이용하여 활발하게 생육하면서 균체를 구성하는 단백질로 전환시키기 때문에, 효소식품 내 조단백 함량을 상대적으로 증가시킬 수 있다. BA245 균주를 이용한 발효에 의해 식이섬유 함량 또한 증가하게 되는데, 식이섬유는 배변을 원활하게 해주고, 장내 유익균의 중요한 영양소로서 유익균 수를 증가시켜 장내 건강한 환경을 조성하는데 도움을 줄 수 있다.

본 출원의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주는 전통 발효식품 유래 균주 중 전분 및 단백 분해효소 생성능이 가장 우수한 균주를 선별한 것이며, 누룩으로부터 분리된 균주이다.

선별된 BA245의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석 결과, BA245 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 가짐을 확인하고, 상기 서열을 근거로 공지 균주와의 서열 상동성 비교 및 계통분류학적 유연관계를 분석한 결과, BA245 균주는 바실러스 아밀로리퀴페시언스와 99.9%의 유사성을 나타내며(도 2), gyrase A 유전자 염기서열 비교에서도 바실러스 아밀로리퀴페시언스와 가장 유연관계가 높은 것으로 판명되었다(도 3 참조).

이에 본 출원의 BA245 균주를 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245로 명명하고 부다페스트 조약 하에 2015년 9월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC12905BP를 부여 받았다.

다른 하나의 양태로서, 본 출원은 다음의 단계를 포함하는 곡물 발효물의 제조방법을 제공한다: (a) 곡물에 수탁번호 KCTC12905BP인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 접종하는 단계; 및 (b) 상기 균주를 배양하여 곡물 발효물을 수득하는 단계.

본 출원의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 곡물에 균주를 접종하는 단계

출원의 단계 (a)에 사용될 수 있는 곡물은 밀, 밀배아, 밀기울, 백미, 현미, 발아현미, 보리, 귀리, 적미, 찰흑미, 찹쌀, 미강, 대두, 약콩, 검은콩, 퀴노아, 렌틸콩 및 율무로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 곡물을 포함할 수 있다. 상기 곡물은 분쇄된 형태, 분말 형태, 또는 분쇄 과정 없이 그대로 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 단계 (a)의 곡물은 밀배아 및 밀기울을 포함할 수 있다. 이 경우, 밀배아 및 밀기울은 곡물 100 중량부에 대해 40 중량부 내지 100 중량부, 50 중량부 내지 100 중량부, 50 중량부 내지 90 중량부, 50 중량부 내지 80 중량부또는 60 중량부 내지 80 중량부로 포함될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 단계 (a)에서 곡물은 밀배아 및 밀기울에 귀리, 렌틸콩, 현미, 찰보리 및 퀴노아로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 곡물을 추가적으로 포함할 수 있다. 이들 각각의 함량 범위는 곡물 100 중량부에 대해 1 중량부 내지 20 중량부, 구체적으로 3 중량부 내지 10 중량부의 범위일 수 있다. 또한, 상기 단계 (a)의 곡물은 30 %(v/w) 내지 70 %(v/w)의 수분 함량을 갖는 곡물일 수 있다. 구체적으로, 상기 수분함량은 30 %(v/w) 내지 60 %(v/w), 30 %(v/w) 내지 50 %(v/w), 또는 30 %(v/w) 내지 40 %(v/w)일 수 있다. 수분함량이 30% 보다 낮은 경우에는 저수분으로 인하여 바실러스 균의 발효속도가 지연되며, 특히 발효 중에 증발되는 수분으로 인하여 최종발효 후 바실러스 균이 자라기 어려운 수분함량인 20% 수준에 이르게 되기 때문에 적합하지가 않을 수 있다. 수분함량이 70% 보다 높은 경우에는 건조 공정에서 비용이 많이 드는 문제점이 발생할 수 있다.

구체적으로, 상기 수분함량은 곡물 자체의 수분함량이거나, 이미 수분을 함유하도록 전처리된 곡물이거나, 또는 상기 (a)의 곡물에 수분을 추가적으로 처리함으로써 가지는 수분함량일 수 있다(즉, 상기 단계 (a)의 곡물이 수분이 처리된 곡물일 수 있다). 상기 수분 처리는 곡물에 적당량의 물을 직접 분무 또는 혼합하여 실시할 수 있다.

더불어, 본 출원의 곡물 발효물의 제조방법은 단계 (a) 이전에 곡물에 열처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 열처리 단계 없이도 곡물에서의 균주 배양이 가능하나, 열처리에 의해 곡물 중의 잡균을 사멸시키는 동시에 곡물 세포벽을 파괴하고 호화작용 및 단백질을 변성시킴으로써 미생물이 활발히 생육할 수 있는 환경을 제공할 수 있는 바 균주 접종량을 낮추어 원가를 저감시킬 수 있다. 상기 열처리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 스팀(steam) 또는 과열 수증기(superheated steam)를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 70℃ 내지 140℃의 스팀으로 10분 내지 60분간 증자 처리하거나 200℃ 내지 300℃의 과열 수증기로 수초 내지 수분의 단시간 동안 열처리하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 70℃ 내지 130℃의 스팀으로 20분 내지 60분간 증자할 수 있으며, 또는 80℃ 내지 125℃의 스팀으로 20분 내지 45분간 증자할 수 있다. 열처리 온도가 낮거나 처리 시간이 짧은 경우에는 잡균의 살균 효과가 저하되고 이후의 발효 공정이 원활하게 진행되지 않을 수 있으며, 열처리 온도가 높거나 처리 시간이 길어지는 경우에는 곡물 내 단백질의 변성으로 인한 발효의 효율 저하로 최종 제품의 품질이 하락할 수 있다.

또한, 본 출원의 곡물 발효물의 제조방법은 단계 (a) 이전에 곡물에 수분을 처리한 이후에 열처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 수분 처리와 열처리는 상기 기술한 바와 같다.

이어서 상기 곡물에 수탁번호 KCTC12905BP인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 접종한다.

상기 접종 전, 임의로 열처리된 곡물을 냉각하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 냉각은 열처리가 종결된 후 자연적으로 진행할 수 있고, 또는 냉각 속도를 높여 과열을 방지하고 균일하게 냉각할 수 있다(예컨대, 컨베이어(conveyor)식 방냉기를 이용). 구체적으로, 냉각 온도는 30℃ 내지 50℃, 35℃ 내지 45℃로, 또는 35℃ 내지 40℃로 냉각할 수 있다.

곡물에 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주의 접종은 상기 균주를 배양한 전배양액을 그대로 사용하거나, 분리된 균주를 사용하거나 또는 동결건조 등의 형태로 분말화된 균주 또는 이의 배양물을 사용할 수 있다. BA245 균주의 접종량은 접종 직후의 균수가 1¡10⁵ CFU/g 내지 1¡10¹⁰ CFU/g, 또는 1¡10⁶ CFU/g 내지 1¡10⁹ CFU/g일 수 있다. 접종량이 1¡10⁵ CFU/g 미만인 경우에는 종균 발효액의 소요량이 적은 반면에 곡물을 발효시키는데 많은 시간이 소요되어 제품 생산에 요구되는 발효시간이 길어지고 잡균이 오염될 가능성이 높은 단점이 있다. 반면, 접종량이 1¡10¹⁰ CFU/g을 초과하는 경우에는 발효시간은 상당히 단축할 수 있으나, 접종용 종균의 생산원가에 부담이 되는 단점이 있다.

단계 (b): 균주를 배양하여 곡물 발효물을 수득하는 단계

단계 (a) 실시 후, 본 출원의 균주를 곡물과 함께 배양하여 곡물 발효물을 수득할 수 있다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 출원의 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 곡물에 배양시킴으로써 상기 균주의 우수한 전분 분해효소 활성 및 단백 분해효소 활성으로 인해 수득된 곡물 발효물 내 단백질을 저분자화하여 소화 흡수율을 높이고, 식이섬유 등의 각종 유용 성분들을 포함하게 하며, 혈전 분해 작용; 소화 개선 작용; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료 작용; 또는 항산화 작용 등의 유리한 활성을 갖게 할 수 있다.

상기 배양은 액체 배양 또는 고체 배양일 수 있으나, 구체적으로 고체 배양일 수 있다. 배양 온도는 20℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃ 또는 37℃일 수 있으며, 배양 시간은 1-48시간, 6-48시간, 6-36시간, 12-36시간, 12-30시간, 18-30시간, 22-26시간 또는 24시간일 수 있다.

배양 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 액상 배양 탱크, 회전 드럼식 발효기(rotary drum fermentor) 또는 트레이 발효기 (tray fermentor)를 사용하여 배양할 수 있다. 상기 회전 드럼식 또는 트레이 발효기 이외에도 곡물 또는 그의 혼합물의 발효에 유용한 것이라면 그 형식에 제한 없이 본 출원의 방법에 사용될 수 있고, 생산 규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용할 수 있다.

본 출원의 제조방법은 단계 (b)에서 수득된 곡물 발효물을 건조 및/또는 분쇄하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조 및/또는 분쇄는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으나, 과도하게 고온에서 건조할 경우에는 곡물 발효물 중의 생균이 사멸될 수 있고 효소 활성 또한 감소할 수 있으므로 주의하여야 한다. 구체적으로, 본 출원의 균주가 사멸되지 않고 효소 활성도 유지되는 저온에서 건조해야 하며, 저온, 예컨대 40?J 내지 75?J, 또는 50?J 내지 70?J에서, 저습도의 열풍으로 곡물 발효물 중 수분 함량이 20% 이하, 또는 10% 이하가 되도록 건조할 수 있다. 분쇄 과정은 곡물 발효물을 이용하고자 하는 목적에 따라 다양한 크기로 분쇄할 수 있으며, 분쇄 방법으로서 예를 들어, 햄머 밀(hammer mill) 등을 이용할 수 있다.

본 출원의 또 다른 양태는, 수탁번호 KCTC12905BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 포함하는 곡물 발효물을 제공하는 것이다.

구체적으로, 상기 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주는 이의 배양물 또는 이의 파쇄물 등을 포함할 수 있다. 상기 BA245 균주는 상술한 바와 같다.

또한, 본 출원의 곡물 발효물은 다음을 추가적으로 포함할 수 있다: (a) 50-60 중량% 탄수화물; (b) 20-30 중량% 조단백질; (c) 50-200 mg/100g 라이신; (d) 15-150 mg/100g 이소로이신; (e) 100-300 mg/100g 로이신; (f) 10-70 mg/100g 메티오닌; (g) 100-300 mg/100g 페닐알라닌; (h) 50-100 mg/100g 트립토판; 및 (i) 50-300 mg/100g 발린. 구체적으로, 본 출원의 곡물 발효물은 다음을 추가적으로 포함할 수 있다: (j) 25-30 중량% 식이섬유; 및 (k) 3-80 mg/100g 트레오닌. 보다 구체적으로, 곡물 발효물 중 탄수화물은 53 내지 60 중량%이고, 식이섬유는 26 내지 29 중량%이고, 조단백질은 21 내지 25 중량%일 수 있다. 필수 아미노산인 트레오닌은 40 내지 70 mg/100g, 또는 40 내지 60 mg/100g; 라이신은 70 내지 150 mg/100g, 또는 100 내지 150 mg/100g; 이소로이신은 70 내지 120 mg/100g, 또는 80 내지 110 mg/100g; 로이신은 150 내지 250 mg/100g, 또는 170 내지 240 mg/100g; 메티오닌은 30 내지 60 mg/100g, 또는 40 내지 50 mg/100g; 페닐알라닌은 150 내지 250 mg/100g, 또는 170 내지 240 mg/100g; 트립토판은 60 내지 90 mg/100g, 또는 65 내지 85 mg/100g; 그리고 발린은 150 내지 250 mg/100g, 또는 170 내지 240 mg/100g 포함될 수 있다.

상기 곡물 발효물은 5 Mw(kDa) 이하의 펩타이드 함량이 조단백질 100 중량부에 대하여 50-80 중량부이고, 30 Mw(kDa) 이상의 펩타이드 함량이 5-20 중량부일 수 있다. 구체적으로, 상기 5 Mw(kDa) 이하의 펩타이드 함량은 조단백질 100중량부에 대하여 55-70 중량부이고, 30 Mw(kDa) 이상의 펩타이드 함량이 5-15 중량부일 수 있다.

더불어, 상기 곡물 발효물은 알파-아밀라아제 활성이 2000-4000 U/g, 2000-4000 U/g, 2300-3500 U/g, 2500-3500 U/g 또는 2500-3000 U/g일 수 있다.

또한, 상기 곡물 발효물은 프로테아제 활성이 2000-4000 U/g, 2500-4000 U/g, 3000-4000 U/g, 3500-4000 U/g 또는 3700-4000 U/g일 수 있다.

본 출원의 곡물 발효물은 전술한 본 출원의 일 양태인 곡물 발효물의 제조 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 출원은 전술한 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 음용할 수 있는 식품이라면 특별히 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 식품 조성물은 효소 식품일 수 있다. 본 출원에서 용어, “효소 식품”이란, 효소의 기능을 강화시키기 위하여 식용 원료에 식용미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 한 것, 식품에서 효소 함유부분을 추출한 것, 또는 이들을 가공한 것을 의미한다.

본 출원의 식품 조성물에는 건강식품 조성물도 포함될 수 있다. 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물을 식품 또는 건강식품 조성물에 사용할 경우, 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 식품 조성물은 식용 가능한 조성물인 경우, 제한없이 포함될 수 있다. 식품 조성물의 예로는 육류, 소세지, 빵, 케이크. 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류(쿠키, 크래커 등), 피자, 면류(라면 등), 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 케첩, 소스, 그레이비(gravies), 드레싱, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 출원의 식품 또는 건강식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 출원의 식품 또는 건강식품 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 구체적으로는 약 0.04~0.10g 일 수 있다.

상기 외에 본 출원의 식품 또는 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 출원의 식품 또는 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 출원의 식품 또는 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 출원은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 이를 포함하는 곡물 발효물을 포함하는, 혈전 분해용; 소화 개선용; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료용; 또는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 출원의 용어, "예방"은 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 본 출원의 용어, "개선"이란 발생된 질병의 증상 및 부작용을 경감 또는 완화시키는 모든 행위를 의미한다. 본 출원의 용어, "치료"란 발생된 질병의 증상 및 부작용을 개선, 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물은 구체적으로, 피브린 분해 활성을 갖고(실시예 8); 고형분의 위 배출능을 개선시키며(실시예 9); 급성 장염 동물모델에서 장 투과성을 개선시키고(실시예 10), 장막을 강화하며(실시예 11), 장 조직의 손상을 치료하고(실시예 12); 그리고 항산화 활성이 높음을 확인하였다(실시예 13). 따라서 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물이 혈전 분해; 소화 개선; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료; 및 항산화 활성이 있음을 알 수 있는바, 혈전 분해용; 소화 개선용; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료용; 또는 항산화용 의약품 및 식품(또는 건강기능식품)으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

구체적으로 상기 혈전 분해용 조성물은 혈전 분해 작용에 의해 심근경색, 맥혈전증, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 또는 뇌색전증의 예방 또는 치료에 효과적일 수 있다.

본 출원의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 구체적으로 경구 투여할 수 있다.

본 출원의 조성물이 약제학적 조성물로 사용될 경우, 투여를 위해서 본 출원의 균주 또는 곡물 발효물 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 추가적으로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science (22nd), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 제제화할 수 있다.

본 출원의 약제학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 출원은 이의 투여가 필요한 대상체(subject)에게 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 상기 균주를 이용해 제조된 곡물 발효물 및 약제학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈전으로 인한 질환의 치료, 개선 또는 예방; 소화 기능 개선; 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료; 또는 활성 산소를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 출원의 투여는 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 다양한 투여량으로 본 출원의 조성물을 투여함으로써 실시할 수 있다. 본 출원의 곡물 발효물은 일일 투여량이 약 0.0001~600 ㎎/㎏, 또는 약 0.001~500 ㎎/㎏일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 또한, 본 출원의 균주는 5 x 10⁴내지 5 x 10⁸ CFU/ml, 또는 1 x 10⁶내지 1 x 10⁸ CFU/ml 양으로 투여할 수 있으며, 회당 30 ml 내지 100 ml 또는 50ml 내지 100ml를 투여할 수 있고, 1일 1회 내지 4회 투여할 수 있다.

(a) 본 출원은 전분 분해효소 활성 및 단백 분해효소 활성이 뛰어난 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) BA245 균주(KCTC12905BP), 상기 균주를 이용하여 곡물 발효물을 제조하는 방법, 상기 균주를 포함하는 곡물 발효물, 그리고 상기 균주 또는 상기 곡물 발효물을 포함하는 다양한 기능성 조성물을 제공한다.

(b) 상기 균주를 종균으로 사용하여 곡물 발효물을 제조하는 경우, 상기 곡물 발효물은 탄수화물 및 단백질의 가수분해에 의한 저분자화 및 조단백 함량의 증가, 식이섬유 및 필수 유리아미노산의 증가 등으로 인해, 혈전으로 인한 질환의 치료 또는 예방, 소화 개선, 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의 예방, 개선 또는 치료, 또는 항산화 작용에 있어 효과적이다.

(c) 따라서, 곡물 발효물을 사용하여 영양소 섭취, 혈전 용해, 소화 개선, 장 건강 및 항산화에 도움을 줄 수 있는 고품질의 의약품 및 식품(또는 건강식품)을 제공할 수 있다.

도 1은 전분 분해효소 및 단백 분해효소를 동시에 고생산하는 균주를 선별하기 위한 알파-아밀라아제 평판배지(도 1a) 및 프로테아제 평판배지(도 1b) 선별 결과이다.
도 2는 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 한 계통분류학적 유연관계를 나타내는 계통수(phylogenic tree)이다.
도 3는 바실러스 속 내 균주들의 계통분류에 적합한 gyrase A 유전자 염기서열을 바탕으로 한 계통분류학적 유연관계를 나타내는 계통수(phylogenic tree)이다.
도 4는 BA245 발효물의 저분자 펩타이드의 함량을 원료 및 동종 균주인 BA474와 비교하여 분석한 크로마토그래피 결과이다.
도 5는 혈전 분해 활성을 나타낸 피브린 플레이트 분석 결과이다.
도 6은 피브린 분해 활성을 보여주는 막대 그래프이다.
도7은 BA245 발효물의 각 함량별 장 투과성 평가 결과이다.
도 8은 장막 강화 정도를 보기 위해 장 세포의 밀착 연결 단백질인 클라우딘(도 8a) 및 오클루딘(도 8b)의 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 9는 BA245 발효물 섭취에 의한 장상피 손상의 회복 정도를 장의 조직학적 관찰을 통하여 확인한 사진이다.
도 10은 곡물 원료, BA245 발효물 및 효소식품 각각에 대한 항산화 활성(라디칼 소거능) 평가 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 요지에 따라 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 전분 및 단백 분해효소 고생산 균주의 선별

본 발명자들은 전분 및 단백 분해효소 생성능이 우수한 균주를 분리하기 위해 다양한 전통 발효식품(김치, 장류, 누룩, 전통민속주 및 젓갈 등)으로부터 약 3000천 종의 미생물을 분리하고, 이들 중에서 약 1308 종의 식품 적합성 바실러스균을 중심으로 전분 및 단백 분해효소의 발현이 높은 균주를 찾고자 하였다.

전분 및 단백 분해효소 고생산 균주의 선별은 각각 1 %(w/v) 가용성 전분(Difco, USA) 또는 2 %(w/v) 탈지유(Difco, USA)가 함유된 YM 한천배지(yeast extract 3.0 g, malt extract 3.0 g, peptone 5.0 g, dextrose 10.0 g, agar 20.0 g)에서 기질이 분해되어 생기는 투명환의 크기를 비교하여 선별하였다.

구체적으로, 균주를 각각 TSB 배지(enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3 ± 0.2 at 25℃)에 접종한 후 37℃, 200 rpm 조건에서 12시간 동안 배양하고, 배양액을 가용성 전분 및 탈지유 함유 YM 한천배지에 1.0 ㎕씩 점적(spotting)하였다. 상기 한천배지를 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 배지 위에 형성된 투명환의 지름을 측정하였다.

그 결과, 1 %(w/v) 가용성 전분 배지의 투명환 직경이 5.85 mm이고, 2 %(w/v) 탈지유(Difco, USA) 배지의 투명환 직경이 6.14 mm으로 전분 및 단백 분해효소 활성이 모두 우수한 BA245 균주를 곡물 발효를 위한 균주로 선별하였다(도 1a 및 1b).

실시예 2: BA245 균주의 동정

2-1. BA245 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석

실시예 1에서 선별된 BA245 균주의 동정을 위해 16S RNA 유전자의 염기서열 분석을 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 의뢰하였으며, 동정에 중요한 50~900 bp 염기 서열을 포함하는 1420 bp (서열번호 1)의 염기서열을 얻었다. 또한, 이 염기서열은 NCBI GenBank에 KR535604의 Accession number를 부여받고 데이터베이스에 등록되었다.

2-2. BA245 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의한 계통수 분석

BA245 균주의 계통 분류학적 위치 분석을 위해 GenBank에 등록되어 있는 염기서열 데이터를 이용하여 바실러스 속 내 BA245 균주와 가까운 위치에 있는 여러 종들의 표준 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 조사하고 이들의 염기서열을 Bioedit program (Hall, 1999)과 Clustal X program (Thompson et al., 1997)을 이용하여 얼라인먼트 하였다. 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model (Kimura, 1983)을 이용하였고, MEGA 3 Program (Kumar et al., 2004)의 neighbor-joining 및 maximum parsimony방법으로 계통분류학적 위치를 결정하였다(도 2).

2-3. BA245 균주의 gyraseA ( gyrA ) 유전자 염기서열에 의한 계통수 분석

gyrase A 유전자 염기서열에 기초한 계통 분류학적 분석을 이용하여 BA245 균주의 동정을 실시하였다.

gyrase A 유전자 염기서열 분석을 위하여 정방향 프라이머 (서열번호 2: 5'- CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3') 와 역방향 프라이머 (서열번호 3: 5'-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3')를 제작한 후, 염기서열 분석을 ㈜마크로젠에 의뢰하였다. BA245 균주와 가까운 위치에 있는 여러 종들의 표준 균주의 gyrase A유전자 염기서열을 조사하고 이들의 염기서열을 Bioedit program (Hall, 1999)과 Clustal X program (Thompson et al., 1997)을 이용하여 얼라인먼트 하였다. 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model (Kimura, 1983)을 이용하였고, MEGA 3 Program (Kumar et al., 2004)의 neighbor-joining 및 maximum parsimony방법으로 계통분류학적 위치를 결정하였다(도 3).

2-4. API kit를 이용한 BA245의 생화학적 특성 분석

바실러스 동정에 사용되는 API 50CH (bioMerieux Co., France)를 이용하여 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주의 생화학적 특성을 조사하였다. API kit는 제조사의 사용 지침에 따라 다음과 같이 진행하고 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 TSB (enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3 ±0.2 at 25℃) 액체 배지에 접종하여 37℃에서 배양한 후 튜브(Eppendorf)에 분주한 후 10,000 rpm에서 5 분간 원심분리 후 세포를 회수하여 멸균 식염수 (0.85%)로 1회 세척하였다. 세포는 멸균 증류수로 현탁하여 무균적으로 깬 API 50CH 배지의 앰플에 접종한 후 파이펫팅하여 고르게 섞어준 다음, 각 테스트 스트립의 마이크로튜브에 150 ㎕씩 분주하였다. 분주를 마친 후 API kit는 37℃ 인큐베이터에서 24~48 시간 동안 배양하면서 색의 변화를 관찰하였다.

특성	결과	특성	결과
Glycerol	+	Salicin	+
Erythritol	-	Cellobiose	+
D-arabinose	-	Maltose	+
L-arabinose	+	Lactose	+
Ribose	+	Melibiose	(+)
D-xylose	+	Sucrose	+
L-xylose	-	Trehalose	+
Adonitol	-	Inulin	-
Methyl-B-D-xylopyranside	-	Melezitose	-
Galactose	(+)	Raffinose	+
Glucose	+	Starch	+
Fructose	+	Glycogen	+
Mannose	+	Xylitol	-
Sorbose	-	Gentiobiose	+
Rhamnose	-	D- turanose	(+)
Dulcitol	-	D- lyxose	-
Inositol	+	D- tagatose	-
Mannitol	+	D- fucose	-
Sorbitol	+	L- fucose	-
Methyl-α,D-Mannopyranside	-	D- arabitol	-
Methyl-α,D-glucoside	+	L- arabitol	-
N-acetyl-glucosamine	+	Gluconate	-
Amygdalin	+	2-keto-gluconate	-
Arbutin	+	5-keto-gluconate	(+)
Esculin	+

2-5. 동정 결과

상기 생화학 특성과 계통분류학적 유연관계 분석 결과를 종합한 결과, 상기 선별된 BA245 균주를 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정하여 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245로 명명하였고, 부다페스트 조약 하에 2015년 9월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC12905BP를 부여받았다.

실시예 3: BA245 균주를 이용한 곡물 발효물 제조

실시예 2에서 선별한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주(이하, 'BA245 균주'로 기재)를 이용하여 하기와 같이 곡물 발효물을 제조하였다.

먼저, 곡물 300 g [밀기울; 밀배아; 귀리; 현미; 퀴노아; 렌틸콩; 찰보리; 밀배아 및 밀기울 혼합 곡물(밀배아 60 중량% 및 밀기울 40 중량%); 및 전곡물 혼합물(밀배아 40 중량%, 밀기울 30 중량%, 귀리 10 중량%, 렌틸콩 5 중량%, 현미 5 중량%, 찰보리 5 중량% 및 퀴노아 5 중량%, 이하 전곡물 혼합물은 '곡물 원료'로 기재)을 각각 300 g] 수분을 첨가한 후 121℃에서 30분간 증자하고, 40℃ 이하로 냉각시켰다. 이어서, 상기 BA245 균주를 각각 TSB 한천배지(enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, agar 15.0 g, final pH: 7.3 ±0.2 at 25℃)에 도말하고 37℃에서 12시간 동안 배양하여 균주를 활성화하였다. 활성화된 균주를 0.8% NaCl 살균용액 9 ㎖에 약 2 백금(A_660nm에서 0.2 정도로 희석함)을 현탁하였고, 이 현탁액을 종균으로 사용하였다. 본 배양은 미리 준비한 40 ㎖의 TSB 배지(enzymatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.0 g, NaCl 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, dextrose 2.5 g, final pH: 7.3 ±0.2 at 25℃)에 종균 현탁액을 1% 접종한 후 37℃에서 180 rpm으로 진탕 배양하였다.

수분 함량을 36%로 맞추어 증자된 곡물에 배양액 30 ㎖(6.0 X 10⁷ cfu/㎖)을 넣고 잘 혼합한 후 37℃에서 24시간 동안 항습이 유지되는 조건에서 정치 배양하는 고체발효를 실시함으로써 곡물 발효물을 제조하였다.

또한, BA245 균주의 대조군으로써, BA245 균주와 동일한 종에 해당하는 균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA474(이하, 'BA474 균주'로 기재)를 사용하였으며, 상기 BA474 균주를 이용하여 발효한 곡물 발효물은 전곡물 혼합물을 원료로 하여 BA245 균주 대신 BA474 균주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 제조하였다.

실시예 4: 전분 분해효소 활성 분석

곡물 발효물의 전분 분해효소 활성을 분석하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.

실시예 3의 BA245 균주 및 BA245 균주 각각을 이용하여 발효한 곡물 발효물을 각각 60℃ 건조기에서 수분 함량 10% 이하가 될 때까지 건조한 후 분쇄하여 전분 분해효소 활성 측정의 검체(이하, 각 곡물 발효물을 발효에 이용한 균주에 따라 'BA245 발효물' 및 'BA474 발효물'로 기재하였으며, 전곡물 혼합물(밀배아 40 중량%, 밀기울 30 중량%, 귀리 10 중량%, 렌틸콩 5 중량%, 현미 5 중량%, 찰보리 5 중량% 및 퀴노아 5 중량%)을 원료로 사용한 경우만을 원료를 기재하지 않은 'BA245 발효물'로 기재하고, 이를 제외한 각각의 곡물 또는 밀배아 및 밀기울 혼합 곡물을 원료로 사용한 경우 'BA245 발효물' 후단의 괄호 내에 발효에 사용한 원료를 표시하여 기재)로 사용하였다. 전분 분해효소 활성은 「식품의 기준 및 규격」내 효소식품 알파-아밀라아제 시험법에 따라 측정하였다.

구체적으로, 각각의 검체 5.0 g을 정밀히 달아 물에 녹여 100 ml로 한 다음 여과하여 검액으로 하고, 20 ml 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용 및 공시험용 시험관으로 사용하였다. 시험용 시험관에는 1 % 가용성 전분용액 5 ml, 맥바인 버퍼 (pH 6.0) 13 ml와 0.1% 염화칼슘 용액 1 ml을 넣고 37℃로 가온하고 검액 1 ml을 넣은 후 37℃에서 30분간 방치하여 시험용 반응액으로 하였다. 별도로, 100℃에서 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액 1 ml을 시험용과 같이 조작하여 공시험용 반응액으로 하였다. 상기 시험용과 공시험용 반응액 0.2 ml에 요오드시액 10 ml을 넣은 것을 시험용액으로 하고, 물을 대조액으로 하여 액층 1 cm 파장 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030 이상 작아야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용하였다. 전분 함량은 상기 동일한 요오드 (I₂) 용액의 정색에 의한 표준곡선으로 산출하였으며, 알파-아밀라아제 1 Unit은 30분 동안 10 mg의 전분을 소화시키는 효소의 양으로 정의하였다.

시료	알파-아밀라아제 (U/g)
BA245 발효물	2762
BA245 발효물(밀배아 및 밀기울 혼합 곡물)	2300
BA474 발효물	169

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 대조군인 BA474 발효물에 비해 BA245 발효물 및 BA245 발효물(밀배아 및 밀기울 혼합 곡물)의 전분 분해효소 활성이 매우 우수한 것을 확인하였다.

실시예 5: 단백 분해효소 활성 분석

BA254 발효물의 단백 분해효소 활성을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.

실시예 3과 같이 검체를 얻은 후, 「식품의 기준 및 규격」내 효소식품 프로테아제 시험법에 따라 측정하였다.

검체 약 5 g을 정밀히 달아 물에 녹여 100 ml 로 한 다음 여과하여 검액으로 하였다. 0.6% 카제인 용액 1 ml을 시험관에 넣고 37℃ 항온 수욕 중에서 가온한 다음 여기에 검액 1 ml을 정확히 넣고 잘 흔들어 섞은 후, 곧 37℃ 의 항온수욕 중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4 M 삼염화초산액 2 ml을 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과하였다. 여과액 1 ml을 시험관에 정확히 취하여 0.4 M 탄산나트륨 용액 5 ml 및 포린시액 (원액을 3배 희석한 액) 1 ml을 넣어 잘 흔들어 섞었다. 37℃에서 20분간 방치한 다음, 발색된 액을 시험용액으로 하였다. 이와는 별도로, 검액 1 ml을 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4 M 삼염화초산액 2 ml을 넣어서 혼화하고 0.6% 카제인 용액 1 ml을 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 하였다. 물을 대조액으로 하여 액층 1 cm 파장 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험용액의 흡광도보다 0.030 이상 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용하였다. 표준곡선은 티로신 (tyrosine)을 이용하여 작성하였으며, 프로테아제 활성은 측정된 티로신 함량을 기준으로 비교 분석하고, 프로테아제 1 Unit은 1분간 생성되는 티로신의 ug 수로 정의하였다.

시료	프로테아제 (U/g)
BA245 발효물	3868
BA245 발효물(밀배아 및 밀기울 혼합 곡물)	3481
BA474 발효물	106

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 대조군인 BA474 발효물에 비해 BA245 발효물의 단백 분해효소 활성이 매우 우수한 것을 확인하였다.

상기 실시예 3과 실시예 4의 결과로부터 발효 역가가 높은 곡물 발효물을 포함하는 효소식품 제조에 BA245가 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: 저분자량 단백질 함량 분석

실시예 4에서 BA245를 이용하여 곡물 발효 시 단백 분해효소 활성이 우수한 곡물 발효물이 제조됨을 확인한 바, 곡물 내의 단백질이 가수분해된 펩타이드 형태로 생성되거나 저분자량의 단백질로 분해되는지 여부를 확인하기 위하여 BA245 발효물의 분자량 범위 별 단백질 함량을 분석하였다.

상기 실시예 3의 검체 0.1 g을 정확히 달아 5 ml의 8 M Urea로 추출하였다. 8,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 상층액만을 따로 취한 후 0.22 um 시린지 필터로 여과하여 분석시료로 하였다. 주입(injection) 볼륨은 25 ul로 하였으며, 50 mM NaPO₄ (pH 7.2)에 150 mM NaCl을 혼합하여 이동상(mobile phase)으로 사용하였다. 유속은 0.5 ml/min으로 하였으며, 214 nm의 UV 파장에서 검출(detection)하였다.

그 결과, BA245 발효물은 곡물 원료 및 BA474 발효물과 비교하여 크기가 작은 단백질 분자 쪽의 피크 면적이 더 커 단백질의 밀도가 중앙 밴드 쪽으로 치우쳐져 있는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 도 4의 크로마토그래피 상에서 왼쪽 밴드가 분자량이 큰 단백질이고 중앙 밴드가 분자량이 작은 단백질이며, 오른쪽 밴드는 용매를 나타낸다. 도 4의 크로마토그래피를 수치화하여 비교한 결과는 하기 표 4와 같다.

시료	Mw(kDa)				합계 (%)
시료	30이상	10 ~ 30	5~10	5 이하	합계 (%)
곡물 원료	58.05	17.31	8.07	16.57	100
BA245 발효물	10.34	10.06	15.01	64.59	100
BA474 발효물	36.15	13.70	11.75	38.40	100

상기 결과로부터, BA245를 이용한 발효에 의해서 원료(예컨대, 곡물 원료) 내 분자량이 큰 단백질이 분자량이 작은 단백질로 가수분해되었으며, BA474에 비해서도 가수분해 정도가 현저하게 우수함을 확인하였다.

실시예 7: 영양성분 분석

BA245 균주를 이용하여 곡물 발효 시, 탄수화물 함량이 감소하고 식이섬유 함량이 증가하며, 조단백 및 필수 유리 아미노산의 함량이 증가함으로써 영양성분의 증대 및 영양소 흡수율이 증가됨을 확인하기 위하여 곡물 원료, BA245 발효물, BA474 발효물 및 시판 3사의 곡물을 발효한 효소식품[발효효소의 비밀, 대상웰라이프(이하, '대상'으로 기재); 씨앗 발효효소, LG생활건강(이하, 'LG'로 기재); 풀비타 내몸애 곡류효소 다이제스트, 올가홀푸드(이하, '풀무원'으로 기재))에 대하여 한국기능식품연구원에 의뢰하여 영양성분 분석을 진행하였다.

[표 5]

[표 6]

그 결과, 표 5 및 6에 나타난 바와 같이, BA245를 이용한 곡물 발효물은 원료 대비 탄수화물 및 당함량이 감소하고, 식이섬유, 조단백질 및 필수 유리아미노산이 증가하는 등 영양성분이 강화됨을 확인하였으며, BA245 곡물 발효물 및 BA245 곡물 발효물(밀배아 및 밀기울 혼합 곡물)은 BA474 발효물 및 다른 효소식품과 비교한 결과에서도, 영양성분적으로 우위에 있음을 확인하였다.

실시예 8: 피브린 분해효소( fibrinolytic enzyme)의 활성 분석

BA245 발효물의 혈전 분해 활성을 확인하기 위하여 곡물 원료 및 BA245 발효물의 피브린 분해효소 활성을 측정하였다. 대조군으로는 플라스민(plasmin, 1 U/ml) 및 혈전 용해 활성을 갖는 것으로 보고된 청국장(태광), 낫또(풀무원, 아즈마 및 타카노) 및 시판 효소식품(대상; 하이생, ㈜하이모 자연건강사업부)을 사용하였다.

시료 1 g을 9 ml의 멸균 생리식염수에 혼합한 후, 교반기(Wiseshaker, Daihan)를 사용하여 4℃, 30분 동안 혼합하면서 추출하고, 원심분리(8000 x g, 4℃, 30분) 실시한 후 여과하여 상층액을 분석시료로 사용하였다.

8-1. 피브린 플레이트 분석(Fibrin plate assay)

완전히 용해된 2.4% 피브린 용액(pH 7.0) 10 ml에 1.5% 아가로스 용액 10 mL을 첨가하여 혼합한 후 즉시 페트리디쉬에 붓고, 겔이 완전히 굳을 수 있도록 실온에서 2~3 시간 동안 방치하여 피브린 플레이트를 제조하였다. 제조된 피브린 플레이트에 직경 4.5 mm 구멍으로 일정하게 펀칭한 후, 분석시료 20 ㎕를 각 구멍에 적가하여 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 생성된 투명환의 크기를 선명히 볼 수 있도록 0.11 M 삼염화초산을 피브린 겔에 부어주었다.

그 결과, BA245 발효물이 플라스민에 비하여 220%의 혈전분해활성을 나타냈으며, 청국장에 대해서는 177%, 낫또에 대해서는 각각 122%(풀무원), 117%(타카노) 및 131%(아즈마), 효소식품에 대해서는 119%(대상) 및 142%(하이생)의 혈전분해활성을 보임을 확인하였다(표 7 및 도 5).

시료	용해존(mm)
대조군(Plasmin)	8.6
곡물 원료	-
BA245발효물	19.0
효소식품(대상)	15.9
효소식품(하이생)	13.4
낫또(풀무원)	15.6
낫또(타카노)	16.3
낫또(아즈마)	14.5
청국장분말(태광)	10.7

8-2. 피브린 분해 활성( Fibrinolytic activity) 분석

실시예 8에서 제조된 시료 0.1 ml에 10 mM 염화칼슘을 함유하고 있는 0.1M Tris-HCl 버퍼 (pH 7.8) 0.3 ml을 넣고 30°C의 항온수욕에서 5분간 가온하였다. 이 용액에 1.2% 피브린 용액 (pH 7.8) 0.3 ml을 첨가하여 혼합한 뒤 30°C에서 10분간 반응시킨 후 0.11 M 삼염화초산액 0.6 ml을 넣어 효소반응을 억제시켜 시험용액으로 하였다. 이와는 별도로, 시료 0.1 ml에 0.1M Tris-HCl 버퍼 (pH 7.8) 0.3 ml에 넣어 30℃의 항온수욕조에서 10분간 반응한 뒤 0.11 M 삼염화초산액 0.6 ml을 넣어서 혼화하고 1.2% 피브린 용액 (pH 7.8) 0.3 ml을 넣어 공시험용액으로 하였다. 시험용액과 공시험용액은 원심분리(12000 rpm, 5분) 후 상층액을 수거하여 275 nm에서 흡광도를 측정하여 혈전분해 효소 활성을 정량적으로 비교하였다.

그 결과, BA245로 발효한 곡물 발효물 내 피브린 분해 활성이 가장 우수함과 동시에, 낫또에 비해서도 현저히 높은 것을 확인하였다(표 8 및 도 6).

시료	피브린 분해 활성(FU/g)
곡물 원료	19.86
BA245발효물	136.17
효소식품(대상)	53.90
효소식품(하이생)	25.53
낫또(풀무원)	68.06
낫또(타카노)	52.48
낫또(아즈마)	36.88
청국장분말(태광)	22.7

8-3. BA245 균주의 피브린 분해 활성 분석

균주 자체의 피브린 분해 활성 분석을 위하여 BA245 균주와 시판 낫또에서 분리한 균주 3종을 비교하였다.

그 결과, 표 9에서 볼 수 있는 바와 같이 BA245 균주의 혈전 분해효소 활성이 시판 낫또에서 분리한 균주와 비교하여 현저히 우수한 것을 확인하였다.

시료	피브린 분해 활성(FU/g)
BA245 균주	1617
낫또(풀무원) 분리 균주	1209
낫또(타카노) 분리 균주	1072
낫또(아즈마) 분리 균주	1098

실시예 9: BA245 발효물 급여에 의한 고형분 위 배출능 (gastric emptying) 개선 평가

8주령 수컷 SD(Sprague-dawley) 랫트를 각 실험군별 10마리씩 배치하였고, 모든 동물들은 1주간 실험 식이 및 환경에 적응하도록 하였다. 적응 후 위 배출능 측정을 위해 물은 자유롭게 이용하도록 두면서 20시간 동안 절식시켰다.

실험예 1은 동일 고형분을 급여한 조건에서 동일시간당 위 배출능을 평가하였다. 구체적으로, 실험 당일 SD 랫트에게 바륨설페이트 50%, 아가로스 0.6%, 사료(AIN-93, Dyets)가 물에 현탁된 실험 식이 3g을 경구투여하였다. 실험군은 총 3군으로 대조군은 사료 15%를 급여하였고, 실험군은 곡물 원료 5%+사료 10%, BA245 발효물 5%+사료 10%가 배합된 식이를 급여하여 급여된 고형분 양을 동일하게 하였다. 투여 40분 후 위를 적출하여 위 내에 남아있는 식이의 무게를 측정하여 위 배출능(%)을 평가하였다.

실험예 2는 실제 인체에서 복용법을 반영한 모델로, 동일 사료량을 공급하고 BA245 발효물을 추가 급여하였을 때 위 배출능 개선을 평가하였고, 이때 인간 등가 투여량(human equivalent dose)은 랫트 기준 6배를 적용하였다. 대조구로써 사료 15%를 급여하고, 실험군은 곡물 원료 600 mg/kg, BA245 발효물 600 mg/kg를 각각 추가 급여하였다. 실험예 1과 동일하게 투여 40분 후 위를 적출하여 위 내에 남아있는 식이의 무게를 측정하여 위 배출능(%)을 평가하였다.

그 결과, 실험예 1에서 BA245 발효물 투여 시 사료 단독 및 곡물 원료 급여군 대비 유의적인 위 배출능의 증가(p<0.05)를 확인하였고(표 10), 실험예2에서도 곡물 원료 급여군 대비 유의적인 위배출능 증가(p<0.05)를 확인하였다(표 11).

위 배출능은 임상적으로 기능성 소화불량에서 저하되는 인자로 알려져 있는바, 식이와 함께 BA245 발효물 섭취 시 소화능력을 개선할 수 있을 것으로 평가할 수 있다.

실험군	위 배출능(%,±SD)
사료(15%)	23±20
사료(10%)+곡물 원료(5%)	9±11
사료(10%)+BA245 발효물(5%)	37±21

실험군	위 배출능(%,±SD)
사료	23±20
사료+곡물 원료(600 mg/kg)	9±11
사료+BA245 발효물(600 mg/kg)	37±21

실시예 10: 급성 장염 동물모델에서 BA245 발효물 섭취에 의한 장투과성 개선 평가

랫트에 알코올을 투여하여 급성 장염 동물 모델을 만들고, 섭취 농도를 다르게 한 BA245 발효물을 식이하게 하여, 섭취량에 따른 장기능 회복 정도를 측정하였다.

사용한 동물은 8주령 200~250g의 몸무게를 가진 SD 랫트며, 폴리카보네이트 케이지에서 12시간마다 바뀌는 명/암 사이클 하에 사육하였다. 1주간의 적응기간을 가진 뒤 자유식이와 함께 하기 실험 디자인에 따라 처리를 진행하였다.

그룹 1 : 대조군

그룹 2 : 에탄올

그룹 3 : 에탄올 + BA245 발효물 50 mg/kg/day

그룹 4 : 에탄올 + BA245 발효물 100 mg/kg/day

그룹 5 : 에탄올 + BA245 발효물 150 mg/kg/day

그룹 6 : 에탄올 + 곡물 원료 100 mg/kg/day

그룹 2부터 6까지는 4주간 알코올을 경구투여하여 과민성 대장증후군을 유도하고 장기능의 저하를 일으켰다. 초기 투여량은 2g/kg/day이다. 이때 경구투여하는 알코올의 양은 매주 1g/kg/day씩 증가하여, 마지막 4주차에는 5g/kg/day를 경구투여하였다. 4주 경과 후 장투과성을 측정하였다.

구체적으로, 장투과성 측정은 랫트를 희생시킨 후 분리한 회장을 Krebs-Henseleit 비카보네이트 버퍼 (KHBB: bicarbonate buffer)에 담근 다음 장의 한쪽 끝을 봉합하고, 100 ㎕의 FITC-dextran을 루멘(lumen)에 주입하였다. 나머지 장 끝을 봉합하여 8cm의 장 주머니(gut sac)을 형성하게 하였다. KHBB로 씻어낸 후 장 주머니를 2 mL의 KHBB에 위치시켜 37도에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 루멘으로부터 인큐베이션 버퍼로 통과된 FITC-dextran의 FD-4는 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 530 nm에서 측정하였다. FD-4의 투과성은 1분당 1 cm에서의 ㎍으로 나타낸다.

그 결과, BA245 발효물 급여에 의해 알코올 투여로 인하여 증가된 장투과성의 유의적인 감소를 확인하였고, 특히 체중 kg당 100 mg 이상 투여한 군에서는 정상군에 가까운 회복을 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 11: 급성 장염증 동물모델을 통한 BA245 발효물 섭취에 의한 장막 강화 분석

장막 약화로 장액이 새어 나오게 되면 장액성 염증(Serous inflammation)을 유발하는바, 실시예 10에서 디자인한 동물모델을 활용하여 알코올로 인해 증가된 장투과성에 대한 회복 정도를 정량적으로 측정하기 위해 장 투과성에 관여하는 장세포의 밀착 연결 단백질(tight junction protein) 분석을 진행하였다. 장막의 세포결합에 관여하는 주요 밀착 연결 단백질은 대표적으로 ZO-1, 클라우딘(claudin), 오클루딘(occluding)인바, qRT-PCR분석을 통해 각 단백질에 해당하는 유전자의 발현정도를 측정하고 장세포간의 결합정도를 확인하여 발효물 섭취효과를 확인하였다. RNA 추출 시 트리졸을 이용하였고, 농도는 나노드롭 분광 광도계(nanodrop spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, BA245 발효물 투여 및 급여 농도에 비례하여 클라우딘과 오클루딘의 발현이 증가되어 장막이 강화됨을 확인하였다(p<0.05)(도 8a 및 8b).

실시예 12: 장의 조직학적 분석을 통한 BA245 발효물 섭취에 의한 구조 손상 완화 정도의 평가

실시예 10에서 디자인한 동물모델을 활용하여 장의 조직학적 검사를 시행하였다. 각 그룹으로부터 샘플링한 장 조직을 10% 포르말린 용액에 고정하고 에탄올로 탈수를 한 후에 파라핀에 고정하였다. 4 ㎛ 틱 섹션(thick section)에 헤마토질린-에오신(hematozylin-Eosin) 염색을 시행하고, 염색된 각각의 절편은 현미경을 통해 관찰하였다.

알코올에 의해 장 손상이 진행되면, 장벽의 음와(crypt)와 융모(villus) 구조가 무너지게 됨을 확인할 수 있는데, BA245 발효물 섭취군 특히 체중 kg당 100 mg 이상 섭취군에서 정상조직에 가깝게 회복된 모습을 관찰할 수 있었다(도 9).

실시예 13: BA245 발효물의 항산화 활성 측정

항산화 활성은 산화스트레스에 의해 발병되는 각종 질병(지질 및 산화물 축적 방지, 효소 불활성화, 세포노화, 동맥경화, 당뇨병, 뇌졸증, 암, DNA 합성 감소, 성인병 및 노화 등)을 제어한다고 알려져 있다. 이에 곡물 원료, BA245 발효물 및 시판 효소식품 2종(대상 및 하이생)에 대하여 비교하였다.

구체적으로, 시료: 70% 에탄올을 1 : 9 비율로 혼합 한 후, 교반기(Wiseshaker, Daihan)를 사용하여 30℃, 3시간 동안 혼합하면서 추출하였다. 이 혼합물은 원심분리(8000 x g, 4℃, 10분) 실시 후 상층액을 따로 수거하였고, 동일한 과정을 반복하여 추출한 후 최종 회수한 상층액을 여과하였다. 여과된 상층액은 동결건조기를 사용하여 용매를 완전히 건조한 후 건조물을 분석시료로 사용하였다.

시료 10 mg은 70% 에탄올 1 ml에 완전히 용해하여 시험액으로 사용하였다. ABTS 용액은 38.5 mg ABTS와 6.6 mg 과황화칼륨(Potassium persulfate)을 각각 5 ml 증류수에 녹이고 섞은 후 암실 조건에서 12~16시간 반응시켜 라디칼을 생성시켰다. 그 후, 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.02 이 나오도록 하여 ABTS 용액을 제조하였다.

10 ul 시험액에 990 ul ABTS 용액을 넣어 혼합한 후 암실에서 10분 동안 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 테스트한 후 평균값과 표준편차를 구하였다.

그 결과, BA245 발효물의 자유 라디컬 소거능이 43.7%로 곡물 원료 및 시중 효소식품과 비교해 현저하게 높음을 확인하였다(도 10). 이를 통해 BA245 균주 이용 발효에 의해서 항산화 활성이 증가하며, 종래 효소식품 2종과 비교하여도 항산화 활성이 우수한 것을 알 수 있었다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12905BP

수탁일자 : 20150923

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Novel strains derived from fermented food and having with excellent enzyme activity and method for producing grains-fermented food using the same <130> P16-6180 <150> KR 15/0148663 <151> 2015-10-26 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1420 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of Bacillus amyloliquefaciens BA245 <400> 1 agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac 60 gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg 120 ttgtttgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac 180 ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360 aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc 420 ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480 atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc 540 ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600 tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660 ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt 720 ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780 ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840 acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct 960 agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag 1080 cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140 gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa 1200 gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag 1260 tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320 gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg 1380 aagtcggtga ggtaaccttt aggagccagc cgccgaaggt 1420 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 2 cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

Claims

수탁번호 KCTC12905BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) BA245 균주.
다음의 단계를 포함하는 곡물 발효물의 제조방법:
(a) 곡물에 수탁번호 KCTC12905BP인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 접종하는 단계; 및
(b) 상기 균주를 배양하여 곡물 발효물을 수득하는 단계.
제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 곡물은 밀, 밀배아, 밀기울, 백미, 현미, 발아현미, 보리, 귀리, 적미, 찰흑미, 찹쌀, 미강, 대두, 약콩, 검은콩, 퀴노아, 렌틸콩 및 율무로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 곡물을 포함하는, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 곡물은 밀배아 및 밀기울을 포함하는, 곡물 발효물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 밀배아 및 밀기울은 단계 (a)의 곡물 100 중량부에 대하여 40 중량부 내지 100 중량부인, 곡물 발효물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 단계 (a)의 곡물은 귀리, 렌틸콩, 현미, 찰보리 및 퀴노아로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 곡물을 추가적으로 포함하는, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 곡물은 30 %(v/w) 내지 70 %(v/w)의 수분 함량을 갖는 곡물인, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (a) 이전에 곡물에 수분을 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 곡물에 열처리하는 단계를 추가적으로 포함하는, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 곡물에 수분을 처리한 이후 열처리하는 단계를 추가적으로 포함하는, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 배양은 고체배양인 것인, 곡물 발효물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (B)에서 배양은 20 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 실시하는, 곡물 발효물의 제조방법.
수탁번호 KCTC12905BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주를 포함하는 곡물 발효물.
제13항에 있어서, 상기 곡물 발효물은 제2항의 방법에 의하여 제조된, 곡물 발효물.
제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 제13항에 따른 곡물 발효물을 포함하는 식품 조성물.
제15항에 있어서, 상기 식품 조성물은 효소식품인, 조성물.
제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 제13항에 따른 곡물 발효물을 포함하는 혈전 분해용 조성물.
제17항의 혈전 분해용 조성물은 심근경색, 맥혈전증, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 또는 뇌색전증의 예방, 개선 또는 치료용인, 혈전 분해용 조성물.
제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 제13항에 따른 곡물 발효물을 포함하는 소화 개선용 조성물.
제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 제13항에 따른 곡물 발효물을 포함하는 장 염증, 장막 약화 또는 장 손상의, 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 BA245 균주 또는 제13항에 따른 곡물 발효물을 포함하는 항산화용 조성물.