JP6759337B2 - 酵素生産能が優秀である伝統発酵食品由来の新たな菌株及びこれを用いた穀物発酵酵素食品の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新たなバチルス・アミロリケファシエンス菌株、前記菌株を用いた穀物発酵物の製造方法、前記菌株を含む穀物発酵物、及び前記菌株または穀物発酵物を含む、血栓分解用；消化改善用；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用；または抗酸化用組成物に関する。

酵素とは、体内の代謝活動に作用する重要なタンパク質であり、化学作用における触媒の役割をする物質を称する。大別して、体内で生成できず外部から摂取しなければならない食品酵素、体内で生成され消化に必要な役割をする消化酵素、消化以外の代謝作用に必要な役割をする代謝酵素がある。このうち、食品酵素は、消化吸収作用、分解排出作用、抗炎・抗菌作用、解毒殺菌作用、血液浄化作用及び細胞賦活作用などの生理作用をすることが報告されている（シンヒョンジェ、酵素治療、ｐ．２９−４１、２０１３）。

酵素食品は、前記酵素の機能を強化させるために食用原料に食用微生物を培養して酵素を多量に含有させたもの、食品から酵素を含有した部分を抽出したもの、またはこれらを加工したものを通称する言葉である。前記酵素食品は、食品自体の酵素と微生物の発酵及び熟成過程を通じて、様々な生理活性物質及び栄養素の生成作用と有益菌の増殖作用により、消化・吸収を助ける様々な微量元素及び生理活性物質が増加すると報告されている（Ｈｕｈ、ＳＨ ａｎｄ Ｋｉｍ、ＭＨ Ｔｈｅ ｍｏｄｅｒｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ、１９９７ Ｈｏｎｇｉｋｊｅａ ｐｒｅｓｓ．Ｋｏｒｅａ、ｐ．３５−３６）。

このような背景の下、本発明者らは、酵素食品として利用できる穀物発酵物を開発するために研究と努力を重ねた結果、澱粉および蛋白質分解能力に優れた菌株をスクリーニングし、これを利用して穀物発酵物を製造し、これから様々な効果を確認することにより、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、新たなバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を提供することである。

本発明の他の目的は、（ａ）穀物に、本発明の菌株を接種するステップ；（ｂ）前記菌株を培養して、穀物発酵物を得るステップを備える、穀物発酵物の製造方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、本発明の菌株を含む穀物発酵物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、本発明の菌株または穀物発酵物を含む血栓分解用；消化改善用；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用；または抗酸化用組成物、および本発明の菌株または穀物発酵物を含む食品組成物（例えば、酵素食品組成物）を提供することである。

前記目的を達成するため本発明の一様態では、バチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株（ＫＣＴＣ １２９０５ＢＰ）を提供する。

具体的に、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株は強力な活性の澱粉及びタンパク分解酵素を生産し、高分子の炭水化物及びタンパク質を加水分解して低分子化することにより、微生物が利用しやすい糖類に分解して微生物の作用を助けることだけでではなく、低分子化されたペプチドを提供して消化・吸収率を大幅に高める。また、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株は、穀物の主要構成成分である炭水化物を利用して活発に生育しながら菌体を構成するタンパク質に転換させるため、酵素食品内の粗たんぱくの含量が相対的に増加する。ＢＡ２４５菌株を用いた発酵により食物繊維の含量も増加するが、食物繊維は排便を助け、腸内有益菌の重要な栄養素として有益菌の数を増加させ健康な腸内環境の造成を助ける。

本発明のバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株は、伝統的発酵食品から由来した菌株の中で、澱粉及びタンパク分解酵素生成能が最も優秀な菌株を選別したものであり、酵母から分離した菌株である。

選別したＢＡ２４５を同定するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を塩基配列分析した結果、ＢＡ２４５菌株は配列番号１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を有することを確認した。前記配列を用いて公知菌株との配列相同性の比較及び系統分類学的類縁関係を分析した結果、ＢＡ２４５菌株はバチルス・アミロリケファシエンスと９９．９％の類似性を示し（図２）、ｇｙｒａｓｅ Ａ遺伝子の塩基配列比較においてもバチルス・アミロリケファシエンスと最も類縁関係が高いことが判明した（図３を参照）。

本発明のＢＡ２４５菌株をバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５と命名し、ブダペスト条約に基づいて、２０１５年９月２３日に、韓国生命工学研究院の微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＫＣＴＣ）に寄託し、寄託番号はＫＣＴＣ１２９０５ＢＰである。

本発明の他の一様態では、下記のステップを備える穀物発酵物の製造方法を提供する：（ａ）穀物に寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰのバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を接種するステップ；及び、（ｂ）前記菌株を培養して穀物発酵物を得るステップ。

以下、本発明の製造方法をステップごとに詳しく説明する。

ステップ（ａ）：穀物の菌株を接種するステップ
本発明のステップ（ａ）で利用できる穀物は、小麦、小麦胚芽、ふすま、白米、玄米、発芽玄米、大麦、オート麦、赤米、黒もち米、もち米、米ぬか、大豆、鼠目太、黒豆、キヌア、レンズ豆及びハトムギからなる群より選択された一つ以上の穀物を含む。前記穀物は粉砕された形態、粉末形態、または粉砕過程なしでそのまま使用することもできる。

具体的に、前記のステップ（ａ）の穀物は、小麦胚芽及びふすまを含む。この場合、小麦胚芽及びふすまは穀物１００重量部に対して４０重量部〜１００重量部、５０重量部〜１００重量部、５０重量部〜９０重量部、５０重量部〜８０重量部または６０重量部〜８０重量部で含まれる。

より具体的に、前記のステップ（ａ）における穀物は、小麦胚芽及びふすまに、オート麦、レンズ豆、玄米、もち大麦及びキヌアで構成された群より選択される一つ以上の穀物をさらに含むことができる。各々の含量範囲は、穀物１００重量部に対して１重量部〜２０重量部、具体的には３重量部〜１０重量部の範囲である。また、前記ステップ（ａ）の穀物は３０％（ｖ／ｗ）〜７０％（ｖ／ｗ）の水分含量を有する穀物である。具体的には、前記水分含量は、３０％（ｖ／ｗ）〜６０％（ｖ／ｗ）、３０％（ｖ／ｗ）〜５０％（ｖ／ｗ）、または３０％（ｖ／ｗ）〜４０％（ｖ／ｗ）である。水分含量が３０％よりも低い場合には低水分によってバチルス菌の発酵速度が遅くなり、特に発酵中に蒸発される水分によって最終発酵後においてバチルス菌が生育しにくい水分含量である２０％程度に達するため良くない。水分含量が７０％よりも高い場合には乾燥工程で多くに費用がかかる問題が発生する恐れがある。

具体的には、前記水分含量は、穀物自体の水分含量であるか、予め水分を含有させる前処理がなされた穀物であるか、または前記（ａ）の穀物に水分をさらに処理した後の水分含量である（すなわち、前記ステップ（ａ）の穀物が水分処理された穀物であり得る）。前記水分処理は穀物に適量の水を直接噴霧または混合して実施することができる。

また、本発明における穀物発酵物の製造方法は、ステップ（ａ）の前で穀物に熱処理するステップをさらに備えることができる。熱処理ステップがなくても穀物で菌株培養が可能であるが、熱処理によって穀物中の雑菌を死滅させるとともに、穀物の細胞壁の破壊と糊化 およびタンパク質を変性させることにより、微生物が活発に生育できる環境を提供することができるため、菌株接種量を下げて費用を低減することができる。前記熱処理は、当業界に公知された様々な方法を利用することができ、例えば、スチーム（ｓｔｅａｍ）または過熱水蒸気（ｓｕｐｅｒｈｅａｔｅｄ ｓｔｅａｍ）を用いて実施することができる。具体的には、７０℃〜１４０℃のスチームで１０分〜６０分間の蒸煮処理、２００℃〜３００℃の過熱水蒸気で数秒ないし数分の短時間の熱処理などがある。より具体的に、７０℃〜１３０℃のスチームで２０分〜６０分間の蒸煮処理、または、８０℃〜１２５℃のスチームで２０分〜４５分間の蒸煮処理ができる。熱処理温度が低い場合や処理時間が短い場合には、雑菌の殺菌効果が低下して以降の発酵工程が円滑に行われない恐れがあり、熱処理温度が高い場合や処理時間が長くなる場合には穀物内のタンパク質の変性による発酵効率の低下で最終製品の品質が低下する恐れがある。

また、本発明の穀物発酵物の製造方法は、ステップ（ａ）の前に、穀物に水分処理した後に熱処理するステップをさらに備えることができる。水分処理と熱処理は、前述したとおりである。

続いて、前記穀物に寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰのバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を接種する。

前記接種の前に、任意に熱処理された穀物を冷却するステップをさらに備えることができる。冷却は、熱処理が終了した後、自然的に、または冷却速度を高めて過熱防止と均一冷却することができる（例えば、コンベア（ｃｏｎｖｅｙｏｒ）式の放冷機を利用）。具体的に、冷却温度は、３０℃〜５０℃、３５℃〜４５℃であり、または３５℃〜４０℃に冷却する。

穀物にバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株の接種は、前記菌株を培養した前培養液をそのまま使用するか、分離された菌株を使用するか、または凍結乾燥などの形態で粉末化された菌株またはその培養物を使用することができる。ＢＡ２４５菌株の接種量は、接種直後の菌数が１×１０^５ＣＦＵ／ｇ〜１×１０^１０ＣＦＵ／ｇ、または１×１０^６ＣＦＵ／ｇ〜１×１０^９ＣＦＵ／ｇである。接種量が１×１０^５ＣＦＵ／ｇ未満の場合には、種菌発酵液の所要量が少ないが穀物の発酵に多くの時間がかかるため製品の生産に必要な発酵時間が長くなって雑菌が汚染される可能性が高いという短所がある。一方、接種量が１×１０^１０ＣＦＵ／ｇを超過する場合には、発酵時間は大幅に短縮されるが、接種用種菌の生産原価が負担になる短所がある。

ステップ（ｂ）：菌株を培養して穀物発酵物を得るステップ
ステップ（ａ）を実施した後、本発明の菌株を穀物と共に培養して穀物発酵物を得ることができる。下記の実施例で示すように、本発明のアミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を穀物に培養することで前記菌株の優秀な澱粉分解酵素活性とタンパク分解酵素活性によって、得られた穀物発酵物内のタンパク質を低分子化して消化吸収率を高めることと食物繊維などの様々な有用成分を含有させて血栓分解作用；消化改善作用；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療作用；または抗酸化作用などの有利な活性を持たせることができる。

前記培養は、液体培養または固体培養であり、具体的に固体培養である。培養温度は２０℃〜５０℃、３０℃〜４５℃または３７℃であり、培養時間は１〜４８時間、６〜４８時間、６〜３６時間、１２〜３６時間、１２〜３０時間、１８〜３０時間、２２〜２６時間、または２４時間である。

培養方法は特に限定されないが、例えば、液状培養タンク、回転ドラム式発酵槽（ｒｏｔａｒｙ ｄｒｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）またはトレイ発酵槽（ｔｒａｙ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）を用いて培養する。前記回転ドラム式またはトレイ発酵槽の外にも、穀物またはその混合物の発酵に有用なものであれば、その形態に関係なく本発明の方法で使用することができ、生産規模に応じて適切な装置を選択して使用する。

本発明の製造方法は、ステップ（ｂ）で得られた穀物発酵物を乾燥および／または粉砕するステップをさらに備えることができる。前記乾燥および／または粉砕は当業界に公知された様々な方法で実施することができるが、過度に高温で乾燥した場合には穀物発酵物の中の生菌が死滅することや酵素活性が減少する恐れがあるので注意する必要がある。具体的に、本発明の菌株が死滅しなく酵素活性を維持する低温で乾燥し、低温、例えば４０℃〜７５℃、または５０℃〜７０℃で、低湿度の熱風で穀物発酵物中の水分含量が２０％以下、または１０％以下になるように乾燥する。粉砕工程は、穀物発酵物を利用する目的に応じて様々な大きさに粉砕し、粉砕方法は、例えば、ハンマーミル（ｈａｍｍｅｒ ｍｉｌｌ）などを利用することができる。

本発明の他の一様態では、寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰのバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を含む穀物発酵物を提供する。

具体的に、前記アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株はその培養物またはその破砕物などを含む。前記ＢＡ２４５菌株は、上述した通りである。

また、本発明の穀物発酵物は、以下をさらに含むことができる：（ａ）５０〜６０重量％の炭水化物；（ｂ）２０〜３０重量％の粗タンパク質；（ｃ）５０〜２００ｍｇ／１００ｇのリシン；（ｄ）１５〜１５０ｍｇ／１００ｇのイソロイシン；（ｅ）１００〜３００ｍｇ／１００ｇのロイシン；（ｆ）１０〜７０ｍｇ／１００ｇのメチオニン；（ｇ）１００〜３００ｍｇ／１００ｇのフェニルアラニン；（ｈ）５０〜１００ｍｇ／１００ｇのトリプトファン；及び、（ｉ）５０〜３００ｍｇ／１００ｇのバリン。具体的には、本発明の穀物発酵物は、下記の成分をさらに含むことができる：（ｊ）２５〜３０重量％の食物繊維；及び（ｋ）３〜８０ｍｇ／１００ｇのスレオニン。より具体的に、穀物発酵物中の炭水化物は５３〜６０重量％、食物繊維は２６〜２９重量％、粗タンパク質は２１〜２５重量％である。必須アミノ酸であるスレオニンは４０〜７０ｍｇ／１００ｇ、または４０〜６０ｍｇ／１００ｇ；リシンは７０〜１５０ｍｇ／１００ｇ、または１００〜１５０ｍｇ／１００ｇ；イソロイシンは７０〜１２０ｍｇ／１００ｇ、または８０〜１１０ｍｇ／１００ｇ；ロイシンは１５０〜２５０ｍｇ／１００ｇ、または１７０〜２４０ｍｇ／１００ｇ；メチオニンは３０〜６０ｍｇ／１００ｇ、または４０〜５０ｍｇ／１００ｇ；フェニルアラニンは１５０〜２５０ｍｇ／１００ｇ、または１７０〜２４０ｍｇ／１００ｇ；トリプトファンは６０〜９０ ｍｇ／１００ｇ、または６５〜８５ｍｇ／１００ｇ；バリンは１５０〜２５０ｍｇ／１００ｇ、または１７０〜２４０ｍｇ／１００ｇで含まれる。

前記穀物発酵物は、５Ｍｗ（ｋＤａ）以下のペプチド含量が粗タンパク質１００重量部に対して５０〜８０重量部であり、３０Ｍｗ（ｋＤａ）以上のペプチドの含量が５〜２０重量部である。具体的に、前記５Ｍｗ（ｋＤａ）以下のペプチド含量は粗タンパク質１００重量部に対して５５〜７０重量部であり、３０Ｍｗ（ｋＤａ）以上のペプチドの含量が５〜１５重量部である。

また、前記穀物発酵物は、α−アミラーゼ活性が２０００〜４０００Ｕ／ｇ、２０００〜４０００Ｕ／ｇ、２３００〜３５００Ｕ／ｇ、２５００〜３５００Ｕ／ｇまたは２５００〜３０００Ｕ／ｇである。

また、前記穀物発酵物は、プロテアーゼ活性が２０００〜４０００Ｕ／ｇ、２５００〜４０００Ｕ／ｇ、３０００〜４０００Ｕ／ｇ、３５００〜４０００Ｕ／ｇまたは３７００〜４０００Ｕ／ｇである。

本発明の穀物発酵物は、前述した本発明の一態様である穀物発酵物の製造方法によって製造されたものである。

本発明の他の一様態では、前述した本発明の菌株または穀物発酵物を含む食品組成物が提供される。前記食品組成物は、飲用できる食品であれば特に限定されない。

具体的には、前記食品組成物は酵素食品である。本発明において「酵素食品」という用語は、酵素の機能を強化させるため食用原料に食用微生物を培養して酵素を多量に含有させたもの、食品の酵素含有部分を抽出したもの、またはこれらを加工したものを意味する。

本発明の食品組成物には健康食品組成物も含まれる。本発明の菌株または穀物発酵物を食品または健康食品組成物に利用する場合には、本発明の菌株または穀物発酵物をそのまま添加することと、他の食品または食品成分と同時に使用することができ、通常の方法で適切に使用することもできる。本発明の菌株または穀物発酵物の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適切に決定する。前記食品組成物は、食用可能な組成物であれば制限なく含まれる。食品組成物には、肉類、ソーセージ、パン、ケーキ、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類（クッキー、クラッカーなど）、ピザ、麺類（ラーメンなど）、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、様々なスープ、ケチャップ、ソース、グレービー（ｇｒａｖｉｅｓ）、ドレッシング、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、および複合ビタミン剤などがある。

本発明の食品または健康食品組成物には、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などが追加成分として含まれる。前記天然炭水化物は、ブドウ糖とフルクトースなどのモノサッカライド、マルトース、およびスクロースなどのジサッカライド、デキストリンおよびシクロデキストリンなどのポリサッカライド、並びにキシリトール、ソルビトール、およびエリスリトールなどの糖アルコールがある。甘味料としてはソーマチン、ステビア抽出物などの天然甘味料、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の食品または健康食品組成物１００ml当たり、一般的に約０．０１〜０．２０ｇ、具体的には、約０．０４〜０．１０ｇである。

前記成分の他に、本発明の食品または健康食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸とその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭化剤などを含有することができる。その他、本発明の食品または健康食品組成物は、天然果実ジュース、果実ジュース飲料、野菜飲料を製造に用いる果肉を含有することができる。前記成分は、独立的に、または組み合わせて用いることができる。前記添加剤の比率は、本発明の食品または健康食品組成物１００重量部当たり、０．０１〜０．２０重量部の範囲で選択される。

本発明の他の一様態では、バチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株またはこれを含む穀物発酵物が含有された、血栓分解用；消化改善用；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用；または抗酸化用組成物が提供される。

本発明における「予防」という用語は、目的とする疾患の発症を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。本発明における「改善」という用語は、発生した疾病の症状及び副作用を軽減または緩和させる全ての行為を意味する。本発明における「治療」という用語は、発生した疾病の症状及び副作用を改善、好転又は有利に変更する全ての行為を意味する。

下記実施例で示したように、本発明の菌株または穀物発酵物は、具体的にはフィブリンの分解活性を有し（実施例８）；固形分の胃排出能を改善させ（実施例９）；急性腸炎の動物モデルで胃透過性を改善させ（実施例１０）、腸膜を強化し（実施例１１）、腸組織の損傷を治療し（実施例１２）；抗酸化活性が高いことを確認した（実施例１３）。したがって、本発明の菌株または穀物発酵物が血栓分解；消化改善；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療；及び抗酸化活性があることを確認したので、血栓分解用；消化改善用；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用；または抗酸化用の医薬品および食品（または健康機能食品）に使用できることが分かる。

具体的に、前記血栓分解用組成物は、血栓の分解作用によって心筋梗塞、脈血栓症、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、または脳塞栓症の予防または治療に効果的である。

本発明の組成物は目的とする方法に応じて、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所適用）が可能であり、具体的に経口投与することができる。

本発明の組成物が薬剤学的組成物として使用される場合、投与のために本発明の菌株または穀物発酵物に加えて、更に薬剤学的に許容可能な担体を一つ以上含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうちいずれか一つ以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑油を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該分野の適切な方法、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２２ｎｄ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示された方法を用いて、各疾患または成分に応じて製剤化することができる。

本発明の薬剤学的組成物は、独立的に、または手術、ホルモン療法、薬物療法、および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。

本発明の他の一様態は、投与が必要な被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）にバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株又は前記菌株を用いて製造された穀物発酵物及び薬剤学的にまたは食品学的に許容可能な担体を含む組成物を投与することを備える、血栓に起因する疾患の治療、改善または予防；消化機能の改善；腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療；または活性酸素を減少する方法を提供する。本発明における投与は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じて、さまざまな投与量で本発明の組成物を投与して実施する。本発明の穀物発酵物は、毎日の投与量が約０．０００１〜６００mg／kg、または約０．００１〜５００mg／kgであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することができる。また、本発明の菌株は、５×１０^４〜５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、または１×１０^６〜１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌの量で、一回当たり３０ｍｌ〜１００ｍｌまたは５０ｍｌ〜１００ｍｌ、１日１回ないし４回投与する。

（ａ）本発明は、澱粉分解酵素活性及びタンパク分解酵素活性が優秀である新たなバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＡ２４５菌株（ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰ）、前記菌株を利用して穀物発酵物を製造する方法、前記菌株を含む穀物発酵物、及び前記菌株又は前記穀物発酵物を含む様々な機能性組成物を提供する。

（ｂ）前記菌株を種菌で用いて穀物発酵物を製造した場合、前記穀物発酵物は炭水化物及びタンパク質の加水分解による低分子化と粗タンパク含量の増加、食物繊維と必須遊離アミノ酸の増加などによって、血栓による疾患の治療または予防、消化改善、腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療、または抗酸化作用に効果的である。

（ｃ）よって、穀物発酵物を用いて、栄養素の摂取、血栓溶解、消化改善、腸健康と抗酸化に効果がある高品質の医薬品及び食品（または健康食品）を提供する。

澱粉分解酵素及びタンパク分解酵素を同時に高生産する菌株を選別するためのα−アミラーゼ平板培地（図１ａ）とプロテアーゼ平板培地（図１ｂ）の選別結果である。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいた系統分類学的類縁関係を示す系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ ｔｒｅｅ）である。 バチルス属内菌株の系統分類に適したｇｙｒａｓｅ Ａ遺伝子の塩基配列を基にした系統分類学的類縁関係を示す系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ ｔｒｅｅ）である。 ＢＡ２４５発酵物の低分子ペプチドの含量を、原料及び同種の菌株であるＢＡ４７４と比較して分析したクロマトグラフィーの結果である。 血栓分解活性を示したフィブリンプレート分析結果である。 フィブリン分解活性を示す棒グラフである。 ＢＡ２４５発酵物の各含量別の腸透過性評価の結果である。 腸膜の強化程度を確認するために、腸細胞の密着結合タンパク質であるクローディンの発現程度を示した結果である。 腸膜の強化程度を確認するために、腸細胞の密着結合タンパク質であるオクルディンの発現程度を示した結果である。 ＢＡ２４５発酵物の摂取による腸上皮損傷の回復程度を腸の組織学的観察によって確認した写真である。 穀物原料、ＢＡ２４５発酵物及び酵素食品において各々の抗酸化活性（ラジカル除去能）の評価結果である。

以下、実施例を用いて本発明をもっと詳しく説明する。下記の実施例は本発明をより具体的に説明するだけであり、本発明の要旨と本発明の範囲が下記の実施例により限定されないことは本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者において自明である。

実施例１：澱粉及びタンパク分解酵素を高生産する菌株の選別
本発明者らは、澱粉及びタンパク分解酵素の生成能力が優秀な菌株を分離するために、様々な伝統発酵食品（キムチ、味噌類、酵母、伝統地酒及び塩辛など）から約３０００千種の微生物を分離し、これらのうち約１３０８種の食品適合性バチルス菌を中心に、澱粉及びタンパク分解酵素の発現が高い菌株を探した。

澱粉及びタンパク分解酵素の高生産菌株の選別は、各々１％（ｗ／ｖ）の可溶性澱粉（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）または２％（ｗ／ｖ）脱脂乳（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）が含有されたＹＭ寒天培地（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３．０ｇ、ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３．０ｇ、ｐｅｐｔｏｎｅ ５．０ｇ、ｄｅｘｔｒｏｓｅ １０．０ｇ、ａｇａｒ ２０．０ｇ）で基質が分解されて生じる透明環のサイズを比較して選別した。

具体的に、菌株をそれぞれＴＳＢ培地（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ １７．０ｇ、ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ３．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇ、ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ２．５ｇ、ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２．５ｇ、ｆｉｎａｌ ｐＨ：７．３±０．２ ａｔ ２５℃）に接種した後、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養し、培養液を可溶性澱粉及び脱脂乳含有ＹＭ寒天培地に１．０μｌずつ点滴（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した。前記寒天培地を３７℃で１６時間培養した後、培地上に形成された透明環の直径を測定した。

その結果、１％（ｗ／ｖ）の可溶性澱粉培地の透明環の直径が５．８５ｍｍであり、２％（ｗ／ｖ）脱脂乳（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）培地の透明環の直径が６．１４ｍｍであり、澱粉及びタンパク分解酵素活性の両方に優秀であるＢＡ２４５菌株を穀物発酵用の菌株として選別した（図１ａおよび１ｂ）。

実施例２：ＢＡ２４５菌株の同定
２−１．ＢＡ２４５菌株における１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列分析
実施例１で選別されたＢＡ２４５菌株を同定するため、１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を韓国種菌協会付設の韓国微生物保存センターに依頼し、同定に重要な５０〜９００ｂｐの塩基配列を含む１４２０ｂｐ（配列番号１）の塩基配列を得た。また、この塩基配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋでＫＲ５３５６０４のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒを付与されてＤＢに登録された。

２−２．ＢＡ２４５菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対する塩基配列分析による系統樹解析
ＢＡ２４５菌株の系統分類学的位置を分析するため、ＧｅｎＢａｎｋに登録された塩基配列データを利用して、バチルス属内のＢＡ２４５菌株と近く位置する多種の標準菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を調査し、これらの塩基配列をＢｉｏｅｄｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈａｌｌ、１９９９）とＣｌｕｓｔａｌ Ｘ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７）を利用してアライメントした。菌株の進化過程を追跡する作業は、Ｋｉｍｕｒａ ｔｗｏ−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌ（Ｋｉｍｕｒａ、１９８３）を利用し、ＭＥＧＡ ３ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、２００４）のｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ及びｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ方法で系統分類学的位置を決定した（図２）。

２−３．ＢＡ２４５菌株のｇｙｒａｓｅＡ（ｇｙｒＡ）遺伝子の塩基配列による系統樹解析
ｇｙｒａｓｅ Ａ遺伝子の塩基配列に基づいた系統分類学的分析を利用して、ＢＡ２４５菌株を同定した。

ｇｙｒａｓｅ Ａ遺伝子の塩基配列を分析するため前方プライマー（配列番号２：５’−ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＣＴＴ−３’）と逆方向プライマー（配列番号３：５’−ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＣＴ−３’）を作製した後、塩基配列解析を（株）マクロジェンに依頼した。ＢＡ２４５菌株と近く位置する多種の標準菌株のｇｙｒａｓｅ Ａ遺伝子の塩基配列を調査し、これらの塩基配列をＢｉｏｅｄｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈａｌｌ、１９９９）とＣｌｕｓｔａｌ Ｘ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７）を利用してアライメントした。菌株の進化過程を追跡する作業は、Ｋｉｍｕｒａ ｔｗｏ−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌ（Ｋｉｍｕｒａ、１９８３）を利用し、ＭＥＧＡ ３ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、２００４）のｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇとｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ方法で系統分類学的位置を決定した（図３）。

２−４．ＡＰＩ ｋｉｔを用いたＢＡ２４５の生化学的特性の分析
バチルスの同定に使用されるＡＰＩ ５０ＣＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｃｏ．、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、バチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株の生化学的特性を調査した。ＡＰＩ ｋｉｔは製造会社の使用指示に従って次のように実施し、その結果を下表１に示した。

バチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株をＴＳＢ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ １７．０ｇ、ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ３．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇ、ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ２．５ｇ、ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２．５ｇ、ｆｉｎａｌ ｐＨ：７．３±０．２ ａｔ ２５℃）液体培地に接種して３７℃で培養した後、チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に分注した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を回収して、滅菌生理食塩水（０．８５％）で１回洗浄した。細胞は滅菌蒸留水で懸濁して無菌的に破ったＡＰＩ ５０ＣＨ培地のアンプルに接種しピペッティングして均等に混ぜた後、各テストストリップのマイクロチューブに１５０μｌずつ分注した。分注を終えた後にＡＰＩ ｋｉｔは、３７℃のインキュベーターで２４〜４８時間培養しながら、色変化を観察した。

２−５．同定結果
前記生化学特性と系統分類学的類縁関係の分析結果をまとめた結果、前記選別されたＢＡ２４５菌株をバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に同定してバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５と命名し、ブダペスト条約に基づいて２０１５年９月２３日に韓国生命工学研究院微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＫＣＴＣ）に寄託し、寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰを付与された。

実施例３：ＢＡ２４５菌株を用いた穀物発酵物の製造
実施例２で選別したバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株（以下、「ＢＡ２４５菌株」と記載）を利用して、下記の穀物発酵物を製造した。

まず、穀物３００ｇ［ふすま；小麦胚芽；麦；玄米；キヌア；レンズ豆；もち大麦；小麦胚芽及びふすまの混合穀物（小麦胚芽６０重量％及びふすま４０重量％）；と全穀物の混合物（小麦胚芽４０重量％、ふすま３０重量％、オート麦１０重量％、レンズ豆大豆５重量％、玄米５重量％、もち大麦５重量％、キヌア５重量％、以下全穀物の混合物は「穀物原料」と記載）をそれぞれ３００ｇ］に水分を添加した後、１２１℃で３０分間蒸煮し、４０℃以下に冷却した。その後、前記ＢＡ２４５菌株をそれぞれＴＳＢ寒天培地（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ １７．０ｇ、ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ３．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇ、ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ２．５ｇ、ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２．５ｇ、ａｇａｒ １５．０ｇ、ｆｉｎａｌ ｐＨ：７．３±０．２ ａｔ ２５℃）に塗抹し、３７℃で１２時間培養して菌株を活性化させた。活性化された菌株を０．８％ＮａＣｌ滅菌溶液９mlに約２白金（Ａ_{６６０ｎｍ}で０．２程度に希釈）を懸濁させ、この懸濁液を種菌として用いた。本培養は、予め用意した４０mlのＴＳＢ培地（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ １７．０ｇ、ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ３．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇ、ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ２．５ｇ、ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２．５ｇ、ｆｉｎａｌ ｐＨ：７．３±０．２ ａｔ ２５℃）に種菌懸濁液を１％接種した後、３７℃、１８０ｒｐｍで振とう培養した。

水分含量を３６％に調整して蒸煮された穀物に、培養液３０ml（６．０×１０^７ｃｆｕ／ml）を入れてよく混合した後、３７℃で２４時間恒湿が維持される条件で静置培養する固体発酵法により穀物発酵物を製造した。

また、ＢＡ２４５菌株の対照群として、ＢＡ２４５菌株と同種に該当する菌株のバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ４７４（以下、「ＢＡ４７４菌株」と記載）を利用し、前記ＢＡ４７４菌株を用いて発酵した穀物発酵物は全穀物混合物を原料として、ＢＡ２４５菌株の代わりＢＡ４７４菌株を用いたこと以外は、実施例３と同様に行って製造した。

実施例４：澱粉分解酵素活性の分析
穀物発酵物の澱粉分解酵素の活性を分析するために、下記の実験を行った。

実施例３のＢＡ２４５菌株とＢＡ２４５菌株それぞれを利用して発酵した穀物発酵物をそれぞれ６０℃の乾燥機で水分含量が１０％以下になるまで乾燥した後、粉砕して澱粉分解酵素活性の測定の検体《以下、各穀物発酵物を発酵に用いた菌株によって「ＢＡ２４５発酵物」および「ＢＡ４７４発酵物」と記載し、全穀物混合物（小麦胚芽４０重量％、ふすま３０重量％、オート麦１０重量％、レンズ豆大豆５重量％、玄米５重量％、もち大麦５重量％、キヌア５重量％）を原料として使用した場合のみを原料の記載がない「ＢＡ２４５発酵物」と記載し、これ以外の各々の穀物または小麦胚芽及びふすまの混合穀物を原料と使用した場合には「ＢＡ２４５発酵物」の後段の括弧内に発酵に使用した原料を表示して記載》で用いた。澱粉分解酵素活性は、韓国食品公典「食品の基準及び規格」内の酵素食品α−アミラーゼ試験法に基づいて測定した。

具体的に、各々の検体５．０ｇを精密に量り、水に溶解させて１００ｍｌとした後、ろ過して検液とし、２０ｍｌ試験管２本を用意して、それぞれ試験用と空試験用の試験管で使用した。試験用の試験管には１％の可溶性澱粉溶液５ｍｌ、マッキルベイン緩衝液（ｐＨ ６．０）１３ｍｌと０．１％塩化カルシウム溶液１ｍｌを入れ３７℃に加温し、検液１ｍｌを入れた後に３７℃で３０分間放置して試験用反応液を製造した。これと別に、１００℃で３０分間加熱して活性を失った検液１ｍｌを試験用と同様に操作して空試験用反応液を製造した。前記試験用と空試験用反応液０．２ｍｌにヨウ素試液１０ｍｌを入れたものを試験溶液とし、水を対照液として、液層１ｃｍの波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。この時、試験溶液の吸光度は空試験の吸光度よりも０．０３０以上低い必要がある。発色の程度が過度であって測定が困難な場合には、検液を希釈して試験し、希釈倍数を適用した。澱粉含量は、前記と同じヨウ素（Ｉ２）溶液の呈色による標準曲線で算出し、α−アミラーゼ１Ｕｎｉｔは３０分間、１０ｍｇの澱粉を消化する酵素の量で定義した。

その結果、表２に示すように、対照群のＢＡ４７４発酵物に比べてＢＡ２４５発酵物及びＢＡ２４５発酵物（小麦胚芽及びふすま混合穀物）の澱粉分解酵素の活性が非常に優秀であることを確認した。

実施例５：タンパク分解酵素活性の分析
ＢＡ２５４発酵物のタンパク分解酵素活性を比較するために、下記の実験を行った。

実施例３の検体を得た後、「食品の基準及び規格」内の酵素食品プロテアーゼ試験法に基づいて測定した。

検体約５ｇを精密に量り、水に溶解させて１００ｍｌとした後、ろ過して検液とした。０．６％カゼイン溶液１ｍｌを試験管に入れて３７℃の恒温水浴中で加温した後、ここに検液１ｍｌを正確に入れてよく振り混ぜた後、すぐ３７℃の恒温水浴中に入れてちょうど１０分間反応させた後、ここに０．４Ｍ三塩化酢酸液２ｍｌを入れて再び３７℃で２５分間放置した後でろ過した。ろ過液１ｍｌを試験管に取り、０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌとフォリン試液（原液を３倍希釈した液）１ｍｌを入れてよく振り混ぜた。３７℃で２０分間放置した後、発色した液を試験溶液とした。これと別に、検液１ｍｌを取り試験管に入れて３７℃で１０分間放置した後、０．４Ｍ三塩化酢酸液２ｍｌを入れ混和し、０．６％カゼイン溶液１ｍｌを入れて３７℃で２５分間放置した後の試験溶液と同様に操作して空試験溶液とした。水を対照液として、液層１ｃｍの波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。この時、試験溶液の吸光度は空試験溶液の吸光度よりも０．０３０以上高い必要がある。発色の程度が過度であって測定が困難な場合は、検液を希釈して試験し、希釈倍数を適用した。標準曲線は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）を利用して作成し、プロテアーゼ活性は測定したチロシン含量を基準に比較分析し、プロテアーゼ１Ｕｎｉｔは１分間に生成されるチロシンのｕｇで定義した。

その結果、表３に示すように、対照群のＢＡ４７４発酵物に比べてＢＡ２４５発酵物のタンパク分解酵素の活性が非常に優秀であることを確認した。

前記実施例３と実施例４の結果から、発酵力価の高い穀物発酵物を含む酵素食品製造においてＢＡ２４５の有用な利用が可能であることを確認した。

実施例６：低分子量タンパク質含量の分析
実施例４のＢＡ２４５を利用して、穀物発酵時におけるタンパク分解酵素が優秀である穀物発酵物の製造ができることを確認したところ、穀物内のタンパク質が加水分解されたペプチドの形態で生成されるか、低分子量のタンパク質に分解されるかを確認するため、ＢＡ２４５発酵物の分子量範囲別タンパク質含量を分析した。

前記実施例３の検体０．１ｇを精密に量り、５ｍｌの８ＭのＵｒｅａで抽出した。８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液だけを取って０．２２μｍシリンジフィルターでろ過して分析試料とした。注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）ボリュームは２５ｕｌであり、５０ｍＭのＮａＰＯ_４（ｐＨ７．２）に１５０ｍＭのＮａＣｌを混合して移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）で用いた。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで、２１４ｎｍのＵＶ波長で検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）した。

その結果、ＢＡ２４５発酵物は、穀物原料及びＢＡ４７４発酵物に比べて、サイズの小さいタンパク質分子側のピーク面積が大きく、タンパク質の密度が中央バンドの方に偏っていることを確認した（図４）。図４のクロマトグラフィー上で左バンドが分子量の高いタンパク質であり、中央のバンドが分子量の低いタンパク質であり、右側のバンドは溶媒を表す。図４のクロマトグラフィーを数値化して比較した結果は下記の表４に示す。

前記結果から、ＢＡ２４５を利用した発酵により、穀物原料内の高分子量のタンパク質が低分子量のタンパク質に加水分解され、ＢＡ４７４に比べても加水分解の程度が著しく優秀であることを確認した。

実施例７：栄養成分の分析
ＢＡ２４５菌株を利用した穀物発酵時において、炭水化物の含量が減少と食物繊維の含量が増加、粗タンパク及び必須遊離アミノ酸の含量の増加により、栄養成分量及び栄養素吸収率が増加するかを確認するため、穀物原料、ＢＡ２４５発酵物、ＢＡ４７４発酵物及び市販の３社の穀物を発酵した酵素食品［発酵酵素は秘密、デサン（大象）ウェルライフ（以下、「デサン」と記載）；種子発酵酵素、ＬＧ生活健康（以下、「ＬＧ」と記載）；フルビタ−ネモメ穀類酵素ダイジェスト、オルガホールフード（以下、「プルムウォン」と記載）］に対して、韓国機能食品研究院に依頼して栄養成分を分析した。

その結果、表５および６に示すように、ＢＡ２４５を利用した穀物発酵物は、原料に比べて炭水化物及び糖含量が減少し、食物繊維、粗タンパク質および必須遊離アミノ酸が増加するなど、栄養成分の強化を確認した。ＢＡ２４５穀物発酵物及びＢＡ２４５穀物発酵物（小麦胚芽及びふすま混合穀物）は、ＢＡ４７４発酵物および他の酵素食品と比較した結果でも、栄養成分が優秀であることを確認した。

実施例８：フィブリン分解酵素（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）の活性分析
ＢＡ２４５発酵物の血栓分解活性を確認するために、穀物原料及びＢＡ２４５発酵物のフィブリン分解酵素の活性を測定した。対照群として、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ、１Ｕ／ｍｌ）および血栓溶解活性を有することが報告された清麹醤（テグァン社）、納豆（プルムウォン、あづま及びタカノ）と市販の酵素食品（デサン；ハイセン、（株）ハイモ自然健康事業部）を用いた。

試料１ｇを９ｍｌの滅菌生理食塩水に混合した後、攪拌機（Ｗｉｓｅｓｈａｋｅｒ、Ｄａｉｈａｎ）を用いて、４℃で３０分間混合しながら抽出し、遠心分離（８０００ｇ、４℃、３０分）した後、ろ過して上澄み液を分析試料として利用した。

８−１．フィブリンプレート分析（Ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ）
完全に溶解された２．４％フィブリン溶液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに、１．５％アガロース溶液１０ｍＬを添加して混合した後、すぐにペトリ皿に注いて、ゲルが完全に固まるまで室温で２〜３時間放置しフィブリンプレートを製造した。製造されたフィブリンプレートに直径４．５ｍｍの穴を一定にパンチングした後、分析試料２０μｌを各々の穴に滴加して３７℃で２４時間培養した。生成された透明環のサイズを鮮明に見ることができるように０．１１Ｍ三塩化酢酸をフィブリンゲルに注いだ。

その結果、ＢＡ２４５発酵物がプラスミンに比べて２２０％の血栓分解活性を示し、清麹醤に比べて１７７％、納豆に比べて各々１２２％（プルムウォン）、１１７％（タカノ）、１３１％（あづま）、酵素食品に比べては１１９％（デサン）及び１４２％（ハイセン）の血栓分解活性を示すことを確認した（表７および図５）。

８−２．フィブリン分解活性（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の分析
実施例８で製造された試料０．１ｍｌに１０ｍＭ塩化カルシウムを含有した０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）０．３ｍｌを入れて、３０℃の恒温水浴で５分間加温した。この溶液に１．２％フィブリン溶液（ｐＨ７．８）０．３ｍｌを添加して混合した後、３０℃で１０分間反応させた後、０．１１Ｍ三塩化酢酸液０．６ｍｌを入れ酵素反応を抑制させて試験溶液とした。これとは別に、試料０．１ｍｌに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）０．３ｍｌに入れ、３０℃の恒温水浴槽で１０分間反応させた後、０．１１Ｍ三塩化酢酸液０．６ｍｌを入れ混和し、１．２％フィブリン溶液（ｐＨ７．８）０．３ｍｌを入れて空試験溶液とした。試験溶液と空試験溶液は、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）後の上澄み液を回収し、２７５ｎｍにおける吸光度を測定して血栓分解酵素の活性を定量的に比較した。

その結果、ＢＡ２４５で発効発酵した穀物発酵物内のフィブリン分解活性が最も優秀であるとともに、納豆に比べても著しく高いことを確認した（表８及び図６）。

８−３．ＢＡ２４５菌株におけるフィブリン分解活性の分析
菌株自体のフィブリン分解活性を分析するためにＢＡ２４５菌株と市販納豆から分離した菌株３種を比較した。

その結果、表９で示すように、ＢＡ２４５菌株の血栓分解酵素活性が市販納豆から分離した菌株と比較して著しく優秀であることを確認した。

実施例９：ＢＡ２４５発酵物の給与による固形分の胃排出能（ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇ）改善の評価
８週齢の雄ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−ｄａｗｌｅｙ）ラットを各実験群別に１０匹ずつ配置し、すべての動物を１週間の実験食餌及び環境に適応させた。適応後、胃排出能を測定するために、水は自由に飲ませて放置しながら２０時間絶食させた。

実験例１は、同じ固形分を給与した条件で同一時間当たりの胃排出能を評価した。具体的には、実験当日ＳＤラットに硫酸バリウム５０％、アガロース０．６％、飼料（ＡＩＮ−９３、Ｄｙｅｔｓ）が水に懸濁された実験食餌３ｇを経口投与した。実験群は総３群であり、対照群には飼料１５％を給与し、実験群には穀物原料５％＋飼料１０％、ＢＡ２４５発酵物５％＋飼料１０％が配合された食餌を給与し、給与した固形分は同量であった。投与４０分後に胃を摘出して、胃内に残っている食餌の重量を測定して胃排出能（％）を評価した。

実験例２は、実際の人体の服用法を反映したモデルであり、同じ飼料量を供給してＢＡ２４５発酵物を追加給与したときにおける胃排出能の改善を評価し、この時、ヒト等価用量（ｈｕｍａｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓｅ）は、ラット基準の６倍を適用した。対照区には飼料１５％を給与し、実験群は穀物原料６００ｍｇ／ｋｇ、ＢＡ２４５発酵物６００ ｍｇ／ｋｇをそれぞれ追加給与した。実験例１と同様に投与４０分後に胃を摘出して胃内に残っている食餌の重量を測定して、胃排出能（％）を評価した。

その結果、実験例１でＢＡ２４５発酵物を投与し時に、飼料のみ給与群及び穀物原料給与群に比べて、有意な胃排出能の増加（ｐ＜０．０５）を確認し（表１０）、実験例２でも穀物原料給与群に比べ有意的な胃排出能の増加（ｐ＜０．０５）を確認した（表１１）。

胃排出能は、臨床的に機能性消化不良で低下する因子として知られているので、食餌と共にＢＡ２４５発酵物を摂取すれば消化能力が改善されると評価できる。

実施例１０：急性腸炎の動物モデルにおいて、ＢＡ２４５発酵物の摂取による腸透過性改善の評価
ラットにアルコールを投与して急性腸炎の動物モデルを作製し、摂取濃度の異なるＢＡ２４５発酵物を食餌させ、摂取量に応じた腸機能の回復程度を測定した。

動物は、８週齢、２００〜２５０ｇの体重のＳＤラットであり、ポリカーボネートケージで１２時間ごとに変わる明／暗サイクル下で飼育した。１週間の適応期間の後、自由食餌と共に実験デザインに従って処理した。

グループ１：対照群
グループ２：エタノール
グループ３：エタノール＋ＢＡ２４５発酵物５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ
グループ４：エタノール＋ＢＡ２４５発酵物１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ
グループ５：エタノール＋ＢＡ２４５発酵物１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ
グループ６：エタノール＋穀物原料１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ
グループ２ないし６は、４週間アルコールを経口投与して、過敏性腸症候群を誘導し、腸機能の低下を誘発した。初期投与量は２ｇ／ｋｇ／ｄａｙである。この時、経口投与するアルコールの量は、毎週１ｇ／ｋｇ／ｄａｙずつ増加して、最後の４週目には５ｇ／ｋｇ／ｄａｙを経口投与した。４週経過後の腸透過性を測定した。

具体的に、腸透過性の測定はラットを犠牲死させた後に分離した回腸をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔバイカーボネートバッファー（ＫＨＢＢ：ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に浸した後に腸の一端を縫合し、１００μｌのＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎをルーメン（ｌｕｍｅｎ）に注入した。腸の他端を縫合して８ｃｍの腸管（ｇｕｔ ｓａｃ）を形成した。ＫＨＢＢで洗浄した後、腸管を２ｍＬのＫＨＢＢに置いて、３７℃で２０分間インキュベーションした。ルーメンからインキュベーションバッファーに通過されたＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎのＦＤ−４は、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて５３０ｎｍで測定した。ＦＤ−４の透過性は、１分当たり１ｃｍにおけるμｇで表す。

その結果、ＢＡ２４５発酵物給与により、アルコール投与で増加された腸透過性の有意な減少を確認し、特に体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ以上投与した群では正常群に近い回復を確認した（図７）。

実施例１１：急性腸炎症の動物モデルを用いたＢＡ２４５発酵物摂取による腸膜強化の分析
腸膜が弱化して漿液が漏れ出るようになると漿液性炎（Ｓｅｒｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を誘発する。実施例１０で作製した動物モデルを利用し、アルコールのせいで増加された腸透過性の回復程度を定量的に測定するために、腸透過性に関与する腸細胞の密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分析を行った。腸膜の細胞結合に関与する主要な密着結合タンパク質には、代表的にＺＯ−１、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）、オクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ）があり、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析により各タンパク質に対応する遺伝子の発現程度を測定し、腸細胞間の結合程度を確認して、発酵物摂取の効果を確認した。ＲＮＡ抽出時のトリゾールを利用し、濃度はナノドロップ分光光度計（ｎａｎｏｄｒｏｐ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。

その結果、ＢＡ２４５発酵物投与および給与濃度に比例して、クローディンとオクルディンの発現が増加し、腸膜が強化されることを確認した（ｐ＜０．０５）（図８Ａおよび８Ｂ）。

実施例１２：腸の組織学的分析を用いて、ＢＡ２４５発酵物の摂取による構造損傷の緩和程度を評価
実施例１０で作製した動物モデルを利用し、腸の組織学的検査を行った。各グループからサンプリングした腸組織を１０％ホルマリン溶液に固定してエタノールで脱水を行った後、パラフィンで固定した。４μｍの厚肉断面（ｔｈｉｃｋ ｓｅｃｔｉｏｎ）にヘマトキシリン‐エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ）染色を行い、染色された各々の切片は顕微鏡で観察した。

アルコールによって腸損傷が進むと、腸壁の陰窩（ｃｒｙｐｔ）と絨毛（ｖｉｌｌｕｓ）の構造が崩れることを確認でき、ＢＡ２４５発酵物の摂取群、特に体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ以上の摂取群で正常組織に近く回復した様子を観察した（図９）。

実施例１３：ＢＡ２４５発酵物の抗酸化活性の測定
抗酸化活性は酸化ストレスによって発病される様々な疾病（脂質と酸化物の蓄積防止、酵素の不活性化、細胞老化、動脈硬化、糖尿病、脳卒中、癌、ＤＮＡ合成の減少、成人病及び老化など）を制御すると知られている。それで、穀物原料、ＢＡ２４５発酵物及び市販の酵素食品２種（デサンとハイセン）を比較した。

具体的に、試料：７０％エタノールを１：９の割合で混合した後、攪拌機（Ｗｉｓｅｓｈａｋｅｒ、Ｄａｉｈａｎ）を用いて３０℃で３時間混合しながら抽出した。該当混合物は、遠心分離（８０００ｇ、４℃、１０分）の後に上澄み液を各々回収し、同一過程を繰り返して抽出した後、最終的に回収した上澄み液をろ過した。ろ過された上澄み液は凍結乾燥機を使用して溶媒を完全に乾燥した後、乾燥物を分析試料として用いた。

試料１０ｍｇは７０％エタノール１ｍｌに完全に溶解させ試験液で使用した。ＡＢＴＳ溶液は３８．５ｍｇのＡＢＴＳと６．６ｍｇのペルオキソ二硫酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）をそれぞれ５ｍｌの蒸留水に溶解させて混合した後、暗室条件で１２〜１６時間反応させてラジカルを生成させた。その後、７３４ｎｍにおける吸光度を０．７±０．０２に調整しＡＢＴＳ溶液を製造した。

１０ul試験液に９９０ulのＡＢＴＳ溶液を入れて混合した後、暗室で１０分間反応させた後、７３４ｎｍにおける吸光度を測定した。すべての実験は３回以上繰り返してテストした後に平均値と標準偏差を求めた。

その結果、ＢＡ２４５発酵物の自由ラジカル除去能が４３．７％であり、穀物原料と市販の酵素食品に比べて著しく高いことを確認した（図１０）。これにより、ＢＡ２４５菌株を利用した発酵により、抗酸化活性が増加することと、従来の酵素食品２種に比べても抗酸化活性が優秀であることがわかった。

Claims (25)

1. 下記のステップを備える穀物発酵物の製造方法：
   （ａ）穀物に寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰのバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を接種するステップ；及び
   （ｂ）前記菌株を培養して穀物発酵物を得るステップ。
2. 前記ステップ（ａ）の穀物は、小麦、小麦胚芽、ふすま、白米、玄米、発芽玄米、大麦、オート麦、赤米、黒もち米、もち米、米ぬか、大豆、鼠目太、黒豆、キヌア、レンズ豆及びハトムギで構成された群より選択される一つ以上の穀物を含む、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
3. 前記ステップ（ａ）の穀物は、小麦胚芽及びふすまを含む、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
4. 前記小麦胚芽及びふすまは、ステップ（ａ）の穀物１００重量部に対して４０重量部〜１００重量部であることを特徴とする、請求項３に記載の穀物発酵物の製造方法。
5. 前記ステップ（ａ）の穀物は、オート麦、レンズ豆、玄米、もち大麦及びキヌアで構成された群より選択される一つ以上の穀物をさらに含む、請求項３に記載の穀物発酵物の製造方法。
6. 前記ステップ（ａ）の穀物の水分含量は３０％（ｖ／ｗ）〜７０％（ｖ／ｗ）であることを特徴とする、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
7. 前記ステップ（ａ）の前で、穀物に水分処理するステップをさらに備える、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
8. 前記ステップ（ａ）の前で、穀物に熱処理するステップをさらに備える、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
9. 前記ステップ（ａ）の前で、穀物に水分処理した後に熱処理するステップをさらに備える、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
10. 前記ステップ（ｂ）の培養は固体培養であることを特徴とする、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
11. 前記ステップ（ｂ）の培養温度は２０℃〜５０℃であることを特徴とする、請求項１に記載の穀物発酵物の製造方法。
12. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を含む穀物発酵物。
13. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株又は請求項１２に記載の穀物発酵物を含む食品組成物。
14. 前記食品組成物は、寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を含む酵素食品であることを特徴とする、請求項１３に記載の食品組成物。
15. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株を含む食品の酵素含有部分の抽出分を含む、酵素食品。
16. 請求項１４または１５に記載の酵素食品の加工品。
17. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株又は請求項１２に記載の穀物発酵物を含む血栓分解用組成物。
18. 請求項１７に記載の血栓分解用組成物は、心筋梗塞、脈血栓症、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、または脳塞栓症の予防、改善または治療用である、血栓分解用組成物。
19. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株又は請求項１２に記載の穀物発酵物を含む消化改善用の組成物。
20. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株又は請求項１２に記載の穀物発酵物を含む、腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用の組成物。
21. 寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＢＡ２４５菌株又は請求項１２に記載の穀物発酵物を含む、抗酸化用組成物。
22. 心筋梗塞、脈血栓症、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、または脳塞栓症を予防、改善または治療用組成物を製造するための寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＡ２４５菌株の使用。
23. 消化機能改善用組成物を製造するための寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＡ２４５菌株の使用。
24. 腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷予防、改善または治療用組成物を製造するための寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＡ２４５菌株の使用。
25. 活性酸素減少用組成物を製造するための寄託番号ＫＣＴＣ１２９０５ＢＰで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＡ２４５菌株の使用。

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