KR102155158B1

KR102155158B1 - 바실러스 아밀로리퀘페시언스 cjba1 및 그를 이용한 감마-폴리글루탐산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR102155158B1
Application number: KR1020190098349A
Authority: KR
Inventors: 장경훈; 최명현; 김비나; 이용직; 허수진; 홍영호; 강경일; 박민주; 서효정; 이승은
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2020-09-11
Also published as: KR20200019099A

Abstract

본 출원은 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1 및 그를 이용한 감마-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid: γ-PGA)을 생산하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1은 저분자량의 γ-PGA를 생산하는데 사용할 수 있고, 다른 양상에 따른 상기 균주를 이용한 γ-PGA를 생산하는 방법에 의하면, 저분자량의 γ-PGA를 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1 및 그를 이용한 감마-폴리글루탐산을 생산하는 방법{Bacillus amyloliquefaciens CJBA1 and method of producing gamma-polyglutamic acid using the same}

본 출원은 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1 및 그를 이용한 감마-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid: γ-PGA)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

감마-폴리글루탐산 (이하, 본 명세서에 있어서 "γ-PGA"라고도 한다)은 글루탐산의 γ 위치의 카르복실기와 α 위치의 아미노기가 펩티드 결합에 의해 결합된 고분자 화합물이다. γ-PGA는 납두균 (Bacillus subtilis var. natto)이 생산하는 점성 물질로서 알려져 있고, 여러 가지 성질로부터 최근 새로운 고분자 소재로서 주목받고 있다.

한국 등록 특허 10-0399091은 분자량 300만 달톤 이상의 초거대 분자량의 감마-폴리글루탐산을 생산하는 Bacillus subtilis 균주 및 그를 이용한 초거대 분자량의 감마-폴리글루탐산을 제조하는 방법을 개시한다.

그러나, 종래 기술에 의하더라도 저분자량의 감마-폴리글루탐산을 생산하는 Bacillus amyloliquefaciens 균주 및 그를 이용한 저분자량의 감마-폴리글루탐산을 생산하는 방법에 대한 요구가 있다.

본 출원의 목적은 수탁번호 KCCM 12259P로 기탁된, 저분자량의 감마-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid: γ-PGA)을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1을 배양하는 단계를 포함하는 γ-PGA를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 γ-PGA를 생산하는 방법에 의하여 생산된 평균 분자량 150 내지 350 kDa을 갖는 γ-PGA를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원의 하나의 양태는 수탁번호 KCCM 12259P로 기탁된, 저분자량의 γ-PGA를 생산하는 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1을 제공한다. 상기 균주는 글루탐산이 포함되어 있지 않은 배지에서 생육할 수 있는 글루탐산-비의존성 균주(glutamate independent strain)일 수 있다.

바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1은 저분자량의 γ-PGA, 구체적으로, 평균 분자량 150 내지 350 kDa, 200 내지 300 kDa, 200 내지 290 kDa, 200 내지 280 kDa, 200 내지 270 kDa, 또는 200 내지 250 kDa의 γ-PGA를 효율적으로 생산할 수 있다.

본 출원의 실시예를 참조하면, 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스가 생산하는 저분자량의 γ-PGA는 낮은 농도로 사용하더라도 면역력을 증가시키는 효과를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 저분자량의 γ-PGA는 고분자량의 γ-PGA에 비하여 항 바이러스 효과 또한 우수하다.

상기 저분자량의 γ-PGA는 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 발효에 의해 생산되는 것일 수 있다.

본 출원에서 용어 "발효(fermentation)"는 박테리아 또는 효모가 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물, 구체적으로는 글루코스 등을 분해시키는 과정을 의미한다. 상기 발효는 고체발효, 액체발효 등을 포함하며, 구체적으로는 고체발효일 수 있다.

본 출원에서 용어 "고체발효"는 수분이 적은 고체상태의 원료로 미생물에 의해 발효 생산을 하는 것을 의미한다. 고체발효는 낮은 수분 활력에 의해 오염균의 생장이 제한되므로 액체발효처럼 심각한 오염을 유발하지 않으며, 동일 균주를 이용하여 액체발효와 고체발효로 효소를 생산하는 경우 기질 친화성이 높은 고체발효에 의한 효소가 높은 활성을 나타낸다. 또한, 고체발효는 액체발효에 비하여 목적 산물의 추가적인 정제, 건조, 폐수 처리 등의 과정을 거치지 않아 효율적이고 친환경적인 방법으로 이용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 출원에서 상기 고체발효는 고체 배지에서 수행되는 발효를 의미하는 것일 수 있다. 상기 고체 배지는 배양 시작 시점에 수분 함량이 40 내지 60 (w/w)%, 40 내지 50 (w/w)%, 50 내지 60 (w/w)%, 또는 55 내지 60 (w/w)%인 것일 수 있다. 상기 고체 배지는 대두박을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 대두박은 전체 배지 중량에 대하여 10 내지 100%로 포함될 수 있다.

상기 발효는 30℃ 내지 45℃, 또는 30℃ 내지 40℃, 구체적으로는 34℃ 내지 39℃의 온도에서 수행될 수 있다.

상기 발효는 80 내지 100, 90 내지 100, 93 내지 97, 또는 95%의 습도에서 수행될 수 있다.

상기 발효는 5 내지 50시간, 5 내지 40시간, 5 내지 30시간, 10 내지 50시간, 10 내지 40시간, 10 내지 30시간 동안 수행될 수 있다.

상기 발효는 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양액을 원료 중량의 1 내지 30%(v/w), 5 내지 30%(v/w), 5 내지 20%(v/w), 5 내지 15%(v/w), 또는 10%(v/w)로 접종하여 수행될 수 있다.

상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1은 서열번호 1의 16s rRNA 전장 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.

상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1은 장류, 구체적으로는 된장 또는 메주로부터 분리된 것일 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1을 배양하는 단계를 포함하는 γ-PGA를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양은 액체 또는 고체 배지에서 수행되는 것일 수 있으며, 구체적으로 고체 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 고체 배지는 배양 시작 시점에 수분 함량이 40 내지 60 (w/w)%, 40 내지 50 (w/w)%, 50 내지 60 (w/w)%, 또는 55 내지 60 (w/w)%인 것일 수 있다. 상기 고체 배지는 대두박을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 대두박은 배지 중량에 대하여 10 내지 100%로 포함될 수 있다.

상기 방법은, 고체 배지를 준비하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 고체 배지를 준비하는 단계는, 보다 구체적으로, 대두박을 준비하는 단계 및 대두박의 수분 함량을 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 배양 시작 시점에 대두박 내 수분함량이 40 내지 60 (w/w)% 이 되도록 물을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 수분 함량을 조절하는 단계는, 미생물을 접종한 후 또는 접종하기 전에 수행될 수 있다.

상기 배지는 탄소원으로서 글리세린, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스, 수크로오스, 전분 등의 당류, 시트르산, 아세트산 등의 유기산 또는 그 염, 또는 일들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지는 글루탐산을 함유하지 않고 대두박 또는 대두분을 유일한 탄소원으로 하는 배지, 글리세린을 탄소원으로서 함유하는 배지, 글루탐산을 함유하지 않고 글리세린을 유일한 탄소원으로 하는 배지, 글리세린을 주된 탄소원으로 하고, 유기산, 글루탐산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 보조적인 탄소원으로 하는 배지일 수 있다. 여기서, "주된 탄소원" 및 "보조적인 탄소원"이란 배지 중의 각 탄소원의 함유량의 많고 적음을 나타내는 것이다.

상기 배지는, 필요에 따라, 각종 대두 단백 등의 천연물, 아미노산, 폴리펩톤, 트립톤, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄이나 우레아 등의 질소원 등을 함유시켜도 된다.

또한, 본 발명의 γ-PGA를 생산하는 방법에서 사용하는 배지에는, 나트륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 등의 무기염류 및 그 밖에 필요한 영양원, 미량 금속염 등을 함유시켜도 된다.

상기 배양은 30℃ 내지 45℃, 또는 30℃ 내지 40℃, 구체적으로는 34℃ 내지 39℃의 온도에서 수행될 수 있다.

상기 배양은 80 내지 100, 90 내지 100, 93 내지 97, 또는 95%의 습도에서 수행될 수 있다.

상기 배양은 5 내지 50시간, 5 내지 40시간, 5 내지 30시간, 10 내지 50시간, 10 내지 40시간, 10 내지 30시간 동안 수행될 수 있다.

상기 배양은 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양액을 원료 중량의 1 내지 30%(v/w), 5 내지 30%(v/w), 5 내지 20%(v/w), 5 내지 15%(v/w), 또는 10%(v/w)로 접종하여 수행될 수 있다.

상기 방법은 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1을 배양하는 단계에서 얻어진 배양물로부터 γ-PGA를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리하는 방법은 종래 알려진 방법에 의하여 분리될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 원심분리하여 상등액을 분리하고, 상등액으로부터 γ-PGA를 추출 또는 분리할 수 있다. 상등액으로부터 γ-PGA를 추출 또는 분리하는 방법에는, 다양한 유기 용매 또는 무기 용매가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 염산, 황산, 1가 알코올 등을 사용하여 γ-PGA를 추출 또는 분리할 수 있다. 예를 들면, 염산 또는 황산을 이용하여 γ-PGA를 침전시킨 후, 원심분리하여 γ-PGA를 회수할 수 있다. 상기 γ-PGA 추출 또는 분리 방법을 이용하여 고농도의 저분자량 γ-PGA가 제조될 수 있다.

상기 방법에 의해 생산되는 γ-PGA는 평균 분자량 150 내지 350 kDa, 200 내지 300 kDa, 200 내지 290 kDa, 200 내지 280 kDa, 200 내지 270 kDa, 또는 200 내지 250 kDa을 갖는 것일 수 있다. 본 출원의 실시예를 참조하면, 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스가 생산하는 저분자량의 γ-PGA는 낮은 농도로 사용하더라도 면역력을 증가시키는 효과를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 저분자량의 γ-PGA는 고분자량의 γ-PGA에 비하여 항 바이러스 효과 또한 우수하다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 평균 분자량 150 내지 350 kDa을 갖는 γ-PGA를 제공한다. 상기 γ-PGA는 평균 분자량 150 내지 350 kDa, 200 내지 300 kDa, 200 내지 290 kDa, 200 내지 280 kDa, 200 내지 270 kDa, 또는 200 내지 250 kDa을 갖는 것일 수 있다. 상기 γ-PGA는 상술한 γ-PGA를 생산하는 방법에 의하여 생산된 것일 수 있다.

상기 γ-PGA는 대식세포의 니트릭옥시드(nitric oxide: NO) 생산량을 증가시키는 것일 수 있고, 염증-촉진성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 발현량을 증가시키는 것일 수 있으며, 면역증강 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 γ-PGA는 항 바이러스 효과를 가지는 것일 수 있고, 구체적으로, 인플루엔자 바이러스에 대한 항 바이러스 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양물, 건조물, 추출물, 또는 파쇄물을 이용한, 면역 증가 방법을 제공한다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양물, 건조물, 추출물, 또는 파쇄물을 투여하여, 바이러스 감염 질환에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 바이러스는 병원성 인플루엔자 바이러스 일 수 있으며, 예를 들면 조류 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양물, 건조물, 추출물, 또는 파쇄물은, 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1을 배양한 후 수득되는 배양물 (culture product)로부터 유래되는 다양한 제형의 산물을 의미한다. 이들은 균체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으나, 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1로부터 생산된 저분자량의 γ-PGA는 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양물, 건조물, 추출물, 또는 파쇄물을 제조하는 방법은, 전술된 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양 방법을 포함할 수 있으며, 건조방법, 추출방법 또는 파쇄방법은 해당 기술 분야에 알려진 방법들이 제한없이 이용될 수 있다.

상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1의 배양물, 건조물, 추출물, 또는 파쇄물을 투여하는 방법은, 구체적으로, 경구 투여 방법일 수 있다. 본 출원의 방법으로 생산된 저분자량의 γ-PGA는 면역 증가 효과 또는 항 바이러스 효과를 가지므로, 이를 투여하여 면역을 증가시키거나, 바이러스 감염 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.

일 양상에 따른 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1은 저분자량의 γ-PGA를 생산하는데 사용할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 균주를 이용한 γ-PGA를 생산하는 방법에 의하면, 저분자량의 γ-PGA를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 감마-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid: γ-PGA)의 생산과정을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. γ-PGA 생산 균주의 분리

장류 즉 메주 및 된장에서 Bacillus 균주를 분리하기 위하여, TSA (tryptic soy agar) 배지에 메주 및 된장의 각 희석액을 도말하여 균을 배양한 후 16s rRNA sequencing을 통하여 Bacillus 종(sp.) 균주 162 주를 선별하였다. 하기의 표 1은 162주 중에서 일부만을 기재하였다. 선별된 Bacillus 종 균주를 증류수 중 대두분 1(w/v)%, 모노소듐 글루타메이트(monosodium glutamate: MSG) 1(w/v)% 및 아가(agar) 1.5(w/v)%를 포함하는 고체 배지에 접종하였고, 37℃에서 12시간 배양하였다. 배양 후 형성되는 콜로니의 형태 및 점성을 육안 및 점도계로 평가하였고(표 1), 점도가 높은 11 종의 균주를 선발하였다.

메주 및 된장에서 분리한 바실러스 균주의 점도평가 결과

No.	Strain No.	동정 결과	점도평가 결과
1	854	Bacillus amyloliquefaciens strain MPA	+++
2	774	B. vallismortis	++
3	775	B. vallismortis	++
4	776	B. benzoevorans	-
5	778	B. nematotocita	+++
6	782	B. malacitensis	+++
7	791	B. sonorensis	-
8	792	B. licheniformis	-
9	793	B. subtilis subsp. subtilis	-
10	796	B. sonorensis	+
11	797	B. subtilis subsp. subtilis	-
12	798	B. subtilis subsp. subtilis	-
13	802	B. subtilis subsp. subtilis	-
14	803	B. subtilis subsp. subtilis	-
15	804	B. axarquiensis	+++
16	805	B. axarquiensis	+++
17	806	B. benzoevorans	-
18	807	B. subtilis subsp. subtilis	-
19	808	B. subtilis subsp. subtilis	+++
20	809	B. amyloliquefaciens	-
21	810	B. acidovorans	+++
22	812	B. subtilis subsp. subtilis	-
23	813	B. subtilis subsp. subtilis	-
24	814	B. licheniformis	-
25	815	B. nematotocita	-
26	817	B. vallismortis	-
27	820	B. subtilis subsp. subtilis	+
28	821	B. malacitensis	+
29	822	B. nematotocita	-
30	824	B. subtilis subsp. subtilis	-
31	825	B. subtilis subsp. subtilis	++
32	828	B. velezensis	+
33	833	B. subtilis subsp. subtilis	-
34	835	B. subtilis subsp. subtilis	-
35	836	B. velezensis	+++
36	842	B. velezensis	+++
37	845	B. velezensis	++
38	846	B. velezensis	-
39	847	B. sonorensis	+++
40	848	B. sonorensis	-
41	849	B. velezensis	+
42	850	B. licheniformis	-
43	851	B. sonorensis	-
44	852	B. sonorensis	+
45	853	B. sonorensis	-

다음으로, 선발된 11 종의 균주를 새로운 고체 배지에서 배양하여 γ-PGA 생산성이 높은 것을 선별하고자 하였다. 구체적으로, 대두박 99(w/v)% 및 MSG 1(w/v)%에 물을 첨가하여 수분을 43%로 조절하고 100℃에서 30분간 증자한 후 실온으로 냉각시켜 고체 배지를 제조하였다. GYP (glucose 1.0 g/L, yeast extract 0.8 g/L, 및 soy peptone 0.2 g/L) 배지에서 6시간 배양한 11 종의 균주 각각의 배양액을 상기 냉각된 고체 배지 상에 대두박 중량 대비 10(v/w)%의 양으로 각각 접종한 후, 37℃, 95% 습도의 항온항습 조건에서 16시간 배양하였다.

상기로부터 얻어진 배양물에서 γ-PGA를 분리하고자 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, 배양물에 4배의 증류수를 첨가하고 65℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 8,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액에 6 N HCl을 첨가하여 pH 3으로 조절한 후 4℃에서 12시간 이상 인큐베이션한 뒤 γ-PGA가 침전되도록 하였다. 산성화된 배양물 상등액을 다시 원심분리하여 침전시키고, 침전물을 회수하여 조 γ-PGA(crude γ-PGA)를 얻었다. γ-PGA 생산량은 조 γ-PGA의 무게를 재어 확인하였다.

그 결과, γ-PGA 생산성이 가장 높은 균주 1 종을 최종 선발하였다. 상기 최종 선발된 균주는 16S rRNA 유전자 증폭용 프라이머를 이용한 16s rRNA 전장 시퀀싱(full sequencing) 실시 결과, 서열번호 1의 16s rRNA 전장 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 이어서, 공지 균주와의 서열 상동성 비교 및 계통 분류학적 유연관계를 분석한 결과, Bacillus amyloliquefaciens strain MPA(주식회사 천랩, 대한민국)와 상동성 99.93%를 가지는 것으로 확인되었다. 상기 최종 선발된 균주를 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1로 명명하고, 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 5월 8일에 기탁번호 KCCM 12259P로 기탁하였다.

실시예 2. 신규 미생물 CJBA1을 이용한 γ-PGA 생산

선발된 γ-PGA 생산 균주 CJBA1를 하기와 같이 배양하여 γ-PGA를 분리하였다. 도 1은 γ-PGA의 생산과정을 나타낸 도면이다.

2-1. 전배양(pre-incubation) 및 종 배양

B. amyloliquefaciens CJBA1의 콜로니 7 내지 8 개를 GYP (glucose 1.0 g/L, yeast extract 0.8 g/L, 및 soy peptone 0.2 g/L) 배지 30 mL가 담긴 플라스크에서 37℃, 180 rpm에서 10 내지 12 시간 인큐베이션하여 전배양물을 얻었다. 전배양물을 동일 배지 30 mL가 담긴 플라스크에 1(v/v)%를 접종하여 동일 조건에서 6 시간 인큐베이션 하였다.

2-2. 본 배양 및 조 γ-PGA의 분리

본 배양을 위해 대두박 함유 고체 배지를 만들었다. 구체적으로, 대두박 250 g에 증류수 138.5 mL를 첨가하여 수분이 45%가 되도록 조절한 뒤 100℃에서 30분간 증자하였다. 상기 배지를 원형 배양 용기에 옮겨 실온에서 냉각한 후, 상기 2-1에서 준비한 종배양액을 고체 배지 내 대두박 중량의 10(v/w)%로 접종하였다.

대두박 내 수분 함량에 따른 γ-PGA 생산성 비교를 위하여, 대두박 250g에 증류수 220 mL를 첨가하여 수분이 55%인 배지를 조제한 후 100℃에서 30분간 증자하여, 상기 2-1에서 준비한 종배양액을 고체 배지 내 대두박 중량의 10(v/w)%로 접종하였다. 상기 고체 배지 접종물을 37℃ 및 95% 습도의 항온항습 조건에서 16, 20, 또는 24시간 동안 배양하였다.

이후, 배양물에 4 배의 증류수를 첨가하고 65℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액에 6 N HCl을 첨가하여 pH 3으로 조절한 후, 원심 분리하여 침전물을 회수함으로써 조 γ-PGA를 수득하였다.

2-3. γ-PGA의 순도 및 수율

조 γ-PGA의 순도 및 수율을 측정하기 위하여 HPLC (high-performance liquid chromatography)를 이용한 아미노산 분석법으로 글루탐산(glutamic acid) 함량을 측정하였다.

글루탐산 함량 측정을 위한 전처리 과정은 다음과 같다. 구체적으로, 시료를 칭량 접시에서 0.05 내지 0.1 g으로 정량한 후, 가수분해용 유리 시험관에 넣고 6 N HCl 10 mL을 첨가한 후, 질소가스 충진 후 밀봉 및 건조 오븐(dry oven)에서 110℃에서 22시간 반응시켰다. 산 가수분해가 끝난 후 실온에서 식히고 SpeedVac을 사용하여 감압 건조하여 농축하였다. 유리 시험관 내 반응액을 50 mL 콘형 튜브(conical tube)에 넣은 뒤, 증류수를 사용하여 유리 시험관 벽면에 묻은 액을 3회 세수 후 콘형 튜브 내 총량 20 mL로 조절하였다.

다음으로, 75℃에서 6시간 이상 농축한 다음 pH 2.2 희석 버퍼(dilution buffer) (소듐 시트레이트 11.8 g + 37% HCl 12 mL/1L 기준) 50 mL를 사용하여 정용여과(Diafiltration) 후 0.45 ㎛ 필터로 여과한 후, HPLC로 분석하였다.

분석에 사용된 컬럼 및 분석 조건은 다음과 같다:

칼럼- C18 Eclipse AAA,

이동상- A 용매:　10 mM Na₂HPO₄　이수화물(Dihydrate), 10 mM Na₂B₄O₇ 소듐 테트라보레이트 데카히드레이트, 0.5 mM NaN₃, B 용매: 아세토니트릴:MeOH:물=45:45:10, v:v:v,

온도- 35℃,

검출기- UV 338 nm,

주입 부피- 20 μL,

흐름 속도- 1.8 mL/min

표 2에서, 순도 및 수율은 하기 식에 의하여 계산하였다.

순도 = 글루탐산 함량(g)/조 PGA함량(g) X 100

수율 = 글루탐산 함량(g)/(배양물(g) X 고형분함량(%)) X 100

상기 2-2의 배양물로부터 얻어진 γ-PGA의 순도 및 수율 등 HPLC 분석 결과는 하기 표 2와 같다.

수분함량(%)	배양시간(h)	배양물(g)	수분(%)	고형분(%)	조PGA(g)	글루탐산 함량(g)	순도(%)	수율(%)
45	0	50	44.77	55.23	-	-	-	-
	16	50	35.26	64.74	4.51	1.37	30.3	4.25
	20	50	34.47	65.53	5.36	1.54	28.7	4.72
	24	50	31.85	68.15	5.2	1.59	30.6	4.69
55	0	50	54.36	45.64	-	-	-	-
	16	50	46.26	53.74	4.26	1.52	35.7	5.68
	20	50	44.67	55.33	4.54	1.68	37.0	6.11
	24	50	41.49	58.51	4.68	1.82	38.8	6.2

표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 균주를 고체 배양하여 생산된 γ-PGA의 순도는 28.7 내지 38.8%였으며, 수율은 4.25 내지 6.20%로 높은 생산성을 나타내었다.

2-4. γ-PGA의 분자량 측정

분자량은 하기 방법에 의하여 측정하였다. 구체적으로 조 γ-PGA의 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography: GPC)를 이용하여 분석하였다. 2-2에서 제조된 조 γ-PGA 10 mg을 0.1 M NaNO₃ 버퍼로 10 배 희석한 후, 5 M KOH를 5 μL 첨가하여 완전히 용해시켰다. 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 회수된 상등액을 0.22 ㎛ 마이크로 필터로 여과하여 GPC 분석장치에 주입하였다. 분석 컬럼 및 분석 조건은 다음과 같다:

칼럼- Tosoh TSKgel GMPWXL (100-1,000,000 Da 분석 가능), 이동상- 0.1 M NaNO₃, 온도- 30℃, 검출기- RID, 주입 부피- 20 μL, 흐름 속도- 0.5 mL/min.

표준 물질로는 분자량 805,000, 366,000, 210,000, 113,000, 48,800, 21,700, 10,000, 및 6,000 Da의 풀루란(pullulan; Sigma Aldrich, 미국)을 사용하였다.

고체 배양으로부터 얻어진 γ-PGA의 분자량은 표 3과 같다.

수분함량(%)	시간(h)	수분(%)	고형분(%)	조 γ-PGA (g/배양물 50g)	평균 분자량 (kDa)
45	0	44.77	55.23	-	-
	16	35.26	64.74	4.51	243.0
	24	31.85	68.15	5.2	238.2
55	0	54.36	45.64	-	-
	16	46.26	53.74	4.26	263.5
	24	41.49	58.51	4.68	244.1

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 출원의 균주를 이용하여 제조된 γ-PGA의 평균 분자량은 배양 시점의 수분 함량이 45%인 경우 238 내지 243 kDa, 수분이 55%인 경우 244 내지 264 kDa으로 나타났다. 또한, γ-PGA의 평균 분자량은 발효 시간이 16 시간인 경우 243 내지 264 kDa, 발효 시간이 24 시간인 경우 238 내지 244k Da으로 나타났다. 발효 시간이 증가함에 따라 γ-PGA의 분자량은 소폭 감소하는 경향을 보였으나, 본 출원의 균주를 이용한 방법에 의해 수분 및 발효 시간에 상관없이 저분자량의 γ-PGA가 생산됨을 확인하였다. 또한 공지된 PGA 발효 생산방법에 비해 현저히 짧은 발효 시간으로 효율적인 생산이 가능하며, 저분자량의 γ-PGA 생산이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. CJBA1에 의하여 생산된 저분자량 γ-PGA의 면역증강 효과

3-1. 저분자량 γ-PGA에 의한 니트릭옥시드(nitric oxide: NO) 생산능 확인

NO는 대식세포와 같은 면역세포에 의해 생성되어 각종 생리 및 병리적 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. B. amyloliquefaciens CJBA1에 의해 생산된 γ-PGA를 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 처리하여 NO 생성능을 확인하였다.

구체적으로, γ-PGA 시료를 준비하기 위하여, 발효 시간을 8 또는 16 시간으로 진행한 것을 제외하고 2-2에 기재된 것과 동일하게 고체 배양하고, 추출용매를 6N 황산, 99% 에탄올 또는 이의 조합을 사용하여 γ-PGA 추출을 진행하였다.

마우스 대식세포 RAW264.7 (American Type Culture Collection, Rockville, MD.)을 37℃ 및 5% CO₂/95% 습도 공기(air) 배양기에서 10 (v/v)% 열-불활성화된 소태아혈청(heat-inactivated fetal bovine serum: FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 0.2% NaHCO₃, 및 1 mM 소듐 피루베이트가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 중에서 배양하였다.

웰 당 1x0⁶의 세포 수로 24-웰 플레이트의 웰에 분주한 후, 2 시간 이상 배양하여 플레이트에 세포가 부착되도록 하였다. 그 후 0.25, 0.5, 및 1.0 mg/mL 농도의 γ-PGA 희석액 10 μL을 가하여 24 시간 배양하고, 배양 상층액 100 μL와 동일 부피의 Griess reagent (1% 술파닐아미드, 0.1% 나프틸에틸렌 디아민 디히드로클로리드, 및 2.5% 인산) (Sigma Aldrich)를 혼합한 후 실온에서 10 분간 방치하고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO 농도는 배양액으로 연속 희석한 NaNO₂ (Sigma Aldrich)로 제작한 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.

그 결과, 표 4와 같이 발효시간 및 추출 용매에 따른 6 종의 모든 시료 처리군에서 대식세포의 NO 생산능이 확인되었다. 특히 용매를 에탄올로 사용한 경우 발효시간이 길수록 NO 생산능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 황산 또는 황산+에탄올의 경우 농도(0.25 내지 1 mg/mL), 및 발효시간에 크게 상관없이 높은 NO 생산능을 확인할 수 있었다.

시료 번호	발효 시간(h)	추출 용매	γ-PGA 처리 농도 별 배양액 내 NO 농도(μM)
시료 번호	발효 시간(h)	추출 용매	0.25 mg/mL	0.5 mg/mL	1.0 mg/mL
1	8	황산	23.36	25.41	24.34
2	8	에탄올	11.41	18.24	22.99
3	8	황산+에탄올	20.73	23.12	22.25
4	16	황산	22.38	24.24	23.63
5	16	에탄올	19.12	25.99	29.19
6	16	황산+에탄올	21.54	23.29	22.48

3-2. 저농도의 저분자량 γ-PGA에 의한 NO 생산능 확인

3-1에서 상대적으로 효과가 뛰어난 3 종 즉, 표 4의 1, 4 및 6번의 시료를 이용하여 보다 더 낮은 농도에서도 높은 NO 생성 효과를 나타내는지 검증하고자 하였다.

구체적으로, 희석농도를 달리한 것 외에 3-1과 동일한 방법으로 시료를 준비하였다. 표 5는 저 농도 γ-PGA에 의한 NO 생산능에 대한 결과를 나타낸다.

시료 번호	발효 시간(h)	추출 용매	γ-PGA 처리 농도 별 배양액 내 NO 농도(μM)
시료 번호	발효 시간(h)	추출 용매	31.25 μg/mL	62.5 μg/mL	125 μg/mL
1	8	황산	13.43	17.06	18.75
4	16	황산	12.01	15.99	18.07
6	16	황산+에탄올	14.51	16.79	17.74

표 5에 나타낸 바와 같이, 본 출원의 CJBA1로부터 생산된 γ-PGA를 이용하는 경우, 농도를 125 μg/mL까지 낮추어도 NO 생산능이 최대 18.75 μM까지 유지되었으며, 31.25 μg/mL 내지 62.5 μg/mL까지 낮추어도 NO 생산능이 12 μM이상으로 유지되었다.

3-3. 저분자량 γ-PGA에 의한 면역 증강능 확인

표 4의 1번 및 6번 시료를 이용하여 대식세포의 염증-촉진성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 발현량을 측정하였다.

γ-PGA 시료 100 μg/mL가 처리된 RAW 264.7 세포주로부터 총 RNA를 얻고, cDNA를 합성한 뒤 염증-촉진성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 iNOS를 증폭시키기 위한 프라이머들 즉, 서열번호 2 및 3; 서열번호 4 및 5; 서열번호 6 및 7; 및 서열번호 8 및 9를 이용하여 각 사이토카인의 발현량 증가를 확인하였다.

염증-촉진성 사이토카인 발현량은 정량적 실시간(quantitative real-time) PCR을 이용하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 대한 상대적인 값으로 결과를 나타내었다.

그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 시료를 처리하지 않은 대조군에서 각 사이토카인 발현양을 1로 하였을 때, 실험에 사용한 모든 시료에서 염증-촉진성 사이토카인의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다.

시료 번호	염증-촉진성 사이토카인(시료 무처리군 대비 발현량, 배수)
시료 번호	TNF-α	IL-1β	IL-6	iNOS
대조군	1	1	1	1
1	15.67	39.54	3.97	4.69
6	20.25	53.86	7.22	6.56

실시예 4. CJBA1에 의하여 생산된 저분자량 γ-PGA의 항 바이러스 효과

고체 배양으로 생산된 저분자량 γ-PGA의 저 병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항-바이러스 효과를 말단점 희석 분석법(endpoint dilution assay)을 통하여 검증하였다. 고분자량의 γ-PGA의 항 바이러스 효과와 비교 하고자, 이를 대조군을 사용하였다(바이오리더스 社로부터 구매).

구체적으로, 표 4의 5번 시료를 농도 단계별로 희석한 후, 상기 생산된 희석액과 저 병원성 인플루엔자 바이러스(H1N1)를 동량으로 혼합한 후, 혼합액을 4℃에서 30 분간 인큐베이션시켰다. 반응 후 MEM 세포 배양용 배지를 이용하여 상기 반응물을 10^-1 ~ 10^-9 배로 희석하였다. 마르딘-다르비 개 신장 (Mardin-Darby canine kidney: MDCK) 세포(한국세포주은행, KCLB10034)가 단층을 형성하고 있는 96-웰 조직 배양 플레이트(well tissue culture plate)에 희석 배수당 8개 웰에 상기 희석액을 각각 접종하였다. 접종 후 37℃ 인큐베이터에서 4 내지 5일 동안 배양하며 매일 현미경으로 세포독성 효과(cytopathic effect: CPE) 형성 유무를 확인한 뒤, 조직배양 감염 용량(tissue culture infective dose) 50 (TCID₅₀)/mL로 나타내었다.

시료	농도(mg/mL)	바이러스 역가(TCID₅₀/25 μL)
대조군	-	10^4.8
B. amyloliquefaciens CJBA1 조 γ-PGA	50	10^3.2
	10	10^4.1
	5	10^4.3
	1	10^4.4
2,000 kDa 이상의 고 분자량 γ-PGA	50	10^4.5
	10	10^4.6
	5	10^4.6
	1	10^4.8

그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 저분자량 γ-PGA를 사용한 경우, 고분자량 γ-PGA와 비교하여 우수한 바이러스 감염 방지 효과를 나타낸다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터

KCCM12259P

20180508

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Bacillus amyloliquefaciens CJBA1 and method of producing gamma-polyglutamic acid using the same <130> PN128603KR <150> KR 1020180094629 <151> 2018-08-13 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus amyloliquefaciens CJBA1 16S rRNA <400> 1 acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 60 tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac 120 cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca 180 ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg 240 tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga 300 atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg 360 gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga 420 cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 480 ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga 540 tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga 600 agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 660 tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa 720 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt 780 tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa 840 gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900 cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga 960 cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg 1080 ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1140 catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa 1200 accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc 1260 gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1320 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgaga 1356 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 2 ccctcacact cagatcatct tct 23 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 3 gctacgacgt gggctacag 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 4 gcaactgttc ctgaactcaa ct 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 5 atcttttggg gtccgtcaac t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 6 cctctggtct tctggagtac c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 7 actccttctg tgactccagc 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 8 ttcacccagt tgtgcatcga ccta 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 9 tccatggtca cctccaacac aaga 24

Claims

수탁번호 KCCM 12259P로 기탁되고, 글루탐산을 포함하지 않는 고체 배지에서 평균 분자량이 150 내지 350 kDa인 저분자량의 감마-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid: γ-PGA)을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1.
제1항에 있어서, 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스는 수분 함량이 40 내지 60 (w/w)%인 고체 배지에서 평균 분자량이 150 내지 350 kDa인 저분자량의 γ-PGA을 생산하는 것인, 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1.
삭제
제1항에 있어서, 상기 저분자량의 γ-PGA의 평균 분자량은 200 내지 300 kDa인 것인 바실러스 아밀로리퀘페시언스 CJBA1.
수탁번호 KCCM 12259P로 기탁된, 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJBA1을 글루탐산을 포함하지 않는 고체 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 평균 분자량이 150 내지 350 kDa인 저분자량의 γ-PGA를 생산하는 방법.
제5항에 있어서, 배양하는 단계에서 얻어진 배양물로부터 γ-PGA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양은 고체 배지에서 수행되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양은 대두박을 포함하는 고체 배지에서 수행되는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양은 수분 함량이 40 내지 60 (w/w)%인 고체 배지에서 수행되는 것인, 것인 방법.
삭제
제5항에 있어서, 생산되는 상기 γ-PGA의 평균 분자량은 200 내지 300 kDa인 것인 방법.